定量核酸酶保护测定（qnpa）和测序（qnps）的改进的制作方法

定量核酸酶保护测定（qnpa）和测序（qnps）的改进的制作方法
【专利摘要】本公开内容提供了对定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法的改进。所公开的方法使用包括5′末端和/或3′末端侧翼序列的核酸酶保护探针（NPP），其提供了通用杂交和/或扩增序列。所公开的方法可用于对靶核酸分子进行测序或检测，例如存在于固定的或不可溶样品中的那些。
【专利说明】定量核酸酶保护测定(QNPA)和测序(QNPS)的改进
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年5月4日提交的美国临时申请N0.61/482，486、2011年9月21日提交的美国临时申请N0.61/537，492和2011年12月15日提交的美国临时申请N0.61/576，143的优先权，所述临时申请全部以引用的方式纳入本文。
【技术领域】
[0003]本公开内容提供了改进的定量核酸酶保护测定(qNPA)和定量核酸酶保护测序(qNPS)方法。所述方法可用于核酸靶的鉴定、检测和/或测序。
【背景技术】
[0004]虽然已知检测和测序核酸分子的方法，但是仍然需要可允许同时分析多个样品或多个序列的方法。多路复用(multiplexing)核酸分子检测或测序反应的方法还没有达到最需要的性能或简单水平。

【发明内容】

[0005]本发明提供了可极大地改进现有的定量核酸酶保护测定(qNPA)和定量核酸酶保护测序(qNPS)方法并且代表对当前的核酸检测和测序方法的改进的方法。这些方法可用于核酸分子靶的鉴定、检测和/或测序 。所述方法利用包括一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)。所述NPPF包括与靶核酸分子的全部或一部分互补的序列，因而允许所述靶核酸分子和所述NPPF之间的特异性结合或杂交。例如，NPPF中与靶核酸分子中一个区域互补的区域以高特异性与所述靶核酸分子中的该区域结合或杂交(在一些实例中还可与双功能接头的一个区域结合)。NPPF还包括在所述NPPF的5'末端和/或3'末端的一个或多个侧翼序列。因此，所述一个或多个侧翼序列位于与靶核酸分子互补的序列的Y、3/或同时5'和3'。如果所述NPPF在5'末端和3'末端都包括侧翼序列，那么在一些实例中每个NPPF的序列均是不同的并且是不互补的。所述侧翼序列包括具有未在所述样品中的核酸分子中发现的序列(例如至少12个核苷酸的序列)的若干个连续的核苷酸，并且提供通用的杂交和/或扩增序列。这种通用的杂交和/或扩增序列，当其具有与扩增引物的至少一部分互补的序列时，可允许进行多路复用，因为相同的扩增引物可用于扩增特异性针对不同靶核酸分子的NPPF。其还为所有NPPF提供了通用杂交序列，所述通用杂交序列可用于将可检测标记添加到NPPF上或者用于捕获并浓缩NPPF。例如，如果相同的侧翼序列存在于特异性针对不同靶核酸分子的NPPF上，那么相同的引物可用于扩增任何具有相同侧翼序列的NPPF，即便所述NPPF靶向不同的核酸分子。例如，所述侧翼序列可用于捕获NPPF，例如捕获到表面上。所述侧翼序列可以含有可变的序列，例如特异性针对每种具体NPPF的序列，并且所述序列可被用于将所述NPPF捕获到表面或用于其他目的，例如鉴定所述NPPF。因此，在一些实例中，所述公开的方法可用于使用多种NPPF检测样品中若干种不同的靶核酸分子或对其测序，其中每种NPPF特异性结合至一种特定的靶核酸分子。在一个实例中，所述公开的方法被用于同时检测或测序多个样品中的至少一种靶核酸分子。
[0006]本公开内容提供了用于检测或确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法。所述方法可以包括使所述样品(例如已经被加热以使样品中的核酸分子变性的样品)与至少一种NPPF在足以使得所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触。所述NPPF分子包括与所述靶核酸分子的全部或一部分互补的序列。这使得所述NPPF与所述靶核酸分子之间特异性结合或杂交。所述方法还包括使所述样品与一种或多种具有与侧翼序列的全部或一部分互补的序列的核酸分子(本文中这种分子被称为CFS)在足以使得所述侧翼序列与所述CFS特异性结合或杂交的条件下接触。多于一个的CFS可用于与整个侧翼序列杂交(例如，多个单独的CFS可与单个侧翼序列杂交，使得整个侧翼序列被覆盖)。这导致产生了已经结合(杂交)至所述靶核酸分子以及所述一个或多个CFS的NPPF分子，从而产生双链分子，所述双链分子可以包括至少四个连续的寡核苷酸序列，并且所有碱基都与互补的碱基杂交。
[0007]在使得所述靶核酸分子和所述一个或多个CFS结合至所述NPPF后，所述方法还可包括使所述样品与特异性针对单链(ss)核酸分子(或核酸分子的单链区域)的核酸酶在足以除去未与互补碱基杂交的核酸碱基的条件下接触。因此例如，未结合靶核酸分子或CFS的NPPF、以及未结合的靶核酸分子、样品中其他单链核酸分子和未结合的CFS会被降解。这产生了经消化的样品，其包括以与一个或多个CFS和靶核酸分子的双链加合物的形式存在的完整NPPF。在一些实例中，所述方法还包括提高所述样品中的pH和/或加热样品，想解离或除去结合至所述NPPF的靶核酸分子和CFS。
[0008]结合至所述靶核酸分子和CFS并因此可禁受所述核酸酶处理的NPPF，可被扩增和/或标记。可使用一种或多种扩增引物扩增所述经消化样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子。至少一种扩增引物包括与所述NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的区域。在一些实例中，所述NPPF包括在5'末端和3 '末端的侧翼序列，并且使用两种扩增引物，其中一种扩增引物具有与所述5,末端侧翼序列互补的区域，另一种扩增引物具有与所述3,末端侧翼序列互补的区域。
[0009]或者，不使用可禁受所述核酸酶处理的NPPF，而可以直接使用与所述NPPF杂交的靶核酸链(例如DNA链)，例如对其扩增、标记、检测、测序或其组合。例如，可使用一种或多种扩增引物扩增所述靶核酸链，从而产生可被检测和/或测序的靶扩增子。因此，虽然本文提到了 NPPF扩增子，但应该理解可以用靶扩增子代替NPPF扩增子。
[0010]然后可对所产生的扩增子(或其部分，例如3'部分)测序或检测。在一个实例中，扩增子被连接到基质。例如，所述基质可以包括至少一种捕获探针，所述探针具有与所述NPPF扩增子上侧翼序列的全部或一部分互补的序列，从而允许捕获具有所述互补侧翼序列的NPPF扩增子。或者，所述基质可以包括至少一种与双功能接头连接的锚，其中所述双功能接头包括特异性结合所述锚的第一部分和特异性结合所述NPPF扩增子之一的一部分的第二部分。然后可对所捕获的NPPF扩增子进行测序或检测，从而确定样品中至少一种靶核酸分子的序列或对其进行检测。
[0011]在其他实例中，可检测或测序所述NPPF扩增子，而不用将其捕获到阵列上。例如可以将所述NPPF扩增子转移到测序平台。
[0012]可以用可检测标记来标记所述NPPF，例如在扩增过程中，或作为不经扩增的步骤。或者，侧翼区域之一或两者可用于将可检测标记杂交至所述NPPF。
[0013]根据下文参考附图进行的详细描述，本公开内容中上述的以及其他的目标和特征
将变得更清楚。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1的示意图示出了示例性的具有侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF), 100。NPPF100包括区域102，其具有特异性结合靶核酸序列和双功能(或编程)接头的序列。所述NPPF还包括5'侧翼序列104和3'侧翼序列106。
[0015]图2的示意图示出了使用所公开的方法用NPPF202检测或测序核酸分子的方法的初始步骤。虚线条表示特异性针对第一靶的NPPF (在一些实例中用生物素(B)标记所述NPPF)，实心灰色条表示特异性针对第二靶的NPPF (在一些实例中用B标记所述NPPF)，点线绿色条表示与所述NPPF的侧翼序列互补的核酸分子(CFS) 204，实心黑色条表示靶核酸200 (例如DNA或RNA)。可以在扩增过程中通过使用生物素(或地高辛)标记的引物添加生物素。或者，可以用另一标记(例如荧光团)标记所述引物，产生被标记的NPPF。(1)将样品(例如细胞或FFPE组织)与样品破碎缓冲液(例如以使得可以裂解所述样品中的细胞和组织)接触并与所述NPPF和CFS孵育。(2)用特异性针对单链核酸分子的核酸酶(例如S1核酸酶)经消化未结合的(例如单链的)核酸。(3)可例如通过加入碱并加热来灭活所述核酸酶并将所述NPPF从结合的靶分子和结合的CFS解离。(4)例如通过使用PCR以适合的引物208，扩增剩余的NPPF。在一些实例中，引物208包括可检测标记，以允许标记所产生的扩增子210。可对所产生的扩增子210进行检测(图3)或测序(图4)。
[0016]图3的示意图示出了如何在阵列212上捕获NPPF扩增子210 (5)，所述阵列212包括与锚214连接的双功能接头216或包括核酸捕获分子220。所述双功能接头216包括与NPPF扩增子210的一个区域互补(例如与已经杂交至所述靶核酸的序列互补)的区域，以及与所述锚的一部分互补的区域。所述核酸捕获分子220包括与NPPF扩增子210的一个区域(例如其侧翼序列或一部分)互补的区域。(6)在一个实例中，亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)被用于检测结合的NPPF以及(7)在加入底物后对所述阵列成像。所述阵列上信号的位置使得可鉴定由靶核酸分子产生的信号。
[0017]图4的示意图示出了可对NPPF扩增子210测序(5)。
[0018]图5A-B的示意图示出了在使用所公开的方法以NPPF402检测或测序核酸分子的方法的步骤中，当处理核酸分子时对所述核酸分子的详细说明。长的实心彩色条表示靶核酸分子400，末端有浅色和深色的条为特异性针对靶的NPPF402，不同颜色的末端404表示侧翼序列。靶的颜色与其对应的NPPF的颜色匹配。短的实心彩色条表示与所述NPPF的侧翼序列互补的核酸分子(CFS) 406。
[0019]图6A-F的示意图示出了 NPPF分子的示例性实施方案，包括仅在NPPF的一个末端具有侧翼序列的实施方案(A和B)或者在NPPF的两个末端都具有侧翼序列的实施方案(C-F)。
[0020]图7的棒状图示出了对于七种独特的NPPF，各自检测到的扩增子的数量。误差棒表不平均值的一个标准差。
[0021]图8的棒状图比较了所观察到的7种独特NPPF各自的比例与基于加入到初始PCR反应的NPPF量的预期比例。
[0022]图9的棒状图和表比较了在没有扩增(正常)或有扩增(极端灵敏度，ES)时检测到的NPPF探针。每个实验进行三次重复。在捕获和测量前将PCR扩增的反应稀释。
[0023]图10的表示出了用于测序细胞系裂解物的输入物质、NPPF类型和实验标签。每个实验进行两次重复或三次重复。
[0024]图11的棒状图示出了来自使用THP1细胞裂解物的三次重复测序实验的四十六种NPPF的测序计数。误差棒表示平均值的1个标准差。
[0025]图12A和12B是来自滴定测序的NPPF测序计数的线图。该实验在输入范围以及所述qNPS计数方法的检测范围和检测极限中看起来是线性输出的。使用四种浓度的THP1细胞裂解物作为输入物质。(A)示出了具有最低计数的八种NPPF，(B)示出了具有最高计数的四种NPPF。该实验进行三次重复；该图示出了来自仅一次平行实验的结果。
[0026]图13是测量miRNA的NPPF测序计数的线图。使用三种浓度的Η印G2细胞裂解物作为输入物质。示出了五种代表性NPPF的计数。该实验进行三次重复；该图示出了来自仅一次平行实验的结果。
[0027]图14是使用一系列的PCR循环数和输入量扩增的NPPF的测序计数的棒状图。每个棒表示一个使用三个不同输入浓度之一和三个PCR循环数之一的qNPA实验。将所有的实验归一化使得读数的总数量被设置为是相等的，以帮助比较结果。[0028]图15A和15B的棒状图表示在被分开的，(A)与阵列杂交或者(B)被测序并计数的三次重复反应中的NPPF。算出三次重复反应的平均值，误差棒表示平均值的一个标准差。
[0029]序列表
[0030]本文列出的核酸序列是使用如37C.F.R.1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写表示。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是应认为通过任何对所示链的引用而将其互补链包括在内。在所提供的序列中:
[0031]SEQ ID NO: 1-16提供了可以用于所公开的方法的示例性的锚核酸序列。
[0032]SEQ ID NO: 17和18分别提供了可以用于NPPF的示例性的5'和3'侧翼序列。
[0033]SEQ ID NO: 19和20提供了示例性的PCR引物。
[0034]SEQ ID N021-44提供了含有在核苷酸25_30处存在的条形码序列的示例性引物。
【具体实施方式】
[0035]1.综述
[0036]本公开内容提供了改进的检测或测序靶核酸分子的方法，所述方法允许进行多路复用。本公开内容的方法相对于当前可用的测序和检测方法提供了若干改进。例如，因为所述方法需要对靶核酸分子作的处理较少，所以可降低或消除由这种处理引入的偏倚(bias)。例如，在当前方法中，例如当所述靶为RNA时，方法通常使用多个步骤以从样品中分离或提取所述RNA，对其进行RT-PCR，连接所述RNA，或使用这些步骤的结合。在所公开的方法中，不需要这种步骤。因此，所述方法使得人们能够分析一系列本来不能进行检测测序的样品类型。另外，这导致来自所述样品的RNA的损失更少，提供更精确的结果。其还减少了酶偏倚。本公开内容的方法还提供了对目标核酸分子的靶向检测和测序。这极大地简化了数据分析。当前的全基因组测序方法遇到的挑战是所产生大量数据且需要复杂的生物信息学。虽然已经降低了测序费用，但是确定序列的能力超过了研究者储存、传输和分析数据的能力。因此，通常所产生数据多于在合理时间量内可以分析的数据量。因为本公开内容的方法是靶向的，所以它可以克服这些障碍。例如，所产生的数据量得到了简化，因为仅靶的一部分需要被检测或测序。不需要核苷酸的长读出序列(read)，也不需要将序列片段与参考序列适当地比对。另外，所得结果可被简单地计数，而不需要进行复杂的生物信息学分析。
[0037]例如，所述方法可用于检测DNA或RNA，突变(例如基因融合、插入或缺失)，串联重复，单核苷酸多态性(SNP)和DNA甲基化。所述方法使用探针，其在本文中被称为包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)。使用NPPF可使得可以进行多路复用，并保留被检测或测序的靶核酸分子的化学计量，因为所述探针上的侧翼序列允许存在用于扩增的通用引物结合位点并且允许加入测序衔接头和实验标签(在:V末端或Y末端，或者在两个末端，例如用以增强多路复用)，而不破坏所述化学计量。因为所述侧翼位点可以是通用的，所以相同的引物可用于扩增针对任何靶序列的任何NPPF，从而允许多路复用并保留化学计量。在一个实例中，通过从所述NPPF的两个末端扩增，本公开内容的方法提供了比现有qNPA和qNPS方法更高的特异性。仅具有完整3'和5'侧翼序列的NPPF会被以指数方式扩增，而被核酸酶切割的NPPF不会被充分地扩增至足以被测序到或检测到。 [0038]另外，所述引物允许添加标签(例如添加实验标签以允许鉴定靶而不需要对整个NPPF本身测序，或者允许将来自不同患者的样品合并到单次运行中，所述实验标签在3'或5'末端或在两个末端以例如用以增强多路复用实验；以及添加测序衔接头使得可连接特定测序平台需要的序列并可形成用于某些测序平台的克隆)。使用NPPF还简化了被分析(例如被测序)的样品的复杂度，因为其将含有例如全基因的样品简化为所述NPPFs(或NPPF或靶扩增子)。与其他测序方法所需的数据分析相比，NPPF (或与所述NPPF杂交的靶)的测序简化了数据分析，将算法简化为简单地计数与加入到样品中的NPPF的匹配，而不是必须使序列与基因组匹配并使获自标准测序方法的多个序列/基因去卷积(deconvolute)。在一些实例中，与现有qNPA和qNPS方法相比，所公开的方法增强了获得的信号，例如增强至少10倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍或至少200倍，而不用在进行扩增前大量稀释NPPF产物。
[0039]在一个实例中，本公开内容提供了用于检测样品中至少一种靶核酸分子(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100种靶核酸分子)或确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法。在一些实例中，加热所述样品以使所述样品中的核酸分子变性，例如用以允许随后所述NPPF和所述样品中靶核酸分子之间的杂交。在一些实例中，所述样品为裂解的样品。在一些实例中，所述样品为固定的样品(例如石蜡包埋的福尔马林固定(FFPE)的样品、苏木精-伊红染色的组织或戊二醛固定的组织)。例如，所述靶核酸分子可以是被固定的、交联的或是不可溶的。
[0040]所述方法可以包括使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触。在一些实例中，所公开的方法同时测序或检测多个样品中的至少一种靶核酸分子。在一些实例中，所公开的方法测序或检测样品中的两种或更多种靶核酸分子(例如同时)。在一个这样的实例中，使所述样品与多种NPPF接触，其中每种NPPF特异性结合至特定的靶核酸分子。例如，如果有10种靶核酸分子，那么可使所述样品与10种不同的NPPF接触，所述NPPF各自特异性针对所述10种靶之一。在一些实例中，将至少10种不同的NPPF与所述样品孵育。但是，应该理解在一些实例中，可以使用多于一种的(例如2、3、4、5、10、20或更多种)特异性针对单个靶核酸分子的NPPF，例如特异性针对所述靶的不同区域的NPPF群，或可以结合所述靶及其变体(例如具有突变或多态性的那些)的NPPF群。
[0041] 所述NPPF分子包括5'末端和3'末端，以及两者之间与所述靶核酸分子的全部或一部分互补的序列。这使得所述NPPF与所述靶核酸分子特异性结合或杂交。例如，与所述靶核酸分子中一个区域互补的NPPF区域以高特异性结合或杂交至所述靶核酸分子中的该区域。所述NPPF可以与所述靶核酸序列的全部或一部分互补。所述NPPF分子还包括在所述NPPF的Y末端和/或:V末端的一个或多个侧翼序列。因此，所述一个或多个侧翼序列位于与靶核酸分子互补的序列的5'、3'或5'和3'。每个侧翼序列包括若干连续核苷酸，产生未在存在于样品中的核酸分子中发现的序列(例如具有至少12个连续核苷酸的序列)。如果所述NPPF在5'末端和3'末端都包括侧翼序列，那么在一些实例中各NPPF的序列是不同的并且相互不互补。
[0042]所述一个或多个侧翼序列提供与扩增引物的至少一部分互补的通用杂交/扩增序列。在一些实例中，所述侧翼序列可以包括(或允许添加)实验标签、测序衔接头或其组合。例如，所述实验标签可以是与捕获探针互补的序列，所述捕获探针能够捕获NPPF，例如捕获到表面上(例如在所述表面的特异性点上，或捕获到特异性的微珠上)。在一些实例中，所述实验标签可以是可鉴定NPPF的序列，例如特异性针对特定的患者或靶序列的标签，例如用以使得人们能够区分这些加标签的NPPF或对其分组。在一些实例中，所述测序衔接头是使得NPPF扩增子能够用于特定的测序平台的序列。
[0043]所述NPPF可以是任何核酸分子(例如DNA或RNA分子)并可以包括非天然碱基。在一些实例中，所述NPPF为至少35个核苷酸，例如40-80或50-150个核苷酸。NPPF中与所述靶核酸分子中一个区域互补的部分的长度可以是至少6个核苷酸，例如长度是至少10、至少25或至少60，例如至少6-60个核苷酸。所述NPPF的一个或多个侧翼序列的长度可以是至少6个核苷酸、至少12个核苷酸或至少25个核苷酸，例如12-50个核苷酸。在一些实例中，所述NPPF包括两个侧翼序列:一个在Y末端，另一个在:V末端。在一些实例中，在Y末端的侧翼序列与在Υ末端的侧翼序列不同。另外，如果所述NPPF包括两个侧翼序列，那么理想的是这两个侧翼序列具有相似的解链温度(Tm)，例如+/_5°C的Tm。
[0044]所述方法还包括使所述样品与具有同侧翼序列互补的序列的核酸分子(本文中这种分子被称为CFS)在足以使得所述侧翼序列特异性结合或杂交至所述CFS的条件下接触。本领域技术人员应该理解，不是使用单个CFS保护侧翼序列，而是可以使用多个CFS保护侧翼序列。这导致产生了已经结合至所述靶核酸分子以及所述CFS的NPPF分子，从而产生双链分子，所述双链分子包括至少三个连续的寡核苷酸序列并且所有碱基与互补碱基杂交，其中所述NPPF和CFS的碱基可以包括非天然碱基。所述CFS与其对应的侧翼序列杂交，从而保护所述侧翼序列在后续步骤中免于被核酸酶经消化。在一些实例中，每种CFS的长度恰好是其对应的侧翼序列的长度。在一些实例中，所述CFS与其对应的侧翼序列完全互补。但是本领域技术人员应该理解，保护Y末端侧翼序列的CFS的:V末端或保护:V末端侧翼序列的CFS的5'末端可以具有差异，例如在这些位置中每一个位置上的一个核苷酸。[0045]在使得所述靶核酸分子以及一个或多个CFS结合至所述NPPF后，所述方法还可包括使所述样品与特异性针对单链(ss)核酸分子或核酸分子的单链区域的核酸酶(例如S1核酸酶)在足以除去未与互补碱基杂交的核酸碱基的条件下接触。因此例如，没有结合的靶核酸分子或CFS的NPPF、以及未结合的靶核酸分子、样品中的其他单链核酸分子和未结合的CFS均会被降解。这产生了经消化的样品，其包括以与CFS和靶核酸杂交的双链加合物形式存在的完整NPPF。在一些实例中，例如如果所述NPPF由DNA组成，那么所述核酸酶可以包括外切核酸酶、内切核酸酶或其组合。
[0046]在一些实例中，所述方法还包括提高所述样品的pH和/或加热所述样品，例如用以使所述核酸酶失活，以移除结合到所述NPPF的靶核酸分子和CFS，或包括这些的结合。在一些实例中，所述方法包括从所述NPPF释放靶核酸(例如DNA)，然后进一步分析所释放的靶(例如检测或 测序所述靶)。在一些实例中所述靶核酸为DNA，扩增所述DNA然后对其进行检测或测序。
[0047]结合至所述靶核酸分子和CFS并因此禁受住所述核酸酶处理的NPPF可被扩增，例如使用PCR扩增。可使用一种或多种扩增引物扩增所述经消化样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子。至少一种扩增引物包括与NPPF侧翼序列互补的区域。在一些实例中，所述NPPF在5'末端和3'末端包括侧翼序列，并且使用两种扩增引物，其中一种扩增引物具有与所述Y末端侧翼序列互补的区域，另一种扩增引物具有与所述:V末端侧翼序列互补的区域。所述扩增引物的一种或两种可以包括允许在扩增过程中将实验标签或测序衔接头连接到所述NPPF扩增子的序列，并且一种或两种引物可以被标记以使得能够标记所述NPPF扩增子。在一些实例中，添加实验标签和测序衔接头，例如在所述NPPF扩增子的两端。例如，使用这种引物可以产生从所述NPPF扩增子的5'末端或3'末端或者从3'末端和5/末端两个末端延伸的实验标签或序列标签，以尽可能地增加多路复用的程度。所述实验标签可以包括独特的核酸序列，所述独特的核酸序列使得能够鉴定样品、受试者或靶核酸序列。在一些实例中，所述扩增引物含有使得能够将所述NPPF扩增子捕获到基质上(例如通过与所述基质上的探针杂交，所述探针具有与所述NPPF扩增子上的捕获序列互补的序列)的实验标签。所述测序衔接头可以包括核酸序列，所述核酸序列使得能够将所产生的NPPF捕获到测序平台上。例如，所述扩增引物可以包括这样的序列，即所述序列使得能够连接聚腺苷酸(poly-A)或聚胸苷酸(poly T)序列标签，所述聚腺苷酸或聚胸苷酸序列标签一旦被捕获到测序芯片上可以帮助扩增。在一些实例中，使用所述扩增引物标记所述NPPF扩增子。在其他实例中，使用一个或两个侧翼区域以使可检测标记与所述NPPF杂交，例如以经标记的探针(例如不进行扩增)。
[0048]然后可对所产生的NPPF (或靶)扩增子(或其部分，例如3'部分)进行测序或检测，从而确定所述样品中至少一种靶核酸分子的序列或检测所述样品中至少一种靶核酸分子。
[0049]在一个实例中，对所述NPPF扩增子(或其部分)进行测序。可以使用任何方法测序所述NPPF扩增子，并且本公开内容不限于特定的测序方法。在一些实例中，所使用的测序方法为Solexa?测序、454?测序、链终止测序、染料终止测序或焦磷酸测序。在一些实例中，使用单分子测序。在其中对所述nppf扩增子进行测序的一些实例中，所述方法还包括将所获得的NPPF序列与参考序列数据库比较；并确定每种鉴定的NPPF序列的数量。[0050]在一些实例中，检测所述NPPF扩增子。在这样的实例中，所述方法可以包括使所述NPPF扩增子与表面(例如具有多个空间上不连续的区域的表面)接触。在一个实例中，所述NPPF扩增子被所述表面上的一种或多种核酸捕获分子捕获，其中所述表面上核酸捕获分子的序列与所述NPPF扩增子的侧翼序列的至少一部分互补。这种互补性允许所述NPPF扩增子与所述表面上的捕获分子杂交和结合。可将这种捕获分子直接缀合到所述表面。将所述NPPF扩增子与所述表面在足以使得所述NPPF扩增子特异性结合到所述表面上的捕获分子的条件下孵育或接触。在一些实例中，将所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包括表面亚群(例如微珠群)，并且其中每个表面亚群包含至少一种与所述NPPF扩增子上侧翼序列的至少一部分互补的核酸捕获分子。因此，这使得能够捕获所有NPPF，所述NPPF具有与所述表面上的捕获分子互补的序列，而不用管所述NPPF靶向的序列。然后可以检测结合的NPPF扩增子。在一些实例中，该步骤用于(例如从含有引物的混合物中)纯化或浓缩NPPF扩增子，随后可将所述NPPF扩增子从所述表面释放，例如通过逆转杂交(例如通过提高温度以熔脱所捕获的NPPF或通过改变pH和温度)，并分析NPPF扩增子。
[0051]在另一个实例中，通过使用锚和双功能接头将所述NPPF扩增子捕获到表面上。所`述表面可以包括多个区域，每个区域包括至少一种与双功能接头连接的锚。所述双功能接头包括特异性结合到所述锚的第一部分以及特异性结合或杂交到所述NPPF扩增子之一的至少一部分的第二部分。将所述NPPF扩增子与所述表面在足以使得所述NPPF扩增子特异性结合到所述双功能接头的第二部分的条件下孵育或接触。在一些实例中，将所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包括表面亚群(例如微珠群)，其中每个表面亚群包含至少一种与双功能接头连接的锚。然后可以检测结合的NPPF扩增子。
[0052]另外，所述NPPF扩增子可以包括可检测标记，从而允许对其进行检测。在一些实例中，在扩增过程中引入这种标记。在具体实例中，所述可检测标记为半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。例如，存在于NPPF扩增子上的生物素可以通过以下方式来检测:使所述NPPF扩增子与缀合有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素(avidin)或链霉亲和素(streptavidin)接触。
[0053]I1.术语
[0054]除非另有说明，根据惯常用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以见于 Benjamin Lewin, Genes VII,由 Oxford University Press 出版，2000 (ISBN019879276X) ；Kendrew et al.(eds.), The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Publishers 出版，1994(ISBN0632021829) ;RobertA.Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference,由 Wiley, John&Sons, Inc.出版，1995(ISBN0471186341)；和 GeorgeP.Redei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2nd Edition, 2003(ISBN:0-471-26821-6)。
[0055]提供对术语和方法的如下解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。除非上下文另有明确说明，单数形式的“一”、“一个”以及“所述”是指一个或多于一个。例如术语“包含一个细胞”包括单个或多个细胞，其应被理解为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文另有明确说明，术语“或”是指所述的可选要素中的单个要素或者两个或更多个要素的组合。本文使用的“包含”意即“包括”。因此“包含A或B”意即“包括A、B或A和B”，但没有排除另外的要素。
[0056]为了便于评阅本公开内容的多个实施方案，提供了如下对具体术语的解释:
[0057]3’末端:核酸分子的末端，其末端残基的3’没有结合核苷酸。
[0058]5’末端:核酸序列的末端,其末端残基的5’位置结合核苷酸。
[0059]扩增核酸分子:为了增加核酸分子例如NPPF或其部分的拷贝数量。所产生的产物称为扩增产物或扩增子。体外扩增的实例为聚合酶链式反应(PCR)，其中将样品(例如含有NPPF的样品)与一对寡核苷酸引物在使得所述引物与所述样品中的核酸分子杂交的条件下接触。所述引物在适合条件下延伸，从模板解离，然后重新退火，延伸以及解离以扩大所述核酸分子的拷贝数量。
[0060](核酸的)结合或稳定结合:如果足够数量的第一核酸分子(例如NPPF)与另外的核酸分子(例如靶核酸分子)形成碱基对或杂交，那么所述第一核酸分子与所述另外的核酸分子结合或稳定结合，例如NPPF与其互补靶核酸序列的结合。
[0061]结合可以通过物理或功能性质来检测。核酸分子之间的结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法来检测，`包括功能(例如表达和/或活性的降低)和物理结合测定。
[0062]互补的:核酸之间形成碱基对的能力。寡核苷酸和其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交，所述氢键结合包括Watson-Crick氢键、Hoogsteen氢键或反向Hoogsteen氢键。通常，核酸分子包含含氮碱基，所述含氮碱基为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A与T或U氢键合，G与C键合。“互补的”是指发生在不同核酸或同一核酸的两个不同区域之间的碱基配对。
[0063]术语“特异性杂交的”和“特异性互补的”是这样的术语，即指足够的互补性程度以使得探针(例如NPPF)或其类似物与核酸靶(例如DNA或RNA靶)之间发生稳定且特异性的结合。所述探针或类似物不需要与其靶序列100%互补才能发生特异性杂交。当在需要特异性结合的条件下例如在本文公开的方法中，存在足够的互补性程度以避免探针或类似物与非靶序列非特异性结合时，所述探针或类似物是可特异性杂交的。
[0064]足以…的条件:任何容许所需要的活性，例如允许两个核酸分子(例如NPPF和靶核酸、NPPF和CFS或NPPF和双功能接头)特异性结合或杂交，或允许核酸酶除去(或消化)未结合的核酸的环境。
[0065]接触:置于直接的物理连接中；包括固体和液体形式。例如在体外在溶液中核酸探针(例如NPPF)和生物样品可以发生接触。
[0066]检测:为了确定因子(例如信号、具体核苷酸、氨基酸、核酸分子和/或生物体)是否存在。在一些实例中，这还可包括定量。例如，使用所公开的方法使得能够检测样品中的革巴核酸分子。
[0067]可检测标记:直接或间接缀合到另外的分子(例如核酸分子，例如NPPF或扩增引物/探针)以帮助检测该分子的化合物或组合物。标记的具体、非限制性实例包括荧光和产生荧光的部分、生色部分、半抗原、亲和标签和放射性同位素。所述标记可以是可直接检测的(例如可光学检测的)或是可间接检测的(例如通过与一种或多种另外的可检测的分子相互作用)。在本文公开的探针的上下文中的示例性标记在下文中描述。用于标记核酸的方法以及选择用于多种目的的标记的指导记载于，例如Sambrook and Russell, in MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)和 Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublishingAssociates and Wiley-1ntersciences (1987,包括更新)。
[0068]杂交:互补的单链DNA、RNA或DNA/RNA杂交以形成双链分子(还称为杂交复合物)的能力。核酸杂交技术可以用于在核酸探针和其被设计靶向的基因之间形成杂交复合物。
[0069]术语“特异性杂交的”和“特异性互补的”是指足够的互补性程度，使得在第一核酸分子(或其类似物)与第二核酸分子(例如核酸靶，例如DNA或RNA靶)之间发生稳定且特异性结合。所述第一和第二核酸分子不需要100%互补才能发生特异性杂交。本文中特异性杂交还称为“特异性结合”。
[0070]导致特定严格性程度的杂交条件将依赖于杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(例如Na+浓度)将决定杂交的严格性。关于为获得特定的严格性程度而使用的杂交条件的计算记载于Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning,second edition, Cold Spring HarborLaboratory, Plainview, NY(第 9 和 11 章)。
[0071]核酸酶:切割磷酸二酯键的酶。内切核酸酶是切割核苷酸链中内部磷酸二酯键的酶(与之相反，外切核酸酶切割核苷酸链末端的磷酸二酯键)。内切核酸酶包括限制性内切核酸酶或其他位点特异性的内切核酸酶(其在序列特异性位点切割DNA)、DNA酶1、Bal31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶Tl、RNA酶1、RNA酶PhyM、RNA酶U2、RNA酶CLB、微球菌核酸酶以及无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶。外切核酸酶包括外切核酸酶III和外切核酸酶VII。在 具体实例中，核酸酶是特异性针对单链核酸，例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A或核糖核酸酶T1。
[0072]核酸:单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物。术语“核苷酸”包括但不限于单体，所述单体包括连接糖(例如核糖、脱氧核糖或其合成的类似物)的碱基(例如嘧唆、嘌呤或其合成的类似物)或者如在肽核酸(PNA)中连接氨基酸的碱基。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。
[0073]靶核酸(例如靶DNA或RNA)是意欲确定其检测、量或序列(例如以定量或定性方式)的核酸分子。在一个实例中，所述靶为核酸分子(例如目的DNA或RNA)的限定区域或特定部分。在其中所述靶核酸序列为靶DNA或靶RNA的实例中，这样的靶可以通过其特定序列或功能定义；通过其基因或蛋白质名称定义；或者通过任何其他可唯一地将其从其他核酸中识别出来的方式来定义。
[0074]在一些实例中，靶核酸序列(例如DNA或RNA)的改变与疾病或病症“相关”。也就是说，对所述靶核酸序列的检测可用于推断与疾病或病症有关的样品的状态。例如，所述靶核酸序列可以以两种(或更多种)可区分的形式存在，使得第一形式与没有疾病或病症相关，第二(或不同的)形式与存在疾病或病症相关。所述两种不同形式可以是可定性区分的，例如通过核苷酸多态性或突变，并且/或者所述两种不同形式可以是可定量区分的，例如通过样品中存在的靶核酸序列的拷贝数量。
[0075]核苷酸:核酸分子的基本单位。核苷酸包括连接到戊糖单糖的含氮碱基以及通过酯键连接到所述糖部分的一个、两个或三个磷酸基团。[0076]DNA的主要核苷酸为脱氧腺苷5’ -三磷酸(dATP或A)、脱氧鸟苷5’ -三磷酸(dGTP或G)、脱氧胞苷5’ -三磷酸(dCTP或C)和脱氧胸苷5’ -三磷酸(dTTP或T)。RNA的主要核苷酸为腺苷5’ -三磷酸(ATP或A)、鸟苷5’ -三磷酸(GTP或G)、胞苷5’ -三磷酸(CTP或C)和尿苷5’ -三磷酸(UTP或U)。
[0077]核苷酸包括含有修饰的碱基、修饰的糖部分和修饰的磷酸酯骨架的那些核苷酸，例如如Nazarenko等人的美国专利N0.5，866，336 (其以引用的方式纳入本文)中所述。包括含有其他修饰的核苷酸，例如在锁核酸中发现的核苷酸。因此，本文公开的NPPF、引物、CFS、双功能接头和锚可以包括天然和非天然碱基。
[0078]可用于在核苷酸结构上任意位置修饰核苷酸的修饰的碱基部分的实例包括但不限于:5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、乙酰胞嘧啶、5_(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧唳、β -D-半乳糖基Q核苷(β -D-galactosylqueosine)、肌苷、Ν~6-异戍烯基腺嘌呤(Ν~6-sopentenyladenine)、1-甲基鸟嘌呤、1_甲基肌苷、2，2_ 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、
2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿喃卩定、甲氧基氨甲基-2-硫尿B密卩定、β -D-甘露糖基Q核苷(β -D-mannosylqueosine)、5’ -甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine )、2_硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-S-羟乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、
3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
[0079]可用于在核苷酸 结构上任意位置修饰核苷酸的修饰的糖部分的实例包括但不限于:阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖，或所述磷酸酯骨架的修饰的组分，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯或甲缩醛(formacetal)或其类似物。
[0080]引物.短的核酸分子，例如长度为9个核苷酸或更多个核苷酸的DNA寡核苷酸，其在一些实例中被用于起始更长核酸序列的合成。更长的引物的长度可以是约10、12、15、20、25、30或50个核苷酸或更多个核苷酸。引物可以通过核酸杂交被退火结合至互补的核酸链以在所述引物和所述互补链之间形成杂交体(hybrid)，然后所述引物通过聚合酶沿着所述互补链延伸。引物对可以用于扩增核酸序列，例如通过PCR或其他核酸扩增方法。
[0081 ] 在一个实例中，引物包含标记，其可被称为探针。
[0082]探针:能够与靶核酸分子(例如靶DNA或RNA)杂交并且在杂交到所述靶时能够被直接或间接检测的核酸分子。因此，探针使得能够检测并在一些实例中定量靶核酸分子例如DNA或RNA。在一些实例中，探针包括可检测标记。
[0083]核酸酶保护探针(NPP):具有与靶DNA或RNA互补且能够与所述靶DNA或RNA杂交的序列的核酸分子。所述NPP保护互补的靶DNA或RNA核酸分子免于被核酸酶(例如特异性针对单链核酸的核酸酶)切割。包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)是在5'末端、
末端或Y末端和Y末端进一步包括一个或多个侧翼序列的NPP，其中所述侧翼序列包括未在存在于所述样品中的核酸分子中发现的连续核苷酸序列，并且其可以提供可用作扩增引物连接位点的通用扩增序列位点。在一个实例中，所述侧翼序列被用于将所述NPPF捕获到基质上，其中所述基质上的核酸捕获序列和所述侧翼序列的至少一部分是彼此互补的，从而使得能够将所述NPPF捕获到所述基质上。
[0084]样品:从受试者(例如人或其他哺乳动物受试者)获得的含有DNA (例如基因组DNA或cDNA)、RNA(包括mRNA或miRNA)、蛋白质或其组合的生物样本。实例包括但不限于细胞、细胞裂解物、染色体制品、外周血或其级分、尿、唾液、组织活体检查(例如肿瘤活体检查或淋巴结活体检查)、手术样本、骨髓、羊膜穿刺样品、细针抽出物、循环肿瘤细胞和尸检材料。在一个实例中，样品包括RNA或DNA。在具体实例中，样品被直接使用(例如新鲜的或冷冻的)，或可以在使用前例如通过固定(例如使用福尔马林)和/或包埋到石蜡中(例如FFPE组织样品)进行处理。
[0085]序列同一性/相似性:两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性被表示为所述序列之间的同一性或相似性。序列同一性可以以同一性百分数的方式测量；所述百分数越高，序列就越相同。 [0086]比对用于比较的序列的方法是本领域中熟知的。多种程序和比对算法记载于:Smith&Waterman, Adv.Appl.Math.2: 482, 1981 ；Needleman&ffunsch, J.Mol.Biol.48:443, 1970 ；Pearson&Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444, 1988 ；Higgins&Sharp, Gene, 73:237-44，1988 ；Higgins&Sharp, Comput.Appl.Biosc1.5:151-3，1989 ；Corpet et al.,Nucl.Acids Res.16:10881-90, 1988 ；Huang et al.Comput.Appl.Biosc1.8，155-65，1992和Pearson et al.，Meth.Mol.Bi0.24:307-31，1994。Altschul etal., J.Mol.Biol.215:403-10, 1990，提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项。
[0087]NCBI 基本局部比对搜索工具(BLAST) (Altschul et al., J.Mol.Biol.215:403-10, 1990)可从若干来源获得，包括美国国家生物信息中心(NationalCenter for Biological Information, NCBI, National Library of Medicine, Building38A, Room8N805, Bethesda, MD20894)和因特网，其用于与序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。Blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。另外的信息可在NCBI网站找到。
[0088]比对后，匹配的数量是通过计数在两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定。序列同一性百分数是通过将匹配的数量除以所鉴定序列中示出的序列的长度，或者除以联接的长度(articulated length)(例如来自所鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得到的值乘以100来确定。
[0089]两个核酸分子密切相关的一个指示是所述两个分子在严格条件下互相杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境参数下不同。本文公开的核酸探针不限于所示出的确切序列，因为本领域技术人员会理解，可以改变序列而不实质上影响探针发挥所需作用的能力。例如，本文提供了与所公开的探针具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，例如100%序列同一性的序列(例如SEQ ID NO: 1-16)。本领域技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；可使用的探针可能在这些范围之外。
[0090]测序:是为了确定无支链的生物聚合物的一级结构(或一级序列)。测序产生了被称为序列的用符号表示的线性描绘，其简明地概述被测序分子(例如多核苷酸)的多数原子水平结构。当所述分子为多核苷酸例如RNA或DNA时，测序可用于获得所述分子在核苷酸水平上的信息，然后其可用于解密所述分子本身和/或其编码的多肽的多种二次信息。DNA测序是确定给定DNA分子的核苷酸顺序的过程，RNA测序是确定给定RNA分子的核苷酸顺序的过程。在一些实例中，核酸分子的测序是例如通过确定含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)的至少一部分序列而间接完成的，所述核酸酶保护探针结合所述靶核酸分子。
[0091]同时:同时或基本上同时发生和/或在同一样品或在同一反应中发生(例如同时的)。在一些实例中，所述事件在另一事件的1微秒至120秒内(例如在0.5-120秒内，在
1-60秒内，或在1-30秒内，或在1-10秒内)发生。
[0092]受试者:任何多细胞脊椎生物，例如人和非人哺乳动物(例如兽医的受试者)。在一个实例中，已知或怀疑受试者具有肿瘤或感染。
[0093]表面(或基质):不可溶的或可以通过随后的反应使其不可溶的任何固体支持物或材料。众多不同的固体支持物是本领域技术人员已知的，包括但不限于硝酸纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯微珠、磁珠、膜和微粒(例如胶乳颗粒)。该术语涵盖任何适合的多孔材料，所述材料具有足够孔隙度以允许检测器试剂接触并具有适合的表面亲和力以固定捕获试剂(例如寡核苷酸)。例如，硝酸纤维素的多孔结构对很多种试剂(例如捕获试剂)而言具有极佳的吸收和吸附性质。尼龙拥有类似特性，也是适合的。可以使用微孔结构，以及在水合状态下具有凝胶结构的材料。
[0094]可用的固体支持物的另外实例包括天然聚合的碳水化合物及其合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯，特别是与硝酸和羧酸的纤维素酯、混合纤维素酯以及纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白质及衍生物，包括交联的或修饰的明胶；天然的烃聚合物，例如乳胶和橡胶；可用适合的多孔结构制备的合成聚合物，例如烯类聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯乙酸酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺，以及其他聚合物例如聚氨基甲酸酯类或聚环氧化物；多孔无机材料例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；以及铝或硅氧化物或水合物，例如粘土、矾土、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可与上述聚合物材料一起用作过滤器)；以及上述各类的混合物或共聚物，例如通过在已有的天然聚合物上起始合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。
[0095]为了各种目的，本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，以引用的方式全文纳入本文。只要适用的法规和/或法律允许，所有与本文提到的GenBank登录号相关的序列，以引用的方式全文纳入本文，如同其在2011年12月15日提供的一样。如有冲突，以本发明书——包括术语解释——为准。
[0096]虽然下文描述了适合的方法和材料，但是与本文描述的方法和材料类似或等价的那些方法和材料可用于实施或测试所公开的技术。所述材料、方法和实施例仅是示例性的并且不意欲是限制性的。
[0097]II1.检测或测序核酸分子的方法
[0098]本文公开了检测和/或测序样品中存在的核酸分子的方法。在一些实例中，在同一样品或同一测定中(例如在测定板或阵列的同一孔中)检测至少两种不同的核酸分子。在一些实例中，在至少两个不同样品或测定中(例如在来自不同患者的样品中)检测到相同核酸分子或分子。
[0099]所公开的方法提供了对定量核酸酶保护测定(qNPA)的改进，所述定量核酸酶保护测定例如在国际专利公开 W099/032663 ；W000/037683 ；W000/037684 ；W000/079008 ；W003/002750 ；和 W008/121927 ;和美国专利 N0.6，232，066,6, 238，869 ;6，458，533 ；和7，659，063中描述的那些，所有参考文献以引用的方式全文纳入本文。还参见Martelet al., Assay and Drug Development Technologies.2002，1(1-1):61-71;Martel etal., Progress in Biomedical Optics and Imaging, 2002，3:35—43;Martel et al., GeneCloning and Expression Technologies, Q.Lu and M.Weiner, Eds., Eaton Publishing，Natick(2002);Seligmann PharmacoGenomics, 2003, 3:36-43;Martel et al., “ArrayFormats，，in “Microarray Technologies and Applications,，，U.R.Muller and D.Nicolau, Eds, Springer-Verlag, Heidelberg(2005);Sawada et al., Toxicology in Vitro, 20:1506-1513, 2006;Bakir,et al., Bioorg.&Med.Chem Lett, 17:3473-3479, 2007;Kris etal., Plant Physiol.144:1256-1266, 2007;Roberts et al., Laboratory Investigation,87:979-997, 2007;Rimsza et al., Blood, 20080ctl5, 112(8):3425-3433;Pechhold etal., Nature Biotechnology, 27:1038-1042，2009。例如，与现有的 qNPA 方法相比，所公开的qNPA方法具有增强的灵敏度，例如可检测信号增加至少10倍、至少25倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少170倍或至少200倍。也就是说，需要至多1/10，或甚至1/200的样品；或相反地，可以使用所公开的方法检测低于当前可用方法灵敏度的1/10，或者甚至最低至1/20的稀少基因。因此，在可从患者回收仅仅10、50或100个细胞情况下，可以测试诸如提供极少量FFPE的细针抽出物或循环肿瘤细胞的样品类型，并且可使用所公开的方法检测稀有基因。[0100]另外，所公开的方法提供了对例如记载于美国专利公开N0.US-201 l-o 104693的定量核酸酶保护测序(qNPS)方法的改进。qNPS测序方法是使用qNPA将样品中存在的靶核酸分子(即使所述靶核酸分子是交联的时候)转化为稳定的单链核酸靶(核酸酶保护探针，NPP)，所述单链核酸靶可通过以下方式从溶液中回收而无需捕获或分离:使用所述核酸酶保护步骤以及(如果必要的话)用碱处理以使所述核酸酶保护探针从保护性靶分子解离，并且在RNA的情况中，水解所述RNA靶。然后通过测序确定核酸酶水解后留下的NPP的量，所述测序可以包括对所述探针本身测序。本文所公开的改进方法使用NPP的变体——一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)。使用NPPF允许进行多路复用，并且保留所检测或测序的靶核酸分子的化学计量，因为所述探针上的侧翼序列容许用于扩增的通用引物结合位点。因为所述引物结合位点是通用的，所以相同的引物可用于扩增针对任何靶序列的任何NPPF，从而允许多路复用并保留化学计量。在一个实例中，从所述NPPF两个末端的侧翼序列进行扩增，提供了意想不到且比现有qNPA和qNPS方法更高的特异性。具有完整3'和侧翼序列的NPPF会以指数方式被扩增；被核酸酶切割的NPPF不会被充足地扩增至足以被测序到或检测到。与此相反，使用现有qNPA方法处理的NPP可以在参与所述阵列上的捕获的序列末端被部分切割，或者在参与所述阵列上的检测的序列末端被部分切割，或者在两端被部分切割(这是由于弱的或不正确的杂交到不正确的靶核酸上)，并仍然被捕获和检测，导致针对正确靶核酸的特异性降低。使用所公开的NPPF探针不会发生这种情况。所公开的方法保留了原始的核酸分子计量，使得所检测或测序的核酸分子保留了与测试样品中所述核酸分子的相同相对量，例如变化不多于20%、不多于15%、不多于10%、不多于9%、不多于8%、不多于7%、不多于6%、不多于5%、不多于4%、不多于3%、不多于2%、不多于1%、不多于0.5% 或不多于 0.1%，例如 0.001%-5%、0.01%-5%、0.1%-5% 或 0.1%_1%。
[0101] 所公开的方法还允许多路复用实验，例如在同一测定中的多个反应(例如在同一反应孔中来自不同患者的多个样品)，以及在测序仪的同一运行/通道中分析的多个反应。
[0102]特别地，与现有qNPA和qNPS方法相比，所公开的方法使用修饰的核酸保护探针(NPP)，其在所述NPP的一个末端或两个末端包括侧翼序列。这些具有5'末端和/或3'末端侧翼序列的经修饰的NPP在本文中称为具有侧翼序列的核酸保护探针(NPPF)。充当通用引物位点用于杂交和/或扩增(以及可用于其他目的，包括NPPF的捕获或加标签)的一个或两个侧翼序列的存在，保留了所述样品中原始的核酸化学计量，因为所述侧翼序列是所述NPPF的一部分。另外，这消除了进行连接以将引物位点、标签等添加到所述NPPF的需要，添加引物位点、标签等可引入使样品中核酸化学计量产生偏离的人为假象，并提供另外的变异性来源。消除对连接的需要既消除了潜在的使化学计量产生偏离的人为假象又可避免重复性降低。
[0103]图1的示意图示出了示例性的NPPF。具有至少一个侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF) 100包括区域102，区域102包括特异性与靶核酸序列结合的序列(还可与双功能接头特异性结合)。所述靶核酸序列可以是DNA (例如基因组DNA或cDNA)或RNA (例如mRNA、miRNA、tRNA、siRNA),或者是DNA和RNA。所述NPPF包括一个或多个侧翼序列104和106。图1示出了具有5'侦彳翼序列104和3'侧翼序列106的NPPF100。但是，在一些实例中NPPF可以仅具有一个侧翼序列。
[0104]图2的示意图示出了使用所公开的方法用所述NPPF检测或测序核酸分子的示例性方法的初始步骤。如步骤1中所示，使已经用样品破碎缓冲液处理(例如裂解的或以其他方式处理以使得可接触核酸)的样品(例如已知或怀疑含有靶核酸的样品，200)与多种具有一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF) 202接触或孵育，所述多种核酸酶保护探针202包括至少一种与第一靶核酸(例如靶DNA或RNA)特异性结合的NPPF。所述反应还可包括与第二靶核酸特异性结合的其他NPPF，等等。例如，所述方法可以使用一种或多种不同的NPPF，所述NPPF被设计为特异性针对各独特靶核酸分子。因此，测量100个基因需要使用至少100种不同的NPPF，每个基因有至少一种特异性的NPPF (例如每个基因有若干不同的NPPF)。因此，例如，所述方法可以使用至少2种不同的NPPF，使用至少3、至少4、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100或甚至至少200种不同的NPPF (例如
2-500、2-100、5-10、2-10或2-20种不同的NPPF)。但是，应该理解在一些实例中，所述多种NPPF可以包括特异性针对同一种靶核酸分子的多于一种(例如2、3、4、5、10、20、50或更多种)NPPF。图2中的虚线条表示特异性针对第一靶的NPPF，实心灰色条表示特异性针对第二靶的NPPF。在一些实例中，所述NPPF包括可检测标记，例如生物素(B)，但是本领域技术人员应该理解可以在其他步骤例如在扩增过程中添加标记。因此，图2中示出的生物素是任选的，可以使用其他标记。所述反应还包括与所述侧翼序列互补的核酸分子(CFS) 204，所述核酸分子是特异性针对NPPF202的侧翼序列。图2示出的点线绿色条204为特异性针对NPP的一个或多个侧翼序列的CFS。本领域技术人员应该理解所述CFS的序列将会根据所存在的侧翼序列而变化。另外，可以使用多于一个的CFS以确保侧翼区域得到保护(例如可以使用至少两个结合到单个侧翼序列的不同区域的CFS)。所述CFS可以包括天然或非天然碱基。虽然图2示出了在其两个末端有侧翼序列的NPPF ;但是本领域技术人员应该理解可以使用单独一个侧翼序列。将所述样品、NPPF和CFS在足以使NPPF特异性结合到其各自的靶核酸分子且足以使CFS结合到其在所述NPPF侧翼序列上的互补序列的条件下孵育。在一些实例中，所加入的CFS204相对于NPPF202是过量的，例如至少是NPPF的5倍的CFS(摩尔过量)，例如所述NPPF的至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍的CFS。在一些实例中，所加入的NPPF202相对于所述样品中总核酸分子是过量的，例如至少为所述样品中总核酸分子的50倍的NPPF(摩尔过量)，例如所述样品中总核酸分子的至少75倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或至少1000倍的NPPF。为了方便实验，可以包括类似浓度的每种NPPF以制备混合物，使得对于所测量的丰度最高的核酸靶而言存在至少为该核酸靶的50倍的NPPF，例如至少100倍过量。所使用的所有NPPF的实际超出量和总量仅受限于所述核酸酶(例如S1核酸酶)破坏所有未杂交到靶核酸靶的NPPF的能力。在一些实例中所述反应被加热，例如在50°C孵育过夜。
[0105]如图2中步骤2所示，在使得发生所述结合/杂交反应后，使所述样品与特异性针对单链(ss)核酸分子的核酸酶在足以除去(或消化)单链核酸分子(例如未结合的核酸分子，例如未结合的NPPF、CFS和靶核酸分子或这些分子中保持为单链的部分)的条件下接触。如图2所示，将所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶一起孵育，导致了对任意单链核酸分子的降解，留下完整的双链核酸分子，包括其上已经结合CFS和靶核酸分子的NPPF。例如， 将所述反应用S1核酸酶在50°C下孵育1.5小时(虽然水解可以在其他温度发生并且可以持续进行其他的时间长度，但是所需要的时间和温度会部分地为核酸酶的量的函数，并且依赖于需要被水解的核酸的量以及被保护的双链区域的Tm)。
[0106]在该反应后，所述样品可以任选地被处理以另外除去或分离未杂交的物质和/或灭活或除去残留的酶(例如通过加热、酚提取、沉淀、柱过滤等)。例如，如步骤3所示可以提高所述反应的pH以灭活所述核酸酶，以及加热所述反应以破坏所述核酸酶。另外，加热所述反应还会使所述靶核酸(例如靶DNA或靶RNA)和CFS与所述NPPF上的互补区域解离。这留下了先前结合所述靶核酸分子和CFS的完整的NPPF，其中所述完整的NPPF与已经杂交到所述靶的NPPF的量成正比。在一些实例中，所述杂交的靶核酸和CFS可以例如通过核酸酶或通过化学处理来降解。或者，可以处理所述样品以便留下所述靶核酸分子的(单链)杂交部分，或由所述靶核酸分子和CPS与所述NPPF杂交形成的双链体，供进一步分析(例如测序与所述NPPF杂交的靶)。在一个实例中，将pH提高至约pH8，并将所述反应在95°C下孵育10分钟，使得所述靶核酸和CFS解离(如果所述靶核酸为RNA，则水解所述靶核酸)。
[0107]如图2中步骤4所示，在步骤2或步骤3之后，扩增所述NPPF，例如使用PCR。图2以箭头示出了 PCR引物或探针208。所述PCR弓丨物或探针可以包括标记，例如生物素，从而导致产生标记的扩增子。PCR引物/探针208的至少一部分是特异性针对NPPF202的侧翼序列。然后可检测所产生的扩增子210，例如通过结合到阵列上(见图3)，或者对其测序(见图4)。在一些实例中，所述引物208的浓度相对于CPS204是过量的，例如过量达至少10，000倍、至少50，000倍、至少100，000倍、至少150，000倍、至少200，000倍或至少400，000倍。在一些实例中，所述反应中引物208的浓度为至少200nM (例如至少400nM、至少500nM或至少ΙΟΟΟηΜ)，所述反应中CPS204的浓度低于ΙρΜ、低于0.5pM或低于0.ΙρΜ。
[0108]如图3中步骤5所示，可使扩增子210 (其为扩增的NPPF)与包括多个空间上不连续区域的表面212接触。示出了两种不同方式。在一种实例中(上)，所述表面包括至少一种与双功能接头216连接的锚214。在一些实例中将扩增子210加入到2X缓冲液，然后与表面212接触。双功能接头216包括特异性结合到所述锚的第一部分和特异性结合到多种NPPF扩增子210之一的第二部分。将扩增子210与表面212在足以使得多种NPPF扩增子210各自特异性结合到双功能接头216的第二部分的条件下一起孵育。如图1所示，NPPF102中特异性结合到双功能接头的区域在序列上与所述双功能接头互补(也与所述靶核酸序列互补)。使用NPPF扩增子210中包括的可检测标记检测结合到双功能接头216的第二部分的NPPF扩增子210，从而检测所述样品中的靶核酸。
[0109]在其他实例中(下)，所述表面包括至少一种核酸捕获分子220，其可通过共价键直接连接到所述表面。在一些实例中将扩增子210加入到2X缓冲液，然后与表面212接触。核酸捕获分子220包括与多种NPPF扩增子210之一的至少一部分(例如所述NPPF侧翼序列区域的至少一部分，或例如在扩增过程中添加到所述侧翼序列的区域)互补的序列。将扩增子210与表面212 在足以使得多种NPPF扩增子210各自特异性结合到核酸捕获分子220的条件下一起孵育。
[0110]使用NPPF扩增子210中包括的可检测标记来检测结合到核酸捕获分子220的NPPF扩增子210，从而检测所述样品中的靶核酸。例如，可将所述NPPF扩增子与所述表面在50°C下孵育过夜以使得所述NPPF扩增子结合到核酸捕获分子220。在一个实例中，用生物素标记所述NPPF扩增子。如图3的步骤6所示，可以使用亲和素-HRP218检测所述生物素(例如与所述亲和素-HRP在37°C下孵育1小时)。如图3的步骤7所示，除去过量的未结合的亲和素-HRP218，加入适合的底物，对所述表面成像以检测结合的NPPF。虽然生物素作为一个实例示出，但是本领域技术人员应理解，可以使用其他检测方法，例如通过检测所述NPPF扩增子上的荧光团或抗体。
[0111]在一些实例中，如果NPPF扩增子210没有被标记(例如在图2步骤4的扩增过程中没有加入标记)，那么NPPF扩增子210可以包括与被标记探针的序列互补的区域(例如所述侧翼序列或其部分)(其中所述区域与双功能接头216不互补)。然后可将这种互补探针杂交到NPPF扩增子210，然后将它们连接至基质，如图3的步骤5所示。
[0112]在一些实例中，使所述NPPF扩增子与多个表面接触(例如微珠或其他颗粒的群)。在一个实例中，每个表面(例如混合微珠群中的每个微珠或微珠亚群)包括至少一种与双功能接头连接的锚，所述双功能接头包括与所述锚特异性结合的第一部分和第二部分，所述第二部分在足以使得所述多种NPPF扩增子各自特异性结合到所述双功能接头的第二部分的条件下特异性结合到所述多种NPPF扩增子之一。可以使用与所述NPPF扩增子连接的可检测标记来检测结合到所述双功能接头的第二部分的NPPF扩增子，从而检测所述样品中的靶核酸分子。在另一个实例中，每个表面(例如混合微珠群中的每个微珠或微珠亚群)包括至少一种核酸捕获分子，所述核酸捕获分子具有这样的序列，即所述序列在足以使得所述多种NPPF扩增子各自特异性结合到所述核酸捕获分子的条件下，与所述NPPF扩增子的至少一部分(例如侧翼序列或其一部分)互补。可以使用与所述NPPF扩增子连接的可检测标记检测结合到所述核酸捕获分子的NPPF扩增子，从而检测所述样品中的靶核酸分子。
[0113]如图4中步骤5所示，可对扩增子210 (其为扩增的NPPF)测序。例如，所扩增的NPPF的一个或两个侧翼序列可以包括(或其上已经添加)序列衔接头，或者与所述侧翼序列互补且杂交的引物可以包括序列衔接头序列，其与测序芯片上的捕获序列互补并使得能够使用特定测序平台测序所述NPPF。在一些实例中，对多种NPPF平行测序，例如同时测序。因此该方法可用于测序多种NPPF序列。
[0114]图5A和5B的示意图提供了对所述方法的进一步的概括，以及所述核酸分子的更多细节。如图5A的左图所示，将样品(例如已经用样品破碎缓冲液处理的样品冲的靶核酸400与多种具有一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)402 (其中每种NPPF是特定性针对特定靶核酸400)以及与所述侧翼序列互补的核酸分子(CFS) 406 (其是特异性针对所述NPPF末端上的侧翼序列404)接触或孵育。示出了三种不同的靶核酸400:靶1的一个拷贝(绿色)靶2的两个拷贝(红色)和靶3的三个拷贝(蓝色)。该实例示出了加入等量的每种NPPF402。虽然图5A示出了在NPP的两个末端具有侧翼序列的NPPF ;但是本领域技术人员应该理解可以使用单个侧翼序列。图5A的中图示出了在使靶核酸400、NPPF402和CFS406之间发生结合/杂交反应之后的反应产物。靶核酸400杂交到所述NPPF的中间区域，CFS406杂交到3'和5'侧翼序列404。图5A的右图示出了在将所述样品与特异性针对单链(ss)核酸分子的核酸酶在足以除去(或消化)单链核酸分子的条件下接触之后的反应产物。如图所示，所述靶核酸中未与NPPF408杂交的区域被消化掉，NPPF中没有结合到靶核酸或CFS的单链区域(例如410)也是如此。这留下了完整的双链核酸分子，包括其上已经结合CFS和靶核酸分子的NPPF (例如412)以及NPPF中仅杂交到靶(未杂交到CFS)，或仅杂交到CFS (未杂交到靶)的区域(例如414)。
[0115]图5B的左图示出了分离所述双链核酸分子(例如使用加热和提高pH)之后的反应产物。然后可扩增所获得的幸存的NPPF，其与在核酸酶步骤中保护它们的靶核酸分子成正t匕。图5B的中图示出了将它们扩增之后的反应产物。图5B的右图示出了扩增后，可检测或测序所获得的NPPF扩增子(例如见图2-4)。
[0116]在一些实施方案中，所述方法可以包括将来自受试者的样品(例如包括核酸例如DNA或RNA的样品)与多种NPPF接触，所述多种NPPF包括至少一种特异性结合至第一靶(例如第一 RNA)的NPPF和任选的至少一种特异性结合至第二靶(例如第二 RNA)的NPPF。在一些实例中，所述多种NPPF包括多于一种(例如2、3、4、5或更多种)特异性针对单独一种靶核酸分子的NPPF。例如，所述多种NPPF可以包括至少一种NPPF (例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、500、1000、2000、3000 或更多种)，其中每种 NPPF 特异性结合单独一种靶核酸分子。在另外的或额外的实例中，所述多种NPPF包括至少两种不同的NPPF群(例如2、3、4、5、10、20或50种不同的NPPF序列)，其中每种NPPF群(或序列)特异性结合到不同的靶核酸分子。
[0117]在一些实例中，若干种NPPF杂交到同一祀核酸的不同部分，并且与每种祀核酸的不同部分杂交的NPPF的数量可以相同或不同。例如，相对于以更高水平表达的核酸靶，低表达的核酸靶可以具有更多的与其杂交的NPPF，例如四种NPPF与低表达的核酸靶杂交，一种NPPF与高表达的核酸靶杂交。在一些实例中，一些特异性针对某些靶核酸的NPPF可以没有侧翼序列(例如NPP)，因此不可被扩增或被标记或连接有合适的衔接头，因此NPPF的这部分不会被检测到或测序到。使用这样的混合物，具有侧翼序列的NPPF与没有侧翼序列的NPP的比例可以为约1:5、或约1:10、或约1:100、或约1: 1,000时，可“减弱”所测量的信号或所测序到的NPPF的数量，使得如果有10，000个拷贝的靶核酸并且使用1比5的比例，则在扩增后测序到的NPPF的数量仅为每种NPPF都含有侧翼序列时应该会测序到的数量的1/5。
[0118]在一些实例中，所述多种NPPF包括至少2、至少5、至少10、至少20、至少100或至少 1000 (例如 2-5000、2-3000、10-1000、50-500、25-300、50-300、10-100 或 50-100)种独特的NPPF序列。所述多种NPP可以包括特异性针对一种或多种靶核酸分子的NPPF的任意组合。将所述多种NPPF和所述CFS —起，与所述样品在足以使得所述NPPF特异性杂交到其各自的靶核酸和其各自的CFS的条件下孵育。在一些实例中，所加入的CFS相对于所述NPPF是过量的，例如相对于NPPF至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍摩尔过量的CFS。在一些实例中，所加入的NPPF相对于所述样品中的核酸分子是过量的，例如相对于所述样品中的核酸分子至少10倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少250倍、至少1，000倍、至少10，000倍或至少100，000倍摩尔过量或更多的NPPF。应该理解，如果针对高丰度核酸靶的NPPF过量1，000倍，并且每种不同的NPPF的相同浓度是相同的，那么针对低丰度基因的NPPF的过量可以是更多倍，例如对于丰度是高丰度核酸靶1/1000的基因来说可以是大于1000倍。
[0119]然后可将所述杂交的样品与特异性针对单链核酸的核酸酶(例如S1核酸酶)接触。然后可扩增所获得的幸存的NPPF，其与在核酸酶步骤中保护它们的靶核酸分子成正比。例如，可以使用包括与所 述NPPF侧翼序列互补的序列的扩增引物。然后所获得的NPPF扩增子可以通过本领域中已知方法检测，例如通过使其结合至阵列或其他基质，或者对其测序。当一种或多种靶核酸分子各自的NPPF被检测到或测序到时，所述一种或多种靶核酸分子被鉴定为存在于样品中。
[0120]A.示例性的杂交条件
[0121]本文公开了足以使得多种NPPF特异性杂交到一种或多种靶核酸分子(例如来自受试者的样品中的DNA和RNA)，以及特异性杂交到与所述一个或多个侧翼序列互补的CFS的条件。例如，使核酸(例如NPPF)能够在选择的严格性条件下杂交到另一核酸(例如靶DNA或RNA或CFS)同时使与其他物质或分子的非特异性杂交最少的特征(例如长度、碱基组成和互补程度)可以根据本公开内容确定。所述NPPF的特征在以下第IV部分更详细地论述。通常，NPPF的一个区域会具有与其对应靶核酸分子充分互补的核酸序列(例如图1，102)以使得其能够在选择的严格杂交条件下杂交，并具有与其对应CFS充分互补的区域(例如图1，104、106)以使得其能够在选择的严格杂交条件下杂交。示例性的杂交条件包括在约37°C或更高温度(例如约371:、421:、501:、551:、601:、651:、701:、751:或更高)下杂交。可以改变的杂交反应参数有盐浓度、缓冲液、pH、温度、孵育时间、变性剂(例如甲酰胺)的量和类型。例如，可以将核酸(例如多种NPPF)在缓冲液(例如含有NaCl、KCl、H2P04、EDTA、0.05%Triton X-100或其组合的缓冲液)例如裂解缓冲液中以约ΙΟρΜ至约ΙΟηΜ (例如约30pM至5nM、约ΙΟΟρΜ至约InM)的浓度加入到样品中。
[0122]在一个实例中，以至少ΙΟρΜ，例如至少20pM、至少30pM、至少50pM、至少ΙΟΟρΜ、至少150pM、至少200pM、至少500pM、至少InM或至少ΙΟηΜ的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在一个实例中，以约30pM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在另一个实例中，以约167pM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在另外的实例中，以约InM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在一个实例中，以约至少6倍于探针的量，例如至少10倍或至少20倍于探针的量(例如6-20倍于探针的量)的终浓度将每种CFS加入到样品中。在一个实例中，加入的每种CFS为至少InM、至少5nM、至少ΙΟηΜ、至少50ηΜ、至少ΙΟΟηΜ或至少200nm，例如1-100、5-100或5-50nM。例如如果有6种探针，每种为166pM，那么可以以5_50nM加入每种CFS。
[0123]将所述样品中的核酸变性，使其成为单链并能够用于杂交(例如在约95°C -约105°C下，持续约5-15分钟)。通过使用不同的变性溶液，该变性温度可以改变，只要温度和缓冲液组成的组合导致形成单链靶DNA或RNA或单链靶DNA和RNA。然后所述样品中的核酸和CFS在约4°C -约70°C(例如约37°C -约65°C、约42°C -约60°C或约50°C -约60°C )的温度下与所述多种NPPF杂交，持续约10分钟至约72小时(例如至少约1小时-48小时、约6小时-24小时、约12小时-18小时或过夜)。当然，所述杂交条件会根据所用的具体NPPF和CFS而变化，但是其被设置为确保NPPF与所述靶分子和CFS杂交。在一些实例中，将所述多种NPPF和CFS与所述样品在至少约37°C、至少约40°C、至少约45°C、至少约50°C、至少约55°C、至少约60°C、至少约65°C或至少约70°C的温度下孵育。在一个实例中，将所述多种NPPF和CFS与所述样品在约37°C、约42°C或约50°C下孵育。 [0124]在一些实施方案中，所述方法不包括核酸纯化(例如在使所述样品与所述NPPF接触之前不进行核酸纯化，并且/或者在使所述样品与所述NPPF接触之后不进行核酸纯化)。在一些实例中，除了细胞裂解以外不需要对所述样品进行预处理。在一些实例中，细胞裂解以及使所述样品与所述多种NPPF和CFS接触是依次发生的。在其他实例中，细胞裂解以及使所述样品与所述多种NPPF和CFS接触是同时发生的，在一些非限制性实例中没有任何干预步骤。
[0125]当随后对所述NPPF进行PCR (例如通用扩增或例如用于实时PCR的NPPF特异性扩增)时，用于裂解、NPPF与其靶核酸杂交、核酸酶消化和碱水解的缓冲液和试剂可以与用于扩增的聚合酶相容。
[0126]B.用核酸酶处理
[0127]在所述NPPF杂交到所述样品中的靶核酸以及杂交到CFS后，对所述样品进行核酸酶保护步骤。已经杂交到靶核酸分子和(当使用时)CFS (—个或两个CFS，取决于在所述NPPF上有5'和3'的侧翼序列或者仅有一个侧翼序列，或者当不需要侧翼序列用于进行扩增或测量时则没有CFS)的NPPF没有被所述核酸酶水解，并且随后可被扩增，然后被检测或测序(或两者都进行)。
[0128]用一种或多种核酸酶处理会破坏所有的单链核酸分子(包括样品中未杂交到NPPF(从而不受NPPF保护)的RNA和DNA、未杂交到靶核酸的NPPF以及未杂交到NPPF的CFS(当使用时))，但是不会破坏双链核酸分子例如已经与CFS和所述样品中存在的靶核酸分子杂交的NPPF。例如，如果所述样品包括细胞提取物或裂解物，那么不想要的核酸(例如非靶的基因组DNA、tRNA、rRNA、mRNA、miRNA以及一种或多种靶核酸分子中未杂交到互补NPPF序列的部分(例如悬突))可以在该步骤中被充分破坏，在mRNA或DNA核酸靶的情况中，所述一种或多种靶核酸分子的未杂交到互补NPPF序列的部分将会占所述核酸靶序列的大部分。这保留了靶核酸/CFS/NPPF双链体的化学计量。如果所述靶分子被交联到由固定产生的组织上，那么所述NPPF杂交到所述交联的靶分子而不需要逆转交联，或者以其他方式将所述靶核酸从其交联的组织上释放。
[0129]可以选择条件使得导致未配对碱基的单个核苷酸差异不被切割，或可以使用仅切割未配对的碱基直到所述杂交的核酸酶保护探针的末端的核酸酶，例如外切核酸酶。还可以选择这样的条件，即其在单个未配对碱基的位点处水解所述NPPF序列，并且类似地在该位置水解所述靶核酸。[0130]核酸酶的实例包括内切核酸酶、外切核酸酶和其组合。取决于所述杂交复合物的性质以及所述样品中存在的核酸剩余部分和非靶核酸序列的性质，可以使用多种核酸酶中的任一种，包括DNA酶、胰RNA酶、绿豆核酸酶、S1核酸酶、RNA酶A、核糖核酸酶T1、外切核酸酶II1、外切核酸酶VI1、RNA酶CLB、RNA酶PhyM、RNA酶U2等。本领域技术人员可以选择适合的核酸酶。在具体的实例中，所述核酸酶是特异性针对单链(ss)核酸的，例如S1核酸酶。除了水解过量的NPPF并将靶核酸的化学计量赋予所述NPPF之外，使用特异性针对单链核酸的核酸酶的一个优势是，在单链(“粘性的”)分子可能导致不需要的背景或交叉反应性的后续反应步骤中除去这些分子。但是，本领域技术人员应该理解，如果要对所述靶核酸测序，那么这是不必要的，因为仅具有适合的测序衔接头的NPPF会杂交到测序芯片上，此时所述样品中的单链分子可被洗掉。S1 核酸酶可市购自例如 Promega, Madison, WI (cat.n0.M5761) ; Life Technologies/Invitrogen,Carlsbad, CA(cat.n0.18001-016) ;Fermentas, Glen Burnie,MD (cat.n0.EN0321)以及其他制造商。这些酶的反应条件是本领域熟知的并可以凭经验优化。
[0131]在一些实例中，将在缓冲液(例如含有乙酸钠NaCl、KCl、ZnS04、KATH0N或其组合的缓冲液)中稀释的S1核酸酶加入到杂交的探针/样品混合物并在约37°C至约60°C (例如约50°C)下孵育10-120分钟(例如10-30分钟、30-60分钟、60-90分钟或120分钟)以消化所述样品中未杂交的核酸和未杂交的NPPF。
[0132]可以任选地处理所述样品以另外除去未杂交的物质和/或灭活或除去残留的酶(例如通过加热、酚提取、沉淀、柱过滤、加入蛋白酶k、加入核酸酶抑制剂、螯合所述核酸酶发挥活性所需的二价阳离子，或其组合)。在一些实例中，任选地处理所述样品以使所述靶核酸和一个或多个CFS从其互补的NPPF上解离(例如使用碱水解和加热)。在一些实例中，在杂交和核酸酶处理后，杂交到所述NPPF的靶RNA分子可以被降解，例如通过在碱中解离具有NPPF的双链体，然后通过核酸酶或通过化学/物理处理(如在高温下进行碱水解)破坏所述RNA，留下与杂交到靶核酸的NPPF成正比的NPPF。或者，可以处理所述样品以留下所述靶核酸的(单链)杂交部分，或留下由杂交的靶核酸和所述探针形成的双链体供进一步分析。
[0133]在一些实例中在与核酸酶孵育之后，加入碱(NaOH或Κ0Η)以使pH提高至约9_12并加热所述样品(例如加热至95°C持续10分钟)。这使所述靶分子/CFS/NPPF 二聚体解离，留下单链状态的NPPF，并且在RNA的情况中水解所述RNA靶分子。该步骤还可以中和或灭活所述核酸酶，例如通过使pH升高到约6以上。
[0134]在一些实例中处理所述样品以将pH调节至约7-约8，例如通过加入酸(例如HC1)。在一些实例中，在Tris缓冲液中使pH升高至约7-约8。升高pH可以防止DNA脱嘌呤，还可防止许多单链特异性的核酸酶(例如S1)充分发挥功能。
[0135]在一些实例中，在扩增前，纯化或分离所述样品以除去不需要的核酸或其他分子，例如通过凝胶纯化或其他分离方法。
[0136]C.扩增[0137]可以例如使用常规方法例如PCR或其他形式的酶扩增或基于连接的扩增方法扩增所获得的NPPF分子(或已从所述NPPF分离所获得的靶核酸分子)，所述NPPF分子与被测试样品中存在的靶核酸分子的量成正比的。
[0138]可以使用的体外扩增方法的实例包括但不限于定量实时PCR、链置换扩增(见USPN5, 744,311);无转录等温扩增(见USPN6，033，881);修复链反应扩增(见W090/01069)；连接酶链反应扩增(见EP-A-320308);缺口填充连接酶链反应扩增(见USPN5，427，930)；偶连的连接酶检测和PCR (见USPN6，027, 889);以及NASBA? RNA无转录扩增(见USPN6, 025, 134)。在一个实例中，使用基于连接的扩增方法，其中引物是NPPF特异性的并且对接(butt-up)在一起使得它们可以连接在一起，解链(melt off),然后新的引物连接在一起，进行一系列的循环。连接可以是酶促的或非酶促的。如果所述NPPF侧翼序列用于杂交所述引物，那么扩增可以是通用的。
[0139]定量实时PCR是另一种体外扩增核酸分子的形式,可通过Applied Biosystems(TaqMan PCR)进行。5'核酸酶测定提供了用于仅检测特定扩增产物的实时方法。在扩增过程中，所述探针与其靶序列退火产生了底物，当Taq DNA聚合酶从上游引物延伸到所述探针的区域时，该酶的5'核酸酶活性将切割所述底物。这种对聚合反应的依赖确保了对所述探针的切割仅在所述靶序列被扩增时发生。荧光探针的使用使得可以省去用于分析探针降解的PCR后处理。所述探针为连接有报告荧光染料和猝灭剂染料的寡核苷酸。当所述探针完整时，所述猝灭剂的接近大大减少了由所述报告染料通过Forster共振能量转移(fret)发射的穿过空间的荧光。对于实时PCR，可以将所述NPPF的样品分到单独的孔或反应位置中，将不同的NPPF特异性的引物组加入到每个孔或反应位置。使用各自具有不同标记的探针使得能够进行多路复用的实时PCR，以在单个孔或反应位置内测量多种不同的NPPF。
[0140]在扩增所述NPPF过程中 ，可以例如在:V或Y末端或在两个末端将实验标签和/或测序衔接头作为例如所述引物和延伸构建体的一部分纳入。例如，包括与NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分的扩增引物，可以包括与需要的实验标签和/或测序衔接头互补的第二部分。本领域技术人员应该理解实验标签和/或测序衔接头的不同组合可被加入到所述NPPF的任一末端。在一个实例中，使用第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述NPPF，所述第一扩增引物包括与所述3' -NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的测序衔接头互补的第二部分(或包含需要的测序衔接头的第二部分)，所述第二扩增引物包括与所述Y -NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的实验标签互补的第二部分(或包含需要的实验标签的第二部分)。在另一个实例中，使用第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述NPPF，所述第一扩增弓|物包括与所述3, -NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的测序衔接头和需要的实验标签互补的第二部分(或包含需要的测序衔接头和需要的实验标签的第二部分)，所述第二扩增引物包括与所述5' -NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的实验标签互补的第二部分(或包含需要的实验标签的第二部分)。
[0141]应该理解NPPF特异性引物可以用于添加测序衔接头、实验标签(包括使得能够通过基质捕获NPPF的标签)和NPPF标签。可将所述NPPF的样品分开到含有一种或多种不同的NPPF特异性引物的单独孔或位置中，扩增，然后单独测序或合并测序(或检测)。
[0142]还可使用扩增来将可检测标记引入到所产生的NPPF扩增子中(例如，如果所述NPPF原来是未标记的或如果需要另外的标记)，或引入其他允许检测或猝灭的分子。例如，所述扩增引物可以包括在扩增过程中被纳入到所述NPPF中的可检测标记、半抗原或猝灭剂。这样的标记、半抗原或猝灭剂可被引入到所述NPPF扩增子的任一末端(或两个末端)或两个末端之间的任何位置。
[0143]在一些实例中，所获得的NPPF扩增子在检测或测序前被提纯。例如，可以在检测或测序前使用本领域中熟知的方法(例如凝胶纯化、生物素/亲和素捕获和释放、毛细管电泳)将扩增反应混合物提纯。在一个实例中，将所述NPPF扩增子生物素化(或使其包括另外的半抗原)并捕获到亲和素或抗-半抗原包被的微珠或表面上，洗涤，然后释放用于检测或测序。类似地，可将所述NPPF扩增子捕获到互补的寡核苷酸(例如结合到表面上的寡核苷酸)上，洗涤，然后释放用于检测或测序。所述扩增子的捕获不需要是特别特异性的，因为所公开的方法除去了大多数的基因组或转录组序列，留下已经杂交到靶核酸分子上的NPPF。如果需要，可以使用其他方法提纯扩增产物。
[0144]在扩增的最后步骤之后所扩增的产物还可以通过使用水解单链寡核苷酸的核酸酶(例如外切核酸酶I)的方法来提纯，同时其仍然为双链，所述核酸酶接着可以在继续下一步骤(例如杂交到表面)之前被灭活。
[0145]D.NPPF扩增子的检测
[0146]在一些实例中，通过任何适合的方式(例如基于所述NPPF扩增子上存在的可检测标记)来检测所获得的扩增子。在一个具体的非限制性实例中，所述NPPF扩增子包括生物素标记。在该实例中，可以通过以下方式来检测所述扩增子:将所述NPPF扩增子(例如在含有所述NPPF扩增子的支持物，例如阵列或微珠上)与亲和素-HRP、链霉亲和素-HRP或含有另外的适合酶(例如碱性磷酸酶)的缀合物一起孵育，然后使所述支持物与生色底物、化学发 光底物或产生荧光的底物接触。在一个非限制性实例中，所述底物为TMA-3 (Lumigen, Southfield, MI)0另外的化学发光底物是可以市购的，例如
LumiGlo? (KPL, Gaithersburg, MD)、 SliperSignal? (Pierce, Rockford, IL)和
ECL?(Amersham/GE Healthcare, Piscataway, NJ)。例如使用微阵列成像器(例如 0ΜΙΧ、OMIX HD、CAPELLA或 SUPERCAPELLA成像器，HTG Molecular Diagnostics, Tucson, Arizona)扫描仪或目视例如在侧流装置中，检测由所述底物产生的信号。可以使用基于铕的发光，以及电致发光或光散射或电(例如电导率或电阻)。在另一个实例中，所述NPPF包括荧光标记，例如Cy-3或Cy-5。可以使用标准的微阵列成像器(例如Typhoon?成像器(GE Life Sciences, Piscataway, NJ)> GenePix? 微阵列扫描仪(Molecular
Devices, Sunnyvale, CA)、GeneChip? 扫描仪(Affymetrix, Santa Clara, CA))、流式细
胞术方法或荧光显微术方法来检测所述NPPF扩增子。本领域技术人员可以选择用于这些或其他可检测标记的适合的检测方法和试剂。
[0147]E.使用捕获分子检测NPPF
[0148]在一些实施方案中，在杂交、核酸酶处理和扩增之后，使含有NPPF扩增子的样品与包括多个空间上不连续区域的表面(其各自包括捕获分子)接触，或与多个各自包括捕获分子的表面接触。例如，所述表面可以是微珠群，其中所述微珠的亚群各自包括至少一种捕获分子。例如，第一亚群可以包括至少一种捕获分子，而第二亚群可以包括至少一种序列与所述第一亚群不同的捕获分子，等等。在一些实例中，所述捕获分子包括至少一种与双功能接头(也称为“编程接头”)连接的锚。或者，所述捕获分子包括核酸捕获探针，所述核酸捕获探针具有与NPPF扩增子的至少一部分互补的序列，例如与NPPF扩增子的侧翼区域的全部或一部分互补的序列。
[0149]在其中所述捕获分子包括至少一种与双功能接头连接的锚的实例中，所述锚和双功能接头是通过杂交、退火、共价键或其他结合而连接。所述双功能接头包括特异性结合到所述锚(例如与其互补)的第一部分和特异性结合到所述多种NPPF扩增子之一(例如与其互补，例如与图1示出的NPPF100的区域102的全部或一部分互补)的第二部分。
[0150]在一些实施方案中，所公开的方法包括在表面上(例如在阵列上)的锚，其与双功能接头连接，所述双功能接头被用于在所述扩增步骤后捕获所述NPPF扩增子。在一些实例中，锚是长度为约8-150个(例如约8-100,15-100,20-80,25-75或25-50，例如约15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140 或 150 个核苷酸)核苷酸的寡核苷酸。在一个非限制性实例中，所述锚长度为约25个核苷酸。在一些实例中，所述锚包括特异性结合到所述双功能接头第一部分的第一部分和充当所述表面和所述锚的第一部分之间的间隔物的第二部分。在一些实例中，所述锚的第二部分的长度为约6-60个碳原子或核苷酸(例如约6、12、24、30、36、42、48、54或60个碳原子或核苷酸)。在其他实例中，所述锚的第二部分的长度为约5-100个碳原子或核苷酸(例如约10-50、15-40、20-30或约25个碳原子或核苷酸)。
[0151]用于所公开的方法的锚的碱基组成是这样的，即使得所述锚和双功能接头的配对的热力学稳定性高。在一些实例中，所述锚的碱基组成百分数为约30-40%G、30-40%C、10-20%A和10-20%T。在一些实例中，所述锚中的最近邻频率使G-G或C-C的最近邻最少以减少由G-四联体形成介导的副反应。在其他实例中，可以将非天然碱基或肽核酸纳入到所述锚或双功能接头中以改变其性质。
[0152]设计和合成所公开的方法中使用的锚的方法记载于例如PCT公开N0.W098/24098中，其以引用的方式纳入本文。在一些实例中，需要一组彼此基本不相似的锚。获得一组不相似锚的示例性算法如下:
[0153]1)定义所述组的大小。在一些实施方案中，16、24、36、48、49、64、81、96和100组
成可用的大小。
[0154]2)定义所述锚组的总序列结构。上述的长度和碱基组成被用于定义这些参数。通常，G喊基和C喊基的数量与A喊基和T喊基的数量保持相等。这种相等使最终组的结构多样性最优。因此，这些组将通过方程GnCnAmTm来描述。
[0155]3)对于由m和η定义的组结构，使用随机数生成器产生一组随机的序列异构体。
[0156]4)选择所述随机序列组的一个成员用作所述组的要素#1。
[0157]5)定义组成员中容许的最大相似度。以局部配对碱基比较的方式定义相似度。例如，当比对两个相同长度η的寡聚物链使得5'和3'末端对齐时，没有错配是指在所有位置1-η上所述两条链中的碱基都相同的情况。完全错配是指在所有位置1-η上所述两条链中的碱基都不相同的情况。例如，可用的最大相似度可以是在一组16，16mer捕获探针内有10个或更多个错配。
[0158]6)选择所述随机序列组的第二成员并确定其与要素#1的相似度。如果要素#2与要素#1的相似度低于最大容许相似度，其会保留在所述组中。如果要素#2的相似度大于最大容许相似度，将其丢弃并选择新序列用于比较。重复这个过程直到确定第二要素。
[0159]7)以顺序方式，选择所述随机序列组的其他成员，所述其他成员相对于所有之前选择的要素满足所述不相似度限制。
[0160]可用于所公开的方法的一组16个锚的一个非限制性实例在表1示出。
[0161]表1.示例性的锚序列
【权利要求】
1.一种确定样品中至少一种祀核酸分子的序列的方法，包括:使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，其中所述NPPF包含:5'末端和3'末端， 与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，位于与所述靶核酸分子互补的序列的5'、3'或5'和3'的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子(CFS)在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；用所述扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和对所述NPPF扩增子的至少一部分进行测序，从而确定所述样品中至少一种靶核酸分子的序列。
2.一种检测样品中至少一种靶核酸分子的方法，包括:使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，其中所述NPPF包含:5'末端和3'末端，与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，位于与所述靶核酸分子互补的序列的5'、3'或5'和3'的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子(CFS)在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；用扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和检测所述NPPF扩增子，从而检测所述样品中至少一种靶核酸分子。
3.权利要求1或2的方法，其中所述NPPF包含DNA分子。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述NPPF包含35-150个核苷酸。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列长度为10-60个核苷酸。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述侧翼序列长度为12-50个核苷酸。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述NPPF在5'末端和3'末端包含侧翼序列，其中所述5'末端的侧翼序列与3'末端的侧翼序列不同。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述至少一个扩增引物还包含一个序列，所述序列允许在所述扩增步骤中将实验标签或测序衔接头连接到NPPF扩增子。
9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述侧翼序列还包含实验标签、测序衔接头或其两者。
10.权利要求8或9的方法，其中所述实验标签包含使得能够鉴定样品、受试者、处理或靶核酸序列的核酸序列。
11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述测序衔接头包含允许捕获到测序平台上的核酸序列。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述实验标签或测序标签存在于所述NPPF扩增子的Y末端或Υ末端。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中一种或多种靶核酸分子是被固定、被交联或是不可溶的。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述样品是被固定。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述NPPF为DNA，并且所述核酸酶包括外切核酸酶、内切核酸酶或其组合。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述特异性针对单链核酸分子的核酸酶包括S1核酸酶。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述方法同时测序或检测多个样品中的至少一种革G核酸分子。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述方法测序或检测至少两种靶核酸分子，并且其中所述样品与至少两种不同的NPPF接触，每种NPPF均特异性针对不同的靶核酸分子。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述方法是对多个样品进行，并且在所述多个样品中的每一个中检测至少两种靶核酸分子。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中至少一种NPPF是特异性针对miRNA靶核酸分子，并且至少一种NPPF是特异性针对mRNA靶核酸分子。
21.权利要求1-20任一项的方法，还包括裂解所述样品。
22.权利要求1或3-21任一项的方法，其中测序包括Solexa测序、454测序、链终止测序、染料终止测序或焦磷酸测序。
23.权利要求1或3-22任一项的方法，其中测序包括单分子测序。
24.权利要求1或3-23任一项的方法，还包括:将所获得的NPPF序列与参考序列数据库比较；和确定每个鉴定的NPPF序列的数量。
25.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与包含多个空间上不连续区域的表面接触，每个区域包含至少一种与双功能接头连接的锚，其中所述双功能接头包含与所述锚特异性结合的第一部分和与所述NPPF扩增子之一的至少一部分特异性结合的第二部分，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件下进行。
26.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与包含多个空间上不连续区域的表面接触，每个区域包含至少一种具有与所述NPPF扩增子之一的至少一部分互补的区域的核酸锚，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述核酸锚的条件下进行。
27.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包含表面的亚群，其中每个表面亚群包含至少一种与双功能接头连接的锚，所述双功能接头包含与所述NPPF扩增子之一的至少一部分特异性结合的第一部分，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件下进行。
28.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包含表面的亚群，其中每个表面亚群包含至少一种具有与所述NPPF扩增子之一的至少一部分互补的区域的核酸锚，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述核酸锚的条件下进行。
29.权利要求27或28的方法，其中所述表面群包含微珠群。
30.权利要求2-21或25或27任一项的方法，其中所述双功能接头的第二部分是与同所述靶核酸分子的区域互补的NPPF区域互补，从而使所述NPPF扩增子与所述双功能接头之间能够特异性结合。
31.权利要求2-30任一项的方法，其中所述NPPF扩增子包含可检测标记。
32.权利要求31的方法， 其中所述可检测标记包括半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。
33.权利要求31的方法，其中所述可检测标记包括生物素。
34.权利要求33的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与缀合有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素或链酶亲和素接触。
35.权利要求1-34任一项的方法，其中所述至少一种NPPF包括至少10种NPPF。
36.权利要求1-35任一项的方法，其中所述样品为福尔马林固定的。
【文档编号】C12Q1/68GK103649335SQ201280033441
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月26日 优先权日:2011年5月4日
【发明者】B·塞利格曼, D·汤普森, T·瓦西塞克, D·A·戈登 申请人:Htg分子诊断有限公司