专利名称：Fto(2-氧化戊二酸依赖的加氧酶)活性的测定方法
技术领域：
本发明涉及监测FT0蛋白活性的测定法，尤其是鉴定FT0蛋白的抑制剂、激活剂和 底物的测定法。本发明还涉及对重量增加、重量减轻以及与重量增加和重量减轻相关的病 症的治疗或预防。
背景技术：
肥胖症与包括某些种类的癌症、心脏病和II型糖尿病在内的一系列疾病的风险 增加有关。最近已有报导说位于人16号染色体的FT0基因的特定等位基因的存在与肥胖 症和II型糖尿病有关。具体而言，发现II型糖尿病患者具有特定FT0变体(rs9939609A 等位基因)的可能性较高，所述变体与体重增加有关(Frayling等.Science (2007) 316 889-894)。涉及超过39，000名个体的后续分析揭示了 FT0等位基因与体重相关。携带一 个拷贝与II型糖尿病相关的FT0变体的个体与不具有该版本拷贝的个体相比肥胖风险增 加30%，并比不具有所述疾病相关变体拷贝的个体平均重超过1. 2kg。具有两个该变体拷 贝的个体(占受分析人群的约16% )与不具有所述疾病相关变体拷贝的个体相比，肥胖风 险增加70%且比不具有所述疾病相关变体拷贝的个体平均重3kg。这项研究非常重要，因 为此前的工作从未鉴定如此普遍的有风险的肥胖症等位基因。其它研究显示了相似的结果 (Dina 等 Nat Genet(2007) 39 :724_726 ；Scott 等 Science(2007) 316 1341-1345)。小鼠的FT0直系同源物Fatso (Fto)是融合趾小鼠突变体中所缺失的基因 (Peters 等 Mann Genome (2002) 13 186-188 ；van der Hoeven 等 Development (1994) 120 1601-2607, Grotewold & Ruther，Dev Biol (2002) 251 129-141 ;Anselme 等 Dev Biol (2007) 304 =208-220)。为了清楚起见，后文提及FT0应包括人FT0、非人类同源物和/ 或其临床上观察到的任何变异。虽然FT0序列变异与肥胖症关联，但其蛋白质产物在生物化学、细胞学和生理学 水平的功能还未有报导。需要有关FT0结构及其生物化学、细胞学和生理学作用的知识才能够对FT0和肥 胖症之间的关系进行探究从而治疗与重量增加相关的疾病，如糖尿病、心血管疾病、癌症、 骨质疏松症和高血压。2-氧化戊二酸(2-0G)和亚铁依赖的加氧酶是催化包括羟基化、去饱和和氧化闭 环在内的多种反应的酶的超家族(Hausinger (2004)，Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39， 21-68 ；Ryle & Hausinger(2002)Curr. Opin. Chem. Biol. 6，193-201 ；和 Schofield 等 (1999) Journal of Inorganic Biochemistry 74，49_49)。底物氧化与 2-0G 向琥珀酸盐和 二氧化碳的转化相偶联。至少在一些情况中，在氧的结合后，2-0G氧化脱羧得到琥珀酸盐、 C02和铁中心的铁物种(ferryl species) [Fe(IV) =0]。这种高反应性的中间体随后可氧 化主底物中的不活跃C-H键，例如氧化人类蛋白中的脯氨酰或天冬氨酰残基，或进行其它 氧化反应如N-甲基化形式的蛋白或核酸的甲基的氧化。中间体的证据来自底物类似物研 究、模型化合物和光谱分析。
辅底物和主底物的依次结合是触发氧结合所必须的，这对于在没有主底物时限制 反应性氧化物种的生成可能十分重要。这种物种以主底物非偶联方式生成可能使2-0G失 活并使有关加氧酶通过自身氧化失活，这种失活有时引起断裂。通常，2-0G的非偶联转化以 当存在饱和浓度的主底物时其偶联转化率的约5%发生，不过其也可以以更低或更高速率 发生。包括前胶原脯氨酰羟化酶、缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶和花色素合成酶在内的数 种2-0G依赖的加氧酶的完全催化活性需要抗坏血酸盐。虽然抗坏血酸盐可能通过将Fe3+ 或其它高价态形式的铁还原为Fe2+(自由存在于溶液中或位于活性位点)来刺激活性，但抗 坏血酸盐对加氧酶活性的刺激可能通过其它机制例如通过促进非偶联循环的完成而发生。 对于在主底物不存在时由前胶原脯氨酰羟化酶催化的非偶联反应循环，已表明2-0G被氧 化为琥珀酸盐与抗坏血酸盐在化学计量上偶联。此外，已表明抗坏血酸盐的活性可刺激细 胞中2-0G加氧酶的活性(例如在关于缺氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶的工作中)，并且 人类膳食中缺乏抗坏血酸盐会由于前胶原脯氨酰羟化酶的活性受损而导致坏血病。以数种酶进行的研究已表明某些底物类似物和突变体也能够刺激非偶联的2-0G 转化。从文献中还可获知，除抗坏血酸盐自身之外的还原剂(包括抗坏血酸盐的衍生物)在 非偶联转化反应中能够发挥还原剂作用(Zhang等(1995)Biochem. J. 307 (Pt 1)，77_85和 Myllyla 等(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 83，441-8)。多种2-0G加氧酶当下在治疗上具有意义，包括转录因子羟化酶如缺氧诱导因子 脯氨酰和天冬氨酰羟化酶、甲基化核酸去甲基化酶、甲基化赖氨酰去甲基化酶、前胶原脯氨 酰和赖氨酰羟化酶、植烷酰CoA羟化酶、Mina53、N066和精氨酰羟化酶如磷脂酰丝氨酸受体 (Jmjd6)。甲基赖氨酰去甲基化酶可以将甲基化组蛋白用作优选底物并可以任意使用所有 的三甲基化、二甲基化或单甲基化赖氨酸残基作为优选底物。核酸及包括组蛋白的核酸相关酸性蛋白的甲基化是表观遗传的已知机制。核酸的 甲基化还可以影响基因活性和表达。
发明内容
本发明人已将FT0鉴定为2-氧化戊二酸(2-0G)依赖的加氧酶并首次证明FT0是 2-0G依赖的加氧酶。本发明人已成功纯化了重组FT0并证明所纯化的重组FT0起到2-0G 依赖的加氧酶的功能并可被已知的2-0G加氧酶抑制剂抑制。因此，本发明提供了测定FT0活性的方法，该方法包括监测FT0多肽的加氧酶活 性。在本发明的方法中可以将氧和/或2-氧化酸如2-0G用作辅底物和/或将铁用作 辅因子。加氧酶活性的测定可以在诸如抗坏血酸盐或其类似物、硫醇或膦等还原剂存在下 监测。在一个实施方式中，在诸如肽或核酸底物等底物的存在下测定FT0加氧酶活性。用于本发明的方法的FT0多肽可以是重组多肽。在一个实施方式中，该FT0多肽 包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列；或与SEQ ID NO :1的氨基酸序列在其全长有至少40% 同一性的氨基酸序列。所述与SEQ IDN0:1的氨基酸序列在其全长有至少40%同一性的氨 基酸可以是SEQ IDNo :2至11中任一个所示的氨基酸序列。作为选择，所述与SEQ ID NO 1的氨基酸序列在其全长有至少40%同一性的氨基酸序列可以是人类FT0的天然存在的变体或除人之外其它物种的FT0同源物。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种方法，所述方法包括使FT0多肽与 测试试剂接触；在该测试试剂存在下监测加氧酶活性；和确定该测试试剂是否是FT0活性 的抑制剂或激活剂。测试试剂可以是除FT0之外的2-0G加氧酶的已知抑制剂，或所述抑制剂的类似物
或变体。除FT0之外的2-0G加氧酶可以是例如脯氨酰、赖氨酰、精氨酰或天冬氨酰去甲基 化酶、前胶原脯氨酰或赖氨酰羟化酶、缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶、甲基化赖氨酰去甲基化 酶(包括组蛋白去甲基化酶)、天冬氨酰羟化酶、磷脂酰丝氨酸受体(Jmjd6)、AlkB或人类 AlkB同源物和/或赤霉素C-20氧化酶。已知的2-0G抑制剂可以是N-草酰氨基酸如N-草 酰甘氨酸或其衍生物、甘氨酸或丙氨酸衍生物、2-氧化酸类似物、类黄酮或类黄酮衍生物如 染料木黄酮。在本发明的用于鉴定FT0抑制剂或激活剂的方法中，测试试剂可以与2-0G或FT0 底物在FT0活性位点竞争和/或在FT0活性位点结合金属。测试试剂可以例如包含金属离 子。在一个实施方式中测试试剂是还原剂，所述还原剂可以是除FT0之外的2-0G加氧 酶的已报导激活剂。例如，测试试剂可以是抗坏血酸盐或抗坏血酸盐的类似物或硫醇还原 剂，例如二硫苏糖醇或膦化学族的成员。本发明的方法中所用的FT0多肽的底物可以是核酸、核酸衍生物或类似物。例 如，该底物可以是甲基化核酸。甲基化核酸可以与参与重量调节的基因有关，例如野灰 (agouti)基因或神经肽Y基因、瘦素基因、阿黑皮素原基因(proopiomelanocortin gene)、 食欲素基因、甘丙肽基因、PYY基因、胆囊收缩素基因、胰高血糖素相关肽1基因或胰岛素基 因。在一个实施方式中，本发明提供了鉴定FT0底物的方法，该方法包括将FT0多肽 与测试底物接触；监测加氧酶活性；和确定测试底物是否是FT0的底物。测试底物可以是人 类核酸序列，例如包含3-甲基胸腺嘧啶碱基、1-甲基腺嘌呤碱基或3-甲基胞嘧啶碱基的核 酸序列。作为选择，测试底物可以是甲基化的蛋白或肽。可以使用FT0抑制剂使得能够通 过在鉴定底物之前稳定FT0和底物之间的相互作用来鉴定FT0底物。在一个方案中，本发明提供了鉴定可选择性抑制或激活FT0、或者激活或抑制除 FT0之外的酶但不激活或抑制FT0的抑制剂或激活剂的方法，该方法包括在测试试剂的存 在下监测FT0的活性，使用除FT0之外的酶重复该方法，并确定该测试试剂是否选择性抑制 或激活FT0或其它酶。在本发明的一个实施方式中，除FT0之外的酶通常是2-0G加氧酶，例如缺氧诱导 因子羟化酶如脯氨酰、天冬氨酰或赖氨酰羟化酶，胶原或前胶原脯氨酰羟化酶、核酸去甲基 化酶如AlkB同源物、或蛋白去甲基化酶如三甲基、二甲基或单甲基赖氨酸、精氨酸、天冬氨 酸或脯氨酸残基去甲基化酶。蛋白去甲基化酶可以对甲基化组蛋白或其片段进行羟基化。在其它实施方式中，本发明提供了 -2-0G加氧酶活性的抑制剂或激活剂的调节FT0活性的应用；-在治疗或预防重量增加或重量减轻或者治疗或预防与重量增加或重量减轻相关疾病的方法中应用的FT0加氧酶活性的调节剂；-对有需要的个体进行的治疗或预防重量增加或重量减轻的方法，所述方法包括 对所述个体施用治疗有效量的FT0加氧酶活性的抑制剂或激活剂；和-对有需要的个体进行的治疗或预防与重量增加或重量减轻相关疾病的方法，所 述方法包括对所述个体施用治疗有效量的FT0加氧酶活性的抑制剂或激活剂。
图1显示了 FT0同源物序列的clustalW比对人类gi | 122937263，黑猩 猩 gi 1114662524(^99 % ),称猴 gi 1109128525(^93 % )，狗 gi | 73950384 (*91 % )，奶 牛 gi 1119910109 (*88 % )，负鼠 gi 1126296336 (*65 % )，小鼠 gi 118490097 (*87 % )， 小鼠 2gi | 6753916 (*87 % )，大鼠 gi | 89337260 (*87 % )，鱼 gi 1125821796 (*48 % )，蛙 gi| 62859671(^52% ) [* 表示与人 FT0 的同一性]。图2是基于FT0序列和二级结构与ABH3 (图5)比对的FT0的同源模型。图3显示了 FT0和ABH3的序列和二级结构比对(FT0的预测的二级结构)。罗马 数字表示八个核心DSBH股。DSBH域之后有C-末端螺旋域。图4显示了确定FT0酶活性的2-0G转化测试的结果。所进行的测试采用11. 5 y M FTO, 144uM 20G, 16 u M14C-20G, 80 u M (NH4) 2Fe (I I) (S04) 2，4 ii M 抗坏血酸盐禾口 ImM DTT，或 者测试中不含(NH4)2Fe(II)(S04)2、抗坏血酸盐和DTT中的一种。测试还在N-草酰甘氨酸 (NOG)的存在下进行。图5显示了以重组FT0对寡核苷酸去甲基化的质谱(MS)分析结果。所示数据对 于TTX TTT TTT TTT TTT (T =胸腺嘧啶，X-甲基化碱基)为4-电荷态。+FT0 =与FT0及 适当辅因子和辅底物温育。3MeT = 3-甲基胸腺嘧啶；lMeA = 1-甲基腺嘌呤；3MeC = 3-甲 基胞嘧啶。图6显示了测试FT0的2-0G依赖的DNA去甲基化酶活性的实验结果(a)在2_0G 脱羧测试中，1-meA的去甲基化依赖于FT0 ； (b) LC-MS表明FT0对3-meT底物的活性依赖于 辅因子/辅底物。所示数据表示ss-DNA中胸腺嘧啶对3-meT的比例。氧对照反应在<
02的气氛中进行；(c)对FT0催化1-meA的抑制。图7显示了 FT0使单链DNA底物去甲基化的质谱分析结果。5’_TT(甲基化碱基) TTTTTTTTTTTT-3’形式的合成15聚寡核苷酸与FT0、辅因子和辅底物温育的LC-MS数据；去 甲基化底物的预测峰的位置由虚线标示。比反应物峰质量更高的较小的峰可能是源于甲基 化寡核苷酸的Na+和K+加合物。m/z =质-荷比，以道尔顿为单位表示；(b)FTO反应的化学 计量；(c)甲醛从甲基化多聚(dA)和多聚(dT)的释放。通过在37°C与[14C]_甲基化多聚 (dA)或[14C]-甲基化多聚(dT)(总c. p. m.分别为1000或800)温育15分钟测试FT0和 ABH3的去甲基化酶活性。监测醇溶[14C]-甲醛的释放。FT0-〇-，_ _ ； ABH3- A-,-A-. [14C]_甲基化多聚(dA)-〇-，-A-;[14C]_甲基化多聚(dT)- -，-▲-。当2-0G不存 在时，未检测到明显活性。图8显示了非偶联2-0G转化实验结果(a)测试采用2_0G转化法；未加入甲基化 DNA底物。实验设备和方法如实施例所述。所示数值是两次独立实验的平均值，100%对应 于130，000计数的[14C]-C02;(b)存在抑制剂时非偶联2-0G转化减少。DMS0= 二甲基亚砜。虽然N-草酰甘氨酸能够螯合Fe (II)，但这不完全是其FT0抑制效果的原因，这是因为 2-0G依赖的天冬氨酸-羟化酶的抑制剂N-草酰-D-苯丙氨酸(10)具有与N-草酰甘氨酸 相似的Fe(II)螯合能力但不抑制FT0活性。所示数值是两次独立实验的平均值，100%对 应于130，000计数的[14C]-C02 ； (c)所用抑制剂的结构。化合物1此前已被鉴定为有效的 2-0G加氧酶抑制剂(Franklin等，2001，Biochem J. 353:333)并采用标准合成方法学合成 (Banerji 等，2005，Chem Comm. 43 5438)。序列说明SEQ ID NO 1 是人 FT0 的氨基酸序列(gi 1122937263)。SEQ ID N0:2是与人FT0有99%序列同一性的黑猩猩FT0的氨基酸序列 (gi1114662524)。SEQ ID NO :3是与人FT0有93 %序列同一性的猕猴FT0的氨基酸序列 (gi1109128525)。SEQ ID NO :4是与人FT0有91 %序列同一性的狗FT0的氨基酸序列 (gi|73950384)。SEQ ID NO :5是与人FT0有88 %序列同一性的奶牛FT0的氨基酸序列 (gi1119910109)。SEQ ID NO :6是与人FT0有65 %序列同一性的负鼠FT0的氨基酸序列 (gi|126296336)。SEQ ID NO :7是与人FT0有87 %序列同一性的小鼠FT0的氨基酸序列 (gi|18490097)。SEQ ID NO :8是与人FT0有87 %序列同一性的小鼠FT0的氨基酸序列 (gi|6753916)。SEQ ID NO :9是与人FT0有87 %序列同一性的大鼠FT0的氨基酸序列 (gi|89337260)。SEQ ID NO :10是与人FT0有48 %序列同一性的鱼FT0的氨基酸序列 (gi|125821796)。SEQ ID NO :11是与人FT0有52 %序列同一性的蛙FT0的氨基酸序列 (gi|62859671)。SEQ ID NO 12 是人 ABH3 的氨基酸序列(gi | 21040275)。
具体实施例方式本发明人已经纯化了重组FT0并鉴定FT0为2-氧化戊二酸(2-0G)依赖的加氧酶。 因此，本发明提供了测定FT0活性的方法，所述方法包括监测FT0多肽的加氧酶活性。本发 明还提供了 FT0多肽在鉴定FT0加氧酶活性的调节剂和可被FT0氧化的底物的测试法中的应用。本发明人已发现FT0与Fe(II)和2_0G依赖的加氧酶同源，该酶与人DNA去甲基 化酶ABH3有特别强的序列相似性，ABH3对于1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶等核酸碱基 具有作为去甲基化酶的已知活性。本发明中所用的FT0多肽通常结合Fe2+。因此，在本发 明的一个方案中，在测定FT0活性的方法中铁可被用作辅因子。
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本发明中使用的FT0多肽通常具有将2-0G和氧转化为琥珀酸盐和二氧化碳的能 力。因此，在本发明的一个方案中，测定FT0活性的方法使用氧和/或2-0G为辅底物。FT0多肽可以包含如SEQ ID NO 1所示的序列，或与双链0螺旋(DSBH)域中的 SEQ ID NO :1具有至少40%序列同一性(例如至少45%序列同一性)，或与SEQ ID N0:1的 氨基酸序列在其全长有至少约40%例如至少约50%或约60%序列同一性、通常大于70% 或80%、更通常大于约90%或95%例如约99%序列同一性的氨基酸序列。序列同一性可以使用任何适合的算法来计算。例如，UWGCG包提供了 BESTFIT程 序，能够用于推算同源性(例如按照其默认设置使用)(Devereux等(1984) Nucleic Acids Research 12，387页-395页)。PILEUP和BLAST等算法能够用于推算同源性或排列序列 (通常按默认设置)，例如如 Latched (1993) J.Mol.Evol 36 :290_300 或 Latched 等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10 所述。FT0多肽可以是由任何天然存在的FT0基因编码的多肽。天然存在的FT0基因可 以包含SEQ ID N0:1中所示序列，也可以是SEQ ID N0:1的变体。所述变体可以包括等位 基因变体和蛋白序列中单个氨基酸或氨基酸群的缺失、修饰或添加，只要多肽保留2-0G加 氧酶活性即可。多肽还优选具有核定位信号，尤其是使用基于细胞的测试法监测多肽活性 时。所述核定位信号可以是FT0核定位信号序列或来自其它肽的核定位信号序列。FT0多肽可以是来自非人类物种的FT0同源物，例如有黑猩猩(SEQID N0 2)、猕 猴(SEQ ID NO 3)、狗(SEQ IDN0 4)、奶牛(SEQ ID NO 5)、负鼠(SEQ ID NO 6)、小鼠(SEQ ID NO :7 或 8)、大鼠(SEQ ID NO :9)、鱼(SEQ ID N0:10)、蛙(SEQ ID NO 11)等的 FT0 同 源物，或来自其它生物如绿藻的同源物。FT0同源物可以是天然存在的蛋白。FT0多肽具 有的氨基酸序列可以是非天然存在的但与天然存在的FT0序列相比包含单个氨基酸或氨 基酸群的缺失、修饰或添加。例如，FT0多肽可以与SEQ IDN0:1至11中任一个具有至少约 40%，例如至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列同一性。可以对SEQ ID NO 1至11中任一个进行氨基酸取代，例如从约1、2或3个至约 10、20或30个的取代。可以根据例如下表进行保守取代。第二列同一格中的氨基酸、优选 第三列同一行中的氨基酸可以相互取代。 本发明范围内的变体多肽可以通过任何适合方法例如基因改组技术产生。本发明还包括了本发明的多肽的活性部分、片段、衍生物和功能模拟物的应用。多 肽的“活性部分”是指比所述全长多肽短但保留2-0G加氧酶活性的肽。FT0的活性片段通 常可以通过监测2-0G加氧酶活性来鉴定，下文对此有更详细描述。这样的活性片段可以作 为部分融合蛋白包括在内，该融合蛋白例如可包括不同(即异源)配体的结合部分。
所述片段可以具有至少约50个氨基酸或者至多约60、70、80、100、150、200、400或 500个氨基酸。具体而言，但不具限制性，本发明的这一方案可以包含这样的情况蛋白是 完整FT0蛋白序列的片段并可以代表能够将2-0G转化为琥珀酸盐和二氧化碳的催化区。 人、黑猩猩、猕猴、狗、奶牛、负鼠、小鼠、大鼠、鱼和蛙FT0的催化核心如SEQ ID N0:1至11 所示。在一个实施方式中该片段可以包含催化核心和与催化核心N末端相邻的核苷酸识别 巾冒(nucleotide-recognition lid)。该片段可以包含从SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的约第1个氨基酸至约第505 个氨基酸的任何区域，例如从第2、3、4、5或10个氨基酸至第495、500、501、502、503或504 个氨基酸。可用片段包括N末端截短片段，即包含N末端缺失的片段，例如包含如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的第30个残基至第505个残基或第60个残基至第505个残基的片 段；和同时包含N末端截短和C末端截短的片段，例如包含如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列 的第30个残基至第33个残基或第60个残基至第330个残基的片段。其它适合片段可以 通过例如下述方式来容易地鉴定将FT0氨基酸序列与一种或多种已知2-0G依赖的加氧酶 的氨基酸序列比较并鉴别出哪个区域与具有催化活性的区域不同源。具有催化活性的区域 通常被包含在活性片段中。这种片段能够被用于构建嵌合分子。与SEQ ID NO :1的氨基酸序列栏(sequence column)具有至少约60%例如至少 约70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或100 %序列同一性的任何FT0多肽的片段(例如，包括SEQ ID N0 :2至11中任一序列的片段的任何上述天然存在或基因工程序列的片段)(所述片段 具有加氧酶活性)也可以用于本发明的测试并可被涵盖在本文所用术语“FT0多肽”中。可以合成制备FT0多肽。多肽可以被化学修饰或生物化学修饰，例如翻译后修饰。 例如，它们可以被糖基化或包含经修饰的氨基酸残基。所述多肽还可以通过添加组氨酸残 基(通常6个)、或其它序列标签如麦芽糖结合蛋白标签或内含肽(intein)标签来修饰，以 辅助其纯化，或通过添加核定位序列来修饰从而促进向核或线粒体的易位，或通过翻译后 修饰(包括羟基化或磷酸化)来修饰。本发明的多肽可以是GST或其它适合的融合多肽。 还可以通过添加荧光标签(例如绿色荧光蛋白)来修饰FT0多肽从而使其能在细胞或细胞 器中可视化，或有助于纯化蛋白或表达FT0的细胞。这种经修饰的多肽落入术语“FT0多肽” 的范围内。本发明的多肽可以以部分纯化的或基本上分离的形式存在。它们可以与不干扰其 预定用途的载体或稀释剂混合并仍可被视为基本上分离。它们还可以处于基本已纯化的形 式，在此情况下它们通常占制剂的蛋白、多核苷酸、细胞或干物质的至少约90%，例如至少 约 95%、98%或 99%。可以将本发明的多肽用于2-0G依赖的加氧酶活性的测试，从而例如鉴定羟化酶 活性的调节剂如抑制剂或激活剂。抑制剂可以是选择性抑制剂或激活剂。可将FT0多肽用于主底物(即非2-0G底物)不存在的2-0G加氧酶活性测试。还 可以将FT0多肽用来在一种或多种适合底物存在时确定加氧酶活性。此外，本发明提供了 鉴定FT0的底物的方法。本发明的方法中所用的FT0可以是重组FT0或天然存在的FT0。优选的是，在需 要将FT0用于需大量(> lmg)蛋白的用途例如生物物理学测试或高通量分析的情况下，尤 其应使用重组FT0。可以采用包含编码FT0的核苷酸序列的标准表达载体来生产重组FT0。这种表达载体可以按分子生物学技术常规构建，并且例如可能涉及使用质粒DNA和可能需 要的适宜起始子、启动子、增强子和其它元件如多聚腺苷化信号(位于正确方位)从而使蛋 白质表达。其它适宜的载体对本领域技术人员显而易见。关于这一方面进一步的实例可以 参考 Sambrook 等 1989。本发明的方法可利用经修饰而表达本文所限定的FT0多肽的细胞。FT0还可以存 在于细胞提取物中，也可以以部分或基本纯化的形式存在。获得纯化FT0的方法本发明人已发现利用经修改的表达纯化方法可以将重组FT0以可溶的活性形式 表达。本发明人还证明所纯化的重组FT0是2-0G依赖的加氧酶。因此，本发明提供了获得 纯化FT0的方法和测定经纯化的FT0的加氧酶活性的方法。可以通过将包含编码FT0多肽的多核苷酸的表达载体引入宿主细胞来获得纯化 FT0多肽。表达载体按本领域技术常规构建，并例如可能涉及使用质粒DNA和可能需要的适 宜起始子、启动子、增强子和其它元件如多聚腺苷化信号(位于正确方位)从而允许完整蛋 白质表达。适宜的载体对本领域技术人员来说极其显而易见。根据所选的测试方式，启动 子序列可以是可诱导或组成型启动子。启动子可以具有组织特异性。因此将载体中的编码 序列以可操控方式连接于所述元件，从而它们可使编码序列表达(通常在细胞中)。术语 “以可操控方式连接”是指其中所述成分的关系使得它们能以其预定方式发挥功能的邻接。载体可以是例如质粒、病毒或杆状病毒载体。载体通常适于在细菌细胞如大肠杆 菌(E.coli)中使用。载体可具有复制起点。载体可包含一种或多种选择性标记物基因，例 如在细菌质粒情况中可以是氨苄青霉素抗性基因，或对于真菌载体的抗性基因。载体可以 用于转染或转化宿主细胞，例如细菌宿主细胞、真菌宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物如 人宿主细胞、或杆状病毒宿主细胞。细菌宿主细胞优选为E. coli菌株BL21 (DE3)。本发明提供了纯化FT0多肽的生产方法。所述方法通常包括培养包含编码FT0多 肽的表达载体的宿主细胞和从该细胞中分离FT0多肽。通常可以在例如约15°C 约37°C 的温度培养宿主细胞。可以通过裂解细胞并从裂解缓冲液中提取蛋白来分离多肽。裂解缓 冲液通常含有约250mM 约700mM例如约400mM 约600mM (如500mM)的盐如NaCl。本发 明的FT0多肽的生产方法还可以包括将本发明的多核苷酸或载体引入宿主细胞。FT0多肽 包含在裂解细胞培养物时获得的可溶性部分中。可以将多肽从可溶性部分中进一步纯化， 例如通过亲和纯化，如经由与截短的2-0G依赖的加氧酶融合的亲和标签进一步纯化。将多肽和载体引入宿主细胞的方法为本领域中公知，包括但不限于电穿孔和热休 克技术。之后可通过将宿主细胞在适宜温度下培养来实现截短多肽的表达。优选将表达重 组FT0的细胞置于约15°C至约30°C，例如约20°C或约28°C从而诱导重组FT0的表达。当 宿主细胞是细菌如E.coli时，可以将细胞在2TY培养基中培养。在温育期(或生长期)或 在温育期的最后阶段，可以向培养基中添加IPTG。在将细胞离心以去除细胞培养基后，通常使用含高盐水平的裂解缓冲液来裂解 细胞。该缓冲液通常含有约250mmol 约700mmol的如NaCl等盐，例如约400mmol 约 600mmol的NaCl (如500mmol的NaCl)。提取缓冲液可以含有去垢剂，例如Triton X-100和 /或SDS(通常为1%)和/或溶菌酶。裂解缓冲液中可以存在通常浓度为约5% 约20%(如约10% )的甘油。裂解缓冲液的pH通常大于约7. 5，例如约7. 6 约8. 1、约7. 8 约 8.0，更优选为约7. 9。裂解缓冲液可以适于对细胞的超声。裂解缓冲液中还可以存在浓度 为例如约lOmmol 约lOOmmol (如约20mmol)的Tris。裂解后，可对细胞离心。离心后上清液为可溶性部分。可溶性部分中存在的蛋白 浓度取决于所用的提取缓冲液的量。可溶性部分中存在的FT0的量足以使其能被纯化。这 可以通过SDS PAGE来确定。如果通过SDS PAGE可以检测到截短的酶，则存在有足够的酶 用以纯化。可以通过本领域中已知的标准技术来纯化本发明的FT0多肽。例如，当多肽包含 His标签时，可以利用his-结合树脂按照制造商(例如Novagen)的说明、或者通过诸如离 子交换色谱等其它方式来进行纯化。纯化方案可以包含以下步骤。将本发明的表达重组多 肽的细胞沉淀并重悬于适合的缓冲液中，随后超声以破碎细胞。通过离心将细胞碎片与可 溶性物质分离，将可溶性部分载样于his-结合柱。以结合缓冲液和洗涤缓冲液洗涤所述 柱，随后用洗脱缓冲液将所结合的蛋白从柱上洗脱。结合、洗涤和洗脱缓冲液通常均含有 0.5M NaCl。不必添加额外的盐。随后将所洗脱的蛋白浓缩并与凝血酶一起温育(通常以 lUmg-1的浓度在4°C温育16小时)。采用凝胶过滤柱分离经消化的蛋白，从柱上洗脱的FT0 的纯度通常为至少90%或至少95%。可以对用于本文所述的各种测试的纯化蛋白进行脱
Trrt. o测试我们的数据表明FT0可催化2-0G转化为琥珀酸盐和二氧化碳。FT0的这种新发 现的活性首次表明可以进行FT0活性的抑制剂或刺激剂/激活剂的鉴定测试。阻断或激活 FT0的2-0G加氧酶活性将导致重量调节。可以进行任何适合的测试来鉴定FT0加氧酶活性 尤其是2-0G加氧酶活性的调节剂。下面将描述适合的测试的大量不同实施例。在一个实 施方式中，测试利用了本文所述的人FT0多肽。FT0多肽可以以纯化形式或未纯化形式提 供，例如作为细胞提取物或通过从所述提取物中纯化相关多肽提供。作为选择，可以将相关 成分使用重组表达技术表达并纯化以用于所述测试。作为选择，可以将所述成分在细胞中 重组表达以用于基于细胞的测试。测试方法FT0多肽可用于加氧酶活性例如2-0G加氧酶活性的测试。这些多肽还可用于鉴定 可调节(例如抑制或激活)FT0加氧酶活性的试剂的测试。所述方法包括在一种或多种辅底 物以及可选的主底物的存在下，使FT0多肽与测试物质如潜在的抑制剂接触。测试物质和 FT0多肽通常在适于加氧酶活性的条件下接触。适合的辅底物包括氧，例如双氧和2-氧化 酸如2-0G。优选的是，辅底物是2-0G。除了氧或2-氧化酸，还可以使用还原剂如抗坏血酸 盐作为辅底物。在不存在测试物质的情况下使测试的成分在酶对辅底物起作用的条件下接 触并确定辅底物修饰的程度。作为选择，可以监测主底物的氧化。不存在催化转化时还可 以采用检测对FT0结合的测试。所述测试可以利用诸如色谱、NMR、MS或荧光光谱等技术。 辅底物可以被FT0修饰，例如2-0G，也可以被FT0消耗，例如氧或抗坏血酸盐。可以通过测 定甲醛释放来监测去甲基化活性。测定甲醛释放的适合方法为本领域中已知。所述方法例 如 Kleeberg 禾口 Klinger(1982)J.Pharmacol. Methods 8:19—31，Trewick 等(2002)Nature 419 :174-178和Tsukada等(2006)Nature 439 :811_816中所描述。通过对活性增加的测试，测试还可以用于检测可增加2-0G依赖的加氧酶活性的物质。对其它2-0G依赖的加氧 酶，本领域中已经描述了适合的测试。本发明的这些测试可用于鉴定加氧酶活性的抑制剂，因此优选在包括不存在测试 物质时FT0具有加氧酶活性的条件下进行。将存在测试物质时的FT0加氧酶活性与不存在 测试物质时的FT0加氧酶活性比较从而确定测试物质是否是FT0加氧酶活性的抑制剂。或 者，可以利用测试来搜寻FT0加氧酶活性的促进剂，例如通过搜寻与不存在测试物质时进 行的测试相比辅底物转化和/或底物羟基化的增加来搜寻FT0加氧酶活性的促进剂。测试 还可以在加氧酶活性降低或不存在的情况下例如在缺氧条件下进行，在这种条件下可以监 测活性的存在或增加。还可以使用本发明的测试来鉴定对FT0特异的抑制剂或激活剂，所述特异的抑制 剂或激活剂对诸如前胶原羟化酶、人ABH(AlkB同源物)、甲基赖氨酸去甲基化酶、缺氧诱导 因子(HIF)天冬氨酰或脯氨酰羟化酶等其它2-0G加氧酶没有活性或活性较低。反过来，可 以用本发明的测试来鉴定对一种或多种2-0G依赖的加氧酶例如HIF天冬氨酰或脯氨酰羟 化酶等特异、但不抑制FT0的抑制剂或激活剂。本发明的测试还可用于鉴定对特定底物或底物中的残基的FT0活性特异的抑制 剂或激活剂。例如在医药应用中，通常有利的是调节单个酶或一组酶的加氧酶活性。因而可采 用本发明的测试来鉴定可选择性调节FT0相对于另一种2-0G依赖的加氧酶的活性的试剂， 所述另一种2-0G依赖的加氧酶包括但不限于赖氨酰、脯氨酰、天冬氨酰和精氨酰去甲基化 酶、HIF羟化酶、包括FIH、PHD1、PHD2和PHD3、AlkB、ABH1、ABH2、ABH3、前胶原脯氨酰和赖 氨酰羟化酶、磷脂酰丝氨酸受体(Jmjd6)、Mina53和根据SMART数据库已被定性为Jmj域蛋 白的2-0G加氧酶(包括但不限于赖氨酰去甲基化酶)。这种选择性筛选可用于鉴定FT0的选择性抑制剂或其它酶的选择性抑制剂，即对 FT0活性的抑制比对其它酶活性的抑制更强的抑制剂，或对FT0活性的抑制比对其它酶活 性的抑制更弱的抑制剂。当该抑制剂是FT0活性的选择性抑制剂时，它对其它酶的活性可 能没有效果或仅显示出低水平抑制，例如对其它酶活性低于约50%的抑制。当该抑制剂是 非FT0酶的活性的选择性抑制剂时，它对FT0活性可能没有效果或仅显示出低水平抑制，例 如对FT0活性低于约50%的抑制。选择性筛选可以以纯化酶、部分纯化酶(例如在细胞粗裂解物中)或在细胞中进 行。本发明提供了选择性抑制剂在制造用以治疗与2-0G依赖的加氧酶活性(例如FT0 加氧酶活性)改变(即增强或降低)相关的病况的药物中的应用。当一种或多种受测试酶的主底物未知时，也可以使用本发明的方法鉴定选择性抑 制剂。在这种实施方式中，通常一种或多种不希望被抑制的酶是具有未知底物的酶。可以在 不存在底物的情况下，通过确定测试试剂是否影响(例如抑制或刺激)加氧酶导致的2-0G 的转化率来确定测试试剂对加氧酶活性的影响。本发明的测试可以使用可被FT0羟基化或氧化的底物。尤其是，这种底物可被用 于监测FTO 2-0G加氧酶活性的调节剂活性的测试中。该底物可以是肽或核酸底物。核酸 底物可以是DNA或RNA。可以使用寡核苷酸底物。DNA优选是核DNA，但可以是线粒体DNA。优选的是核酸底物在一个或多个残基处被甲基化。可以将可被FT0羟基化或更常见为氧化的任何适合的底物与通常具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列或变体的FT0—起使用。2-0G依赖的加氧酶的一些底物是本领域中已知的。 底物可以是天然存在的蛋白或者重组或合成的蛋白或核酸。可以将包含可被FT0氧化的位 点的天然存在的底物蛋白或核酸的片段和变体用作本发明的测试中的底物。在鉴定FT0或其它加氧酶的选择性抑制剂的测试中，可以对FT0和其它加氧酶使 用不同底物。本发明的方法可用于检测FT0的2-0G依赖的加氧酶活性的新型底物。在这种测 试中，可使用测试底物，检测到羟化酶活性表明已发生测试底物的羟基化，因此该测试底物 是FT0的底物。这种测试可以以经分离成分、半纯化提取物或在完整细胞中进行。测试底物可以是核酸、核酸衍生物或类似物，例如甲基化核酸，也可以是蛋白或 肽，例如甲基化的蛋白或肽。甲基化的核酸、蛋白或肽可能与参与重量调节的基因、蛋白或 肽相关。例如，该核酸可以是基因的一部分或从基因转录的mRNA，或者所述肽或蛋白可由基 因编码。参与重量调节的基因或肽的实例包括野灰基因和野灰相关肽以及神经肽Y基因和 神经肽Y相关肽基因，以及以下肽和编码它们的基因瘦素、阿黑皮素原、食欲素、甘丙肽、 PYY、胆囊收缩素、胰高血糖素相关肽1和胰岛素。可以使用包括但不限于2-0G类似物如N-草酰甘氨酸的FT0活性抑制剂和诸如 锌、镁、锰、钴和镍等过渡金属，通过稳定FT0和底物之间的相互作用，随后鉴定与FT0结合 的底物或结合伴侣来鉴定FT0底物。可以使用标准方法来鉴定底物或结合伴侣。可用的技 术的实例有涉及质谱或者抗体或其它标准试剂和蛋白质组学领域中所用的方法学的技术。 作为选择，可以使用结合测试或基于细胞的测试。调节的监测方法本领域的技术人员可以利用常规技术和知识来改变本发明的任何筛选或测试方 法的确切形式。技术人员明确知道需要额外采用适当的对照实验。本发明的测试可以涉及 监测适宜底物的羟基化、监测底物和辅底物的利用、监测酶及其底物之间预期产物的产生。 本发明的测试方法还可以涉及对体系中成分之间的直接相互作用的筛选。作为选择，可以 进行这样的测试使用适宜的报告物构建体来监测由底物介导的下游效应，例如底物介导 的转录，或者通过监测已知直接或间接受底物调控的基因的上调或基因的表达方式的改变 进行。直接或间接确定加氧酶活性的各种方法是本领域中已知的。可以采用任何适宜的 方法来确定FT0的2-0G依赖的加氧酶活性，例如通过底物或辅底物利用、产物出现如肽/ 核酸羟基化/去甲基化，或由羟基化/去甲基化或非羟基化产物介导的下游效应来确定。在底物羟基化/去甲基化的抑制剂不存在的条件下，可以将底物、酶和潜在的抑 制剂化合物共同温育，并可通过测定底物的羟基化/去甲基化来确定抑制剂的效果。这可 以通过任何适合的方式完成。小的多肽或多核苷酸底物可以回收并用于物理分析，如质谱、 放射照相术或色谱，或者进行功能性分析。这些方法是本领域中已知的，并可以采用常规技 术和知识来实施。例如，可以采用实施例中描述的LC-MS测试。测定可以是定量的或定性 的。在定量或定性测定中，尤其是在定性测定中，可以将定性测定与适合的对照(例如未与 潜在抑制剂温育的底物)比较进行。
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在替代性实施方式中，可以提供其中由底物介导的启动子与报告物基因可操纵连 接的报告物构建体。可以使用任何适合的报告物基因，例如随后可用于比色、荧光、荧光共 振或光谱测试的酶。在本文所述的测试方法中，通常在辅底物如氧和/或2-氧化酸(如2-0G和/或 双氧)的存在下使FT0和底物接触。可以通过测定一种或多种辅底物例如氧、2-0G和/或 抗坏血酸盐的转化来确定羟化酶/去甲基化酶活性。这可以通过确定反应产物如羟基化底 物或琥珀酸的存在和/或量来实现。可以确定相对于底物量的产物量。例如，在这种实施 方式中，底物可以是多肽，并且例如所测定的产物可以是羟基化/去甲基化的多肽或核酸。 例如，通过测定反应中生成的羟基化/去甲基化多肽/核酸、琥珀酸盐、二氧化碳或甲醛的 量，或者通过测定2-0G或双氧的消耗，可以确定羟基化/去甲基化的程度。这些之中任一 种的监测方法可从科学文献中获知，例如Myllyharju等(1991)EMBO J. 16(6) :1173_1180 或 Cunliffe 等(1986)Biochem. J. 240 :617_619。可以用化学试剂将未使用的2-0G衍生化，例如但不限于胼衍生物和邻苯二胺衍 生物，从而得到能够被定量并用于指示测试多肽的羟基化程度的指示性生色团或荧光团。 例如但不限于“Clarke型”电极的溶解氧电极或者利用荧光淬灭的电极可用于追踪测试混 合物中氧的消耗，之后可以以与上述相类似的方式将其用来指示测试多肽的羟基化程度。邻苯二胺(0PD)与2-0G的a -酮酸基序反应的荧光产物是3_(2_羧乙 基)-2(lH)_喹喔啉酮。这种荧光产物使用标准设备即可容易地检测到，例如由Molecular Devices、Tecan、BMG Labtechnologies、asco 禾口 Perkin Elmer 制造的设备，并且有大量先 例证明荧光产物的生成可用于高通量筛选。荧光产物通常用设置为约300nm 约400nm、优选为约335nm 约345nm、最优选 为约340nm的激发滤光器检测。发射滤光器通常为约400nm 约450nm、优选为约415nm 约425nm、最优选为约420nm。这种测试方法使其有利于高通量形式，例如多孔板形式如96孔、384孔或1536孔 板形式。此外，可以通过调节所用衍生化试剂的性质来调整荧光产物的性质。例如，可以使 用1，2- 二甲氧基-4，5- 二氨基苯或1，2-亚甲二氧基-4，5- 二氨基苯来增加该方法的灵敏度。本领域的技术人员可以使用常规技术和知识来改变本发明的任何筛选或测试方 法的确切形式。技术人员明确知道需要额外采用适当的对照实验。通过以0PD或其它芳 香二胺将2-0G衍生化来测定活性，所述其它芳香二胺例如有1，2- 二甲氧基-4，5- 二氨基 苯或1，2-亚甲二氧基-4，5- 二氨基苯，从而使衍生物得到与使用0PD相比改善的灵敏度 (Miihling ^ Journal of Chromatography B (2003) 383-392, Nakamura ^ Chem. PharmBull. (1987)687-692)。可以在适合底物被氧化酶羟基化/氧化的条件下进行测试。因此，测试中存在 2-0G。测试混合物还可以含有铁，优选亚铁。可以向测试混合物中添加其它成分。例如，可以向测试中加入还原剂如抗坏血酸 盐、硫醇如二硫苏糖醇(DDT)、巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸或酚以帮助保持酶结构和/ 或可以加入过氧化氢酶来破坏可能产生的任何H202。不过，在不存在还原剂或过氧化氢酶时测试也可进行。测试通常在约25°C 约40。C的温度，例如约30。C 约39。C或约35°C 约38。C或 约37°C的温度进行。测试混合物的pH通常为约pH 7 约pH 9，例如约pH 7. 5 约pH 8。 可使用诸如Tris或HEPES等合适的缓冲剂来保持测试混合物的pH。通常，测试在正常含氧量条件下进行。也可以在羟基化或氧化减少或者不存在羟 基化或氧化的条件(例如在缺氧条件下)下进行测试，从而检测可增强羟基化/氧化的试 剂对加氧酶活性的调节。作为选择，可以根据从衍生自多肽或核酸底物的底物或底物片段(包括合成的及 重组的肽或核酸)向可检测产物的转变来确定终点。可以修饰底物以便于使测试能够快速 进行并适合于高通量筛选。例如，可以利用在本文中作为示例的反相HPLC(C_4十八烷基硅烷柱)将起 始合成肽底物与产物分离。对这一测试或加氧酶活性的替代性测试的改变可以利用 例如本领域中公知的质谱、光谱和/或荧光技术(Masimirembwa C.等Combinatorial Chemistry & High ThroughputScreening (2001)4 (3)245-263, Owicki J. (2000) J.Biomol. Screen. 5 (5) 297-305, Gershkovich A 等(1996)J.Biochem.& Biophys. Meths. 33 (3) 135-162, Kraaft G.等(1994)Meths. Enzymol. 24170-86)。荧光技术可以利用 按所述方式改性的底物的形式从而进行或者优化光谱或荧光测试。可以采用本领域技术人员任何可用的技术来评定可对羟基化和非羟基化或去甲 基化形式的多肽或其它底物进行区分的分子的结合，这可能涉及确定适合标记的存在。本发明的测试方法还可以采取体内测试或对来自诸如哺乳动物(包括人)或昆虫 等动物的离体细胞进行的测试等形式。测试可以在细胞系如酵母或细菌菌株或者昆虫或哺 乳动物细胞系中进行，在所述细胞系中由引入细胞中的一种或多种载体表达相关的多肽或 肽。作为选择，可以对表达内源性FT0或其中FT0过表达的哺乳动物细胞进行测试。本发明的基于细胞的测试中所用的FT0多肽优选包含核定位信号。测试化合物可利用本文所述的测试方法来筛选的试剂可以是药物筛选程序中所用的天然或 合成化合物。也可以使用包含数种已表征或未表征成分的植物、微生物或其它生物的提取 物。组合文库技术(包括固相合成和平行合成方法学)能够提供测试潜在大量的不 同物质调节相互作用的能力的有效方式。对所有形式的天然产物、小分子和肽(但不限于 此)，所述文库及其应用是本领域中已知的。在某些情况下优选应用肽文库。化合物的各种 商业文库也可获得。存在着能够确定用于抑制的先导结构的筛选这些文库的计算方法(有 时称为虚拟筛选的过程)。潜在的抑制剂化合物(即拮抗剂)可以是多肽或小分子如包括组合文库在内的可 商购文库的分子等。可使用的小分子化合物包括2-0G类似物或可抑制酶的作用的底物类 似物。可使用的小分子化合物及其它类型的化合物包括所有已知的2-0G加氧酶抑制剂，例 如已知可抑制HIF羟化酶(例如见W002/074981和W003/080566)和前胶原脯氨酰羟化酶 的那些抑制剂。可以从种类广泛的可商购来源尤其是小化合物文库来筛选潜在的促进剂。用于筛选的候选化合物中可包括含氧化合物，例如2-0G类似物。现有可用于治疗肥胖症(Cooke 和Bloom，Nature Reviews DrugDiscovery 2006)和2型糖尿病的任何试剂都可影响FTO 的活性并可用作候选试剂。由于包括TCA循环中间体如富马酸盐在内的天然存在的化合物是2-0G加氧酶的 已知抑制剂，它们可能以生理学相关性方式抑制FT0，这包括在其中富马酸盐已知可作为瓦 博效应(Warburg effect)的结果而上调的一些癌症。可以使用本文所述的测试方法来鉴定和/或获得增加、强化、刺激、破坏、降低、干 扰或者完全或部分消除底物的羟基化/氧化并可能由此调节活性的测试化合物。可以在阳性测试试剂不存在时羟基化/氧化受限制或阻止的条件下来鉴定和/或 获得增加或强化羟基化/氧化例如脯氨酰或天冬氨酰羟基化的试剂(即激动剂)。这种试 剂可用于强化、增加、增强或刺激FT0的加氧酶活性。在各种方案中，本发明提供了由本发明的筛选方法鉴定为FT0加氧酶活性调节剂 的试剂或化合物，例如可抑制或降低、增加或强化FT0活性的物质。测试试剂可以在FT0活性位点与2-0G或FT0底物竞争和/或在FT0活性位点结 合金属。测试试剂可以包含金属离子，例如但不限于锰、钴、锌或镍离子。作为选择，抑制的 方式可以是通过变构相互作用。测试试剂可以是还原剂。还原剂通常发挥2-0G加氧酶活性(通常为体外)的激 活剂作用。加氧酶活性的激活剂可以是在体外或体内增加FT0多肽的加氧酶活性的任何物 种。可用的还原剂包括抗坏血酸盐和抗坏血酸盐的类似物以及硫醇化学族的还原剂，如二 硫苏糖醇或者膦(例如三羧乙基膦)。鉴定了调节剂之后，可以将该物质纯化和/或进一步研究(如改性)和/或制造。 可使用调节剂来获得肽基或非肽基模拟物，例如可通过本领域技术人员已知的和本文所论 述的方法来获得。如本文所描述，可以将调节剂改性从而例如增加选择性。它可以在如下 文所述的治疗情况中使用。对于治疗，调节剂可单独使用或与任何其它治疗活性物质或治疗组合使用。作为酸的化合物可以以盐形式存在，例如钠盐。化合物还可以以衍生物形式存在， 例如二甲基酯、二乙基酯、单乙基酯或者二酰胺或单酰胺。在某些情况下，优选这些衍生物， 例如在需要抑制生物细胞内的酶时。可调节2-0G加氧酶的化合物可被用作例如治疗本文所述重量病症的本发明的试 剂，或用作本发明的测试中的测试物质。测试化合物已知可以作为除FT0之外的2-0G加氧 酶的抑制剂。例如，测试试剂可以是前胶原脯氨酰羟化酶、缺氧诱导因子、脯氨酰和天冬氨 酰羟化酶、胶原脯氨酰羟化酶、赤霉素C-20氧化酶、核酸去甲基化酶如AlkB或人类AlkB同 源物、蛋白去甲基化酶如三、二、单甲基赖氨酸或精氨酸残基去甲基化酶、参与代谢或调节 的其它人或动物20G加氧酶或者植物2-0G羟化酶的抑制剂。2-0G加氧酶的许多抑制剂是 已知的，尤其是人脯氨酰羟化酶。N-草酰甘氨酸及其衍生物是适合的实例。甘氨酸或丙氨 酸衍生物和2-氧化酸类似物也可以使用。调节2-0G加氧酶的化合物及这些化合物的家族是本领域中已知的，例如Aoyagi 等(2002)Hepatology Research 23(1) 1-6, Aoyagi 等(2003)Free Radical Biology and Medicine 35 :410Suppl.1，Philipp 等(2002)Circulation 106(19) :1344Suppl. S,
18Ivan 等(2002)PNAS USA 99(21) 13459-13464，Nwogu 等(2001)Circulation 104(18) 2216-2221，Myllyharju和Kivirikko(2001)Ann Med 33(1) :7_21，0hta等(1984)Chemical andPharm Bulletin 32(11) :4350_4359，Franklin 等(2001)Biochem J. 353 :333_338， Franklin(1997) Int J. Biochem Cell Biol 29(1) :79_89，Dowell 等(1993)Eur J Med Chem 28(6) :513_516，Baader 等(1994)Biochem J. 300 :525_530，Baader 等(1994)Eur J Clin Chem and Clin Biol 32(7) :515_520，Bickel等(1998)H印atology 28(2) :404_411， Bickel 等(1991) J. H印atology 13 :S26_S34Suppl. 3，US 6，200，974，US 5，916，898，美国 专利申请 2003-0176317，2003-0153503 和 2004-0053977，W0 02/074981，W003/080566, W0 04/035812, Cunliffe 等(1992)J. Med. Chem. 35 :2652_2658，Higashide 等(1995) J. Antibiotics 38 :285_295，Cunliffe等(1986)Biochem. J. 239(2) :311_315，Franklin等 (1989) Biochem. J.261 (1) : 127-130，Friedman等(2000)PNAS USA 97(9) :4736_4741，Wu等 (1999)J. Am. Chem. Soc. 121 (3) :587_588，DE-A-3818850, Wang 等(2001)BiochemistryUS 15676-15683 和 Lerner 等(2001)Angew Chem. Int. Edit 40 =4040-4041 W003/080566和W002/074981中公开了适合的测试化合物。其它适合的化合 物包括纤维蛋白原HIF羟化酶的抑制剂。纤维蛋白原HIF羟化酶抑制剂公开于美国专 利申请公报第 20070042937 号、第 20060276477 号、第 20060270699 号、第 20060258702 号、第 20060258660 号、第 20060251638 号、第 20060183695 号、第 20060178317 号和第 20060178316 号。其它适合的测试化合物包括式(I)的化合物 其中-Y2选自-0R'和-NR' R"，其中R'是氢或未经取代的烷基并且R"是氢、羟 基或未经取代的Ci_4烷基；-Y1 选自-C-、_S-和-S(0)_ ；-Z2选自-C(0)-和-NR" _，其中R"选自氢、羟基或未经取代的烷基；-Z1选自氢和未经取代的(V4烷基；和-R是天然存在的氨基酸的侧链。优选Y1是-C-并且Y2是-0H或_NH2。最优选Y1是_C_并且Y2是-0H。优选Z2是-C(0)_或-NR 〃 _，其中R 〃是氢、甲基或乙基。更优选Z2 是-c(0)-或-NH-。Z1优选是氢、甲基或乙基，更优选是氢。最优选Z2是-C(o)-并且Z1是 氢、甲基或乙基。优选R是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸的侧链。优选R是缬氨酸、亮氨酸或 苯丙氨酸的侧链。更优选R是苯丙氨酸的侧链，即_CH2Ph。可以使用这些化合物的L-立体异构体或D-立体异构体。用于获得式(I)的测试化合物的示例性合成流程图如下面的流程图1所示。这里 氨基酸与草酰氯反应从而产生式(I)的化合物。该流程图中所用的氨基酸是苯丙氨酸，不过显而易见的是用其它氨基酸可发生相同的通用性反应。第一个反应生成了本发明的受保 护化合物(二甲基酯形式)。通过与氢氧化钠水溶液的反应容易生成二酸形式。流程图1 其中X是-0-或-S-或者Z不是-C0-C0-0H的化合物可以如Mole等(2003) Bioorg. Med. Chem. Lett. 13，2677-2680 和 Cunliffe 等 J. Med. Chem. (1992) 35 2652-2658 所述来合 成。克雷布斯循环中间体如琥珀酸盐和富马酸盐可发挥FT0去甲基化酶活性抑制剂 的作用。因此琥珀酸盐和富马酸盐的类似物可用于抑制FT0活性。治疗性应用所发现具有影响FT0的加氧酶活性的能力的化合物、物质或试剂在所论述的多种 情况中具有治疗和其它潜力。尤其是FT0活性的调节剂可用于治疗或预防与重量增加或重 量减轻相关的疾病。所述调节剂可预防或逆转超重患者的重量增加。所述调节剂可以预防 重量减轻或促进过轻患者的重量增加。所述调节剂还可以施用于重量在正常健康范围内的 个体(通常体重指数为约19 约25)从而预防重量增加，例如在这些个体带有FT0基因的 等位基因变体且所述等位基因变体与肥胖症相关的情况中，在此实施方式中，使用调节剂 预防重量增加和相关的疾病或病症。可通过施用FT0活性调节剂来治疗或预防的与重量增加相关的疾病和病症包 括肥胖症(体重指数超过30)、癌症(尤其是结肠癌、前列腺癌、直肠癌、乳癌和子宫内膜 癌)、心血管疾病(包括心脏病和充血性心衰)、高血压、高胆固醇水平、胰岛素抵抗、II 型糖尿病、胆结石、睡眠窒息、骨关节炎、痛风、血脂异常、匹克威克综合征(Pickwickian syndrome)禾口不育。可通过施用FT0活性调节剂来治疗或预防的与重量减轻相关的病症包括神经性 厌食症、贪食症(bullemia)、营养不良、骨质疏松、不育、免疫功能受损、AIDS或抗癌治疗患 者的重量减轻。FT0活性的调节剂还可以用于治疗或预防癌症。这是因为FT0的修复DNA的能力。对于治疗，可以将FT0调节剂与例如用以治疗重量控制、糖尿病和心血管疾病的 任何其它活性物质组合使用。对于使用一种或多种经初级筛选(例如在无细胞体系中)鉴定为具有调节加氧酶 活性能力的试剂，可以使用一种或多种二次筛选来进一步评估。通常将作为本发明的调节剂的试剂、化合物或物质以分离的和/或纯化(即基本
纯)的形式来提供。这可以包括处于其中它代表至少约90%活性成分、更优选至少约95%、
更优选至少约98%组合物中。不过，任何这种组合物可以包含惰性载体材料或其它药学和
生理学可接受的赋形剂，例如正确递送、释放和/或稳定活性试剂所需的那些载体和赋形
剂。如下所述，除了所公开的调节剂化合物之外，本发明的组合物可以包含一种或多种有治
疗用途的分子，所述治疗用途例如有重量控制、糖尿病和心血管疾病的治疗。
本发明的测试获得的产物本发明还提供了通过本发明的测试方法获得的化合物和包含所述化合物的组合 物，例如其中所述化合物与药学可接受载体或稀释剂混合的药物组合物。例如“Harrison's Principles of Internal Medicine”中给出了适合的载体或稀释剂的实例。载体可以是液 体，例如盐水、乙醇、甘油和它们的混合物，也可以是固体，例如片剂形式，还可以是半固体 形式，例如配制为长效制剂的凝胶，也可以配置在透皮施用载质中，例如透皮药贴。本发明还提供了治疗方法，所述方法包括对患者施用可干扰FT0加氧酶活性的药 剂。这种药剂可以包括FT0加氧酶活性的抑制剂或激活剂。治疗/预防目的可以涉及治疗与FT0水平或活性降低或不理想或增加相关的病 况，或FT0水平正常但希望调节活性例如增加或降低FT0加氧酶活性的病况。例如，在治疗 与非理想的重量减轻或增加相关的病症中可以调节FT0活性。对有需要的受试者通常施用治疗有效量的药剂。治疗有效量是改善病况的症状或 减轻病况给受试者带来的痛苦的量。用以治疗或预防重量增加或诸如肥胖症等与重量增 加相关病症的治疗有效量通常是减少重量增加的量，例如保持患者重量或引起重量减轻的 量。作为选择，治疗有效量可以是引起重量减轻的量。用以治疗或预防重量减轻或诸如厌 食症等与重量减轻相关的病症的治疗有效量通常是减少重量减轻的量，例如保持患者的重 量或引起重量增加的量。药物组合物在各种进一步的方案中，本发明因而提供了药物组合物、药物、药品或用于所述 目的的其它组合物，所述组合物包含如本文所述的一种或多种试剂、化合物或物质(包括 2-0G依赖的加氧酶活性的抑制剂或激活剂)；所述组合物在医学治疗方法中的应用，所述 医学治疗方法是包括对患者施用所述组合物从而例如治疗(可包括预防性治疗)上述医学 病况的方法；在制造出于任何所述目的而施用的组合物、药物或药品中所述试剂化合物或 物质的应用，所述目的例如为治疗本文所述的病况；以及药物组合物的制造方法，所述方法 包括将所述试剂、化合物或物质与药学可接受赋形剂、载质或载体以及可选的其它成分混
口 o在一个实施方式中，提供药物组合物的方法通常可以包括(a)通过本发明的测试方法鉴定出试剂；和(b)将由此鉴定的试剂与药学可接受赋形剂配制。本发明的药物组合物可以包含本发明的试剂、多肽、多核苷酸、载体或抗体以及药 学可接受赋形剂。本发明的医学治疗方法中所用的试剂无论怎样，均优选以“预防有效量”或“治疗 有效量”施用(视情况而定，不过预防也可被看做治疗)，这足以显示出对个体的益处。所 施用的实际量和施用的速率和时程将取决于待治疗疾病的性质和严重性。治疗的处方如剂 量的确定等属于全科医师和其它医学医生的职责。根据待治疗的病况(例如上述病况)，试剂或组合物可以单独施用，也可以与其它 治疗同时地或依次地组合施用。除了活性成分之外，用于本发明的应用的本发明的药物组合物可以包括药学可接 受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员熟知的材料。尤其是它们可以包括药学可接受赋形剂。所述材料应该无毒并且不会干扰活性成分的功效。载体或其它材料的 准确性质将取决于施用途径，施用途径可以为口服或注射，例如皮肤、皮下或静脉内注射。用于口服施用的药物组合物可以为片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可以包括 固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物油或植物油、 矿物油或合成油。可以包含生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或者二醇类如乙二醇、丙二 醇或聚乙二醇。对于静脉内、皮肤或皮下注射或在受累位点的注射，活性成分应该处于无热源且 有适合PH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受水溶液的形式。利用例如等渗载质如Sodium Chloride Injection、Ringer‘ s Injection、LactatedRinger' s Injection，本令页域技术 人员能够很好地制备适合的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和 /或其它添加剂。在载体配制中可以使用脂质体，尤其是阳离子脂质体。上述技术和方案的实例可 见于 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，第 16 片反，Osol，A.(编)，1980。可以将所述物质或组合物以局部方式施用于特定位点，也可以利用例如基于动脉 内支架的递送将所述物质或组合物以其中它靶向特定细胞或组织的方式递送。通过使用靶向系统如抗体或细胞特异性配体，可利用靶向性治疗将活性物质更加 特异性地递送至某些类型的细胞。需要靶向的原因可能有多种，例如试剂具有不可接受的 毒性，或者否则就需要过高剂量，或者否则其就不能进入靶标细胞。在另一实施方式中，本发明提供了本发明的试剂在用于治疗与FT0加氧酶水平或 活性的增加或降低相关的病况的药物的制造中的应用。所述病况可以包括例如与重量减轻 或增加相关的疾病。本文中所引用的所有文件以参考方式并入本文。下面的实施例将阐述本发明。实施例实施例1 选择作为2-0G加氧酶用以分析的FT0利用二级结构预测(JPRED)和序列保守性的组合生成了 Fatso与ABH3的序列 比对，从而以M0DELLER8V2建立了基于已报导的ABH3晶体结构(Sundheim等(2006)EMB0 J. 25(14)3389-3397)的FT0的同源模型。然后将FT0模型与来自大肠杆菌的ABH3和AlkB DNA去甲基化酶(Yu等(2006)Nature，439，879-884)叠加以进行比较。序列比对、二级结构 预测和结构模型清楚地显示出这三种蛋白之间的强相似性。FT0中清晰地存在DSBH构架并 且单个活性位点Fe (II)和20G结合残基严格保守(例如，His231 FT0，Hisl91 ABH3，Hisl31 AlkB ；Asp233 FT0, Aspl93 ABH3, Aspl33AlkB ；His307FT0, His257ABH3, Hisl87AlkB ； Arg316FT0，Arg269ABH3，Arg204AlkB)。此外，存在着参与催化机制的残基(即Arg322FT0， Arg275ABH3 和 Arg210AlkB ；Leu213FT0 和轻基化 Leu 177ABH3)以及经预测参与 DNA 碱基 识别的芳香残基(Tyrl08FT0和Tyrl43ABH3)。于是FT0序列经检测为AlkB同源物(ABH)和其它已知2_氧化戊二酸依赖的加氧 酶(其中一些催化甲基化核酸序列的去甲基化)的同源物，并发现FT0序列含有双链3螺 旋(DSBH)基序和至少一个C末端螺旋域。DSBH基序是2-0G依赖的加氧酶的特征，但许多不是2_0G依赖的加氧酶的蛋白也含有DSBH基序。这些蛋白包括但不限于JmjC家族，其中一些但不是所有是2-0G依赖 的加氧酶(Clissold & Ponting(2001) Trends Biochem. Sci. 26 :7_9)。DSBH 基序也是功 能多样的cupin超家族的特征(Dunwell等(2004)Phytochemistry 65:7-17)。人类蛋白 pirin(Pang 等(2004) J. Biol. Chem. 279 1491-1498)也含有 DSBH 基序，但不是 2-0G 依赖 的加氧酶。一种含有DSBH基序的2-0G依赖的加氧酶是FIH。此前将FT0的等位基因变体 与重量增加相关联，但FT0此前并未被鉴定为2-0G依赖的加氧酶，也未鉴定其含有DSBH结 构基序。还不知道FT0的C末端螺旋域与20G加氧酶有关。序列分析还证明FT0展示了用于结合Fe(II)的保守2-His_l-羧酸酯面三联体 (facial triad)和碱性残基(此处为精氨酸)等2_0G铁-依赖的加氧酶的特征，以及可将 其归类为以AlkB为代表的2-0G加氧酶亚家族的其它特征。实施例2:FT0的克隆利用带有限制位点突出端的商业合成的寡核苷酸引物(Sigma-Genosys) mftolf (序列5，-GCTAGCATGAAGCGCGTCCAGACC-3，)和 mftolr (序列5，-GAATTCCTAGGATC TTGCTTCCAGCAG-3，)在下述 PCR 反应中从 Image clone IMGCL04237261 扩增了编码全长小 鼠fto的cDNA序列，条件模板 DNAmftolf (10 UM)mftolr (10 uM)MgCl2 (50mM)dNTP，s (各 lOmM)10 X聚合酶缓冲液PfuTurbo DNA 聚合酶H20 加至总体积为温度循环仪设定95 V 2 分钟
95 °C 1 分
50°C 1 1jY
72°C 2.5 72 °C 10 分钟以QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对完成的PCR反应进行净化，并以TAE缓 冲液使样品在琼脂糖凝胶上泳动。将PCR产物以Nhel和EcoRI (均为New England Biolabs)于37°C在过夜反应中消化DNAlugNhel (10000 单位 /ml) 2 u 1EcoRI (20000 单位 /ml) 2 u 1IOXEcoRI 缓冲液5 ill
23
150ng 1 u 1 1 u 1 1 u 1 1 u 1 5u 1 1 u 1 50 u 1
(New England Biolabs)
(聚合酶缓冲液获自Stratagene)
1'、
/
>
25个循环
分钟
100XBSA0.5 illH20加至总体积为50 ill随后将反应混合物在TAE缓冲液中在1 %琼脂糖凝胶上泳动，切下对应于经消化 的PCR产物的条带，以QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶中提取DNA。使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)在冰上过夜将所提取的DNA连接到相 似限制性切割的纯化pET_28a载体(Novagen)中载体50ngPCR 产物42ng10XT4 缓冲液2 illT4DNA 连接酶(400000 单位 /ml) 0. 5 u 1H20加至总体积为20 ill根据制造商的说明将4 ill的这种反应混合物转化到50iU E. coliXLlOGold cells (Stratagene)中。使细胞在含有25 y g/ml卡那霉素的LB平板上于37°C生长过夜。在其后一天，从平板挑取8个菌落，每个都重悬在含25 iig/ml卡那霉素的5ml 2YT 培养基中并在环境振荡器中37°C温育过夜。在其后一天，使用QIApr印Spin少量制备试剂盒(QIAGEN)从这些液体培养物中 分离质粒，并以EcoRI和Nhel在37°C对样品进行检验性限制性消化3小时少量制备的DNA3 illNhel (10000 单位 /ml)1 u 1EcoRI (20000 单位 /ml)1 u 1lOx EcoRI 缓冲液2 u 1lOOx BSA0. 2 u 1H20加至总体积为20 ill以琼脂糖凝胶分析样品，发现样品含有mfto插入。对一个样品进行外部测序 (Geneservice)，表明其含有所需的插入。该质粒被称为mfto-pET_28a。实施例3 :FT0的表达与纯化按照制造商的说明将Mfto-pET_28a 转化入 E. coli BL21_Gold(DE3) (Stratagene)中，并使其如上在含有卡那霉素的LB平板上生长。表达试验表明在37°C、 28°C和21°C有中等的可溶性表达，且随着温度的降低不溶性材料的量减少。对于表达，从转化平板上挑取单个菌落，重悬于100ml 2YT+卡那霉素培养基中并 在环境振荡器中于37°C培养过夜。在其后一天，将12个600ml 2YT+卡那霉素每一个以6ml 过夜培养物接种，并在环境振荡器中于37°C生长，直至培养物达到0D_为1.0。在此阶段， 将培养物移至21°C 1小时，之后在每个中加入IPTG至终浓度为0. 25mM。继续在21°C温育 9小时，之后离心收集细胞(共60g)并储存于-80°C。将细胞沉淀按每克细胞重悬浮于5ml含1刮勺头DNAsel的lOmMHEPES pH 7. 5， 0. 5M NaCl，10mM咪唑，ImM MgCl2中。加入30mg苯甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制剂)，在冰 上超声裂解细胞。离心去除碎片(Beckman Avanti J-25离心机，JA25. 50转子，22000rpm， 20分钟，4°C )，之后慢慢倾出上清液，通过0.45um Omni pore过滤器(Millipore)过滤， 开以 0. 5ml/ 分钟的流速载于 10ml His-Bind*柱(Novagen)。用 250ml 的 10mM HEPES pH7. 5,0. 5M NaCl,40mM咪唑以2ml/分钟洗涤所述柱，之后用100ml的25mM HEPES pH 7. 5， 0. 5M NaCl,40mM咪唑，5mM ATP 二钾盐以2. 5ml/分钟洗涤这一步骤将去除与His标签和 Fto蛋白之间肽连接物结合的E. coli分子伴侣。以100ml初始洗涤缓冲液再次洗涤之后， 使用35ml 10mM HEPES pH 7. 5,0. 5M NaCl，500mM咪唑以2. 5ml/分钟通过等度洗脱将结合 的蛋白洗脱。使用Amicon-15 5000分子量截留超滤装置将含有FT0的流分(经SDS PAGE分析 纯度> 90% )浓缩至3ml终体积，并装载到以lOmMHEPES pH 7. 5,0. 05M NaCl, ImM DTT平 衡的300ml Superdex S200凝胶过滤柱上。以3ml/分钟进行凝胶过滤步骤，从70ml洗脱 体积处开始收集10ml的流分。实施例4 以纯化FT0进行2_氧化戊二酸脱羧测试利用2-0G 转化测试(Kivirikko 和MyllylS (1982)Methods inEnzymology 82: 4412-4421)来测试FT0的酶学活性。在不含特定试剂(Fe2+、抗坏血酸盐或DTT)的各种缓 冲液中，在浓度为0.5mM的常用Fe2+-20G-双加氧酶抑制剂N-草酰-甘氨酸(N0G)的存在 下，将FT0与所有必需的辅因子温育。除了 Fe2+ (以(NH4) 2Fe (II) (S04) 2形式加入)和20G之 外，向反应混合物中加入二硫苏糖醇(DTT)和抗坏血酸钠DTT是帮助保持Fe2+的还原剂。测试成分11. 5uM FT0144 uM 20G16 u M14C-20G 80 uM(NH4) 2Fe (II) (S04) 2ImM DTT4mM抗坏血酸盐将这些以50mM TRIS，pH 7. 5稀释至100 yl的总体积。将所有试剂混合并移 液至5ml塑料螺旋盖管中，向管中逐滴加入FT0。向各个管中加入含200 ill氢氧化海 胺(Fisher Scientific，C02捕提剂)的500 ill Eppendorf管，并以橡胶隔膜将管封 闭。在环境振荡器中于37°C温育半小时，之后向内容物中加入200 yl甲醇并将管置于冰 上30分钟以结束反应。将含有氢氧化海胺的Eppendorf管转移至闪烁计数瓶中，与5ml OptiPhase Li qui dScint illation Cocktail (Fisher Scientific)混合并使用 Beckman LS6500Multi-Purpose Scintillation Counter 对总 14C 计数进行定量。第一项测试的结果如下表1 (完全计数_总起始2-0G计数)和图所示4。结果显 示FT0的2-0G转化活性受辅因子Fe (II)刺激，并被N-草酰甘氨酸抑制，N-草酰甘氨酸是 许多2-0G加氧酶的抑制剂。加入抗坏血酸盐也可以刺激活性，这与其它2-0G加氧酶相同， 抗坏血酸盐可能作为天然底物的替代物而发挥作用。以FT0进行的20G非偶联转化测试监测[1-14C]-20G转化为[14C]-二氧化碳，该 测试表明FT0催化20G脱羧，该反应可被抗坏血酸盐和FeS04刺激(图8a)。已知的20G加 氧酶抑制剂(图8b)和Fe(II)与抗坏血酸盐的缺少抑制了 20G转化。表1 :2_氧化戊二酸脱羧测试结果 实施例5 应用2-0G加氧酶测试检测FT0抑制剂利用实施例4中描述的方法，筛选各种2-0G加氧酶抑制剂抑制活性FT0加氧酶活 性的能力。所测试的抑制剂有 NOG = N-草酰甘氨酸N0FD = N-草酰D-苯丙氨酸P-2-4-CD-吡啶 _2，4_ 二羧酸盐P-2-4-CD-吡啶 _2，5_ 二羧酸盐化合物41和化合物16的结构如下所示。 实施例6 去甲基化测试利用实施例2所述方法，但只使用未标记的20G，筛选出可被FT0去甲基化的各种 潜在底物。结果如图5和图6所示。该结果表明，在所用测试条件下，FT0在对3-甲基胸 腺嘧啶和3-甲基胞嘧啶残基去甲基化的催化中偏好3甲基胸腺嘧啶残基。对潜在FT0底物进行了筛选，其中包括合成单链1-甲基腺嘌呤(1-meA)甲基化寡 核苷酸、Lys-9甲基化组蛋白H3、缺氧诱导因子-la (HIF-1 a )亚基片段、Ik Ba和辅酶A 衍生物。只有1-meA甲基化寡核苷酸显著刺激20G的转化(图6a)。这一活性被N-草酰甘 氨酸、富马酸盐和琥珀酸盐抑制，它们也是20G非偶联转化测试的抑制剂(图6c)。利用直接监测DNA去甲基化的LC-MS测试(不需要放射性标记的(辅)底物或偶 联测试)，我们证明FT0可催化依赖Fe (II)和20G的DNA去甲基化。这一活性可被抗坏血 酸盐刺激，这与对其它20G加氧酶的观察相同(图6b)。当反应在氧减少的条件下进行时， 观察到显著减少的转化。通过1H NMR(400MHz)分析证实了琥珀酸盐的生成，通过以五氟苯胼的衍生化确认了甲醛的生成。为了检验已归属的Fe(II)结合和20G 5_羧酸酯结合残基的所推测的作用，构建 了 His-304和Arg-313丙氨酸取代突变体。His-304突变体显示了显著减少的20G转化，而 Arg-313突变体消除了活性(图6b)。利用下述在单一位置甲基化的单链寡核苷酸(ss-DNA)进一步研究了 FT0活性 1-甲基腺嘌呤(l-meA)、l-甲基鸟嘌呤(l-meG)、3-甲基胞嘧啶(3_meC)和3-甲基胸腺嘧 啶(3-meT)(图7b)。当pH 7. 5时，在测试条件下显示出，相比于ss_DNA中1-meA或3_meC， FT0优选3-meT ； 1-meG不是FT0的底物(图7a)。与此前报导一致，我们利用ss_DNA底物 发现重组形式的ABH2和ABH3显示出对3_meC和1-meA及3_meT的偏好，而在我们的条件 下观察到只有极低水平的3-meT去甲基化。在测定甲醛从甲基化多聚(dA)和多聚(dT)释 放的测试中，也观察到FT0对3-meT底物的偏好(图7c)。实施例7 :FT0的定位由于FT0催化DNA去甲基化，因此推测其应定位到核。确实，共聚焦成像表明黄色 荧光蛋白标记的FTO(YFP-FTO)在核中浓缩，而YFP自身仅存在于细胞质中。有趣的是，FT0 向核中的定位甚至比ABH3更有效。20G加氧酶催化的翻译后羟基化是缺氧反应中转录调控的核心，并且20G加氧酶 可催化组蛋白去甲基化。FT0的催化活性通过核酸去甲基化可以相似地调控参与代谢的基 因的转录。或者，可能FT0与对ABH2提出的一样，能够行使核酸修复酶的作用有证据表明 基因组修复过程的破坏将导致肥胖症和代谢综合征。在以上所用的测试条件下，在生理PH 下，所鉴定的FT0的优选底物为DNA中的3-甲基胸腺嘧啶，这是在DNA接触甲基化试剂时 生成的微小但稳定的损伤。
权利要求
一种测试FTO活性的方法，所述方法包括监测FTO多肽的加氧酶活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中将氧用作辅底物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将铁用作辅因子。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中将2-氧化酸用作辅底物。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将2-氧化戊二酸用作辅底物。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在还原剂的存在下监测加氧酶活性。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述还原剂是抗坏血酸盐或其类似物、硫醇或膦。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在底物的存在下测定加氧酶活性。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述底物是肽或核酸底物。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FT0多肽是重组多肽。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FT0多肽包含(a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；或(b)与SEQID NO 1的氨基酸序列在其全长有至少40%同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述与SEQID NO :1的氨基酸序列在其全长有至 少40%同一性的氨基酸序列是人类FT0的天然存在的变体或来自除人之外其它物种的FT0 的同源物。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述与SEQID NO :1的氨基酸序列在其全 长有至少40%同一性的氨基酸是SEQ ID N0:2至SEQID NO :11中任一项所示的氨基酸序 列。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括(i)使FT0多肽与测试试剂接触；(ii)在测试试剂的存在下监测加氧酶活性；和(iii)确定所述测试试剂是否是FT0活性的抑制剂或激活剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述测试试剂是除FT0之外的2-0G加氧酶的已报 导的抑制剂，或所述抑制剂的类似物或变体。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述2-0G加氧酶是前胶原脯氨酰或赖氨酰羟化 酶、缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶、包括组蛋白去甲基化酶在内的甲基化赖氨酰去甲基化酶、 天冬氨酰羟化酶、磷脂酰丝氨酸受体(Jmjd6)、AlkB或人类AlkB同源物和/或赤霉素C-20 氧化酶。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述抑制剂是N-草酰氨基酸如N-草酰甘氨 酸或其衍生物、甘氨酸或丙氨酸衍生物、2-氧化酸类似物、类黄酮或类黄酮衍生物如染料木黄酮。
18.如权利要求14 17中任一项所述的方法，其中所述测试试剂在FT0活性位点与 2-0G或FT0底物竞争，和/或在FT0活性位点结合金属。
19.如权利要求14 18中任一项所述的方法，其中所述测试试剂包含金属离子。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述测试试剂是还原剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述还原剂是除FT0之外的2-0G加氧酶的已报导 的激活剂。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述还原剂是抗坏血酸盐或抗坏血酸盐的类似物或者硫醇类还原剂，例如二硫苏糖醇或膦化学族的成员。
23.如权利要求14 22中任一项所述的方法，所述方法还包括使用除FT0之外的酶 重复所述方法的步骤；和确定所述测试试剂是否选择性抑制或激活FT0或其它酶。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述除FT0之外的酶是2-0G加氧酶。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述2-0G加氧酶是缺氧诱导因子羟化酶，如脯氨 酰或天冬氨酰羟化酶、胶原或前胶原脯氨酰羟化酶、核酸去甲基化酶如AlkB同源物、或者 蛋白去甲基化酶如三甲基、二甲基或单甲基赖氨酸或精氨酸残基去甲基化酶。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白去甲基化酶将甲基化组蛋白或其片段羟 基化。
27.如权利要求8 26中任一项所述的方法，其中所述底物是核酸、核酸衍生物或类似物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述底物是甲基化核酸、衍生物或类似物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述甲基化核酸序列与参与重量调节的基因相 关，例如野灰基因或神经肽Y基因。
30.如权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括(i)使FT0多肽与测试底物接触；(ii)监测加氧酶活性；和(iii)确定所述测试底物是否是FT0的底物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述测试底物是人类核酸序列。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述核酸序列包含3-甲基胸腺嘧啶碱基、1-甲基 腺嘌呤碱基或3-甲基胞嘧啶碱基。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述底物是甲基化蛋白或肽。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中在鉴定所述底物之前使用FT0抑制 剂使得能够通过稳定FT0和所述底物之间的相互作用来鉴定FT0底物。
35.2-0G加氧酶活性抑制剂或激活剂的调节FT0活性的应用。
36.用以在治疗或预防重量增加或重量减轻或者治疗或预防与重量增加或重量减轻相 关病症的方法中应用的FT0加氧酶活性的调节剂。
37.如权利要求36所述的调节剂，所述调节剂是如权利要求15 22中任一项所限定 的抑制剂或激活剂。
38.如权利要求36所述的调节剂，所述调节剂是可通过如权利要求23 26中任一项 所述的方法鉴定的FT0加氧酶活性的选择性调节剂。
39.治疗或预防有需要的个体的重量增加或重量减轻的方法，所述方法包括对所述个 体施用治疗有效量的FT0加氧酶活性的抑制剂或激活剂。
40.治疗或预防有需要的个体的与重量增加或重量减轻相关病症的方法，所述方法包 括对所述个体施用治疗有效量的FT0加氧酶活性的抑制剂或激活剂。
41.如权利要求40所述的方法或如权利要求36 38中任一项所述的调节剂，其中 所述与重量增加相关的病症是肥胖症、癌症、心血管疾病、高血压、高胆固醇水平、胰岛素抵 抗、糖尿病、胆结石、睡眠窒息、骨关节炎、痛风、血脂异常、匹克威克综合征和/或不育，或 者所述与重量减轻相关的病症是神经性厌食症、贪食症、营养不良、骨质疏松、不育和/或免疫功能受损。
42.如权利要求41所述的方法或调节剂，其中所述与重量增加相关的病症是肥胖症或 糖尿病。
全文摘要
本发明提供了测试加氧酶活性的方法，所述方法包括监测FTO的加氧酶活性。
文档编号G01N33/50GK101855551SQ200880021055
公开日2010年10月6日 申请日期2008年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者克里斯多佛·保罗·庞廷, 克里斯多佛·约瑟夫·斯高菲尔德, 弗朗西丝·玛丽·阿什克罗夫特, 托马斯·吉肯 申请人:Isis创新有限公司