用于早期妊娠诊断的组合物和方法

专利名称：用于早期妊娠诊断的组合物和方法
用于早期妊娠诊断的组合物和方法相关申请的交叉参考本申请要求享有美国临时申请61/013，603(2007年12月13日提交)的优先权， 该美国临时申请的完整公开内容通过参考引入本文。
背景技术：
I.发明领域本发明总的涉及兽医、生殖生物学和诊断学领域。更具体地说，本发明涉及用于检 测早期妊娠的方法和组合物。II.相关技术妊娠诊断允许乳品和牛肉工业进行有效的繁殖管理。通常，人工授精的成功率不 到50%，生产者必须依赖于恢复到发情期的明显迹象(容易忽略)或推迟再繁殖直到通过 上述方法之一证实妊娠失败。这样的推迟具有极高的代价，并且构成了工业的主要经常损失。长期以来一直在寻找可以早期进行并且具有低假阳性的用于牛的准确的妊娠 试验。可以采用几种妊娠试验，包括牛奶孕酮分析(Oltenacu等人，1990 ;Markusfeld 等人，1990)、雌酮硫酸酯分析(Holdsworth等人，1982 ；Warnick等人，1995)、直肠触诊 (Hatzidakis 等人，1993)、超声(Beal 等人，1992 ；Cameron 和 Malmo，1993)和妊娠特异性抗 原的血液检验。这些方法中的每一种在实际的现场使用方面都达不到预期。例如，第18-22天 前后对牛奶或血清孕酮的检测产生高得不可接受的假阳性率(Oltenacu等人，1990; Markusfeld等人，1990)。直肠触诊可以用来早在第35天检测妊娠，但是该方法可导致 5-10%或更高的胚胎死亡率(Oltenacu等人，1990 ;Hatzidakis等人，1993)。第50天的 直肠触诊对胚胎有较小的伤害，但是由于太晚而只有极小的经济价值(Oltenacu等人， 1990)。超声波检查相对于直肠触诊在准确性方面具有优点，特别是在第45天之前(Beal 等人，1992 ；Cameron和Malmo, 1993)，但是设备昂贵，其应用需要大量的培训，并且对动 物有有限的风险。一种相关的方法，多普勒超声波检查，比直肠触诊更准确(Cameron和 Malmo, 1993)，但是仍然需要训练良好的人员。尿或血清中雌酮硫酸酯的存在提供了另外一 种检验，但是只在第100天后随着浓度升高才有用(Holdsworth等人，1982 ；ffarnick等人， 1995)。妊娠特异性蛋白B(PSP-B)的发现(Butler等人，1982)提供了一种新的妊娠诊断 方法，因为它可以在妊娠第4周的怀孕母牛的血液中检测到(Sasser等人，1986 ；Humblot 等人，1988)。其他人开发了基于相同或免疫学相似抗原的免疫测定(Zoli等人，1992a; Mialon等人，1993 ；Mialon等人，1994)。在一种情况中，抗原(Mr 67kDa)被称为牛妊娠相 关糖蛋白(boPAG ；现在称为boPAG-1) (Zoli等人，1992a)；在第二种情况中，它被称为妊娠 血清蛋白 60(PSP60) (Mialon 等人，1993 ；Mialon 等人，1994)。对于 PSP_B/boPAGl/PSP60 的 免疫测定具有某些缺点。首先，妊娠第4周的阳性诊断仍然有一些不确定性，因为血液中的 抗原浓度低而且有些不稳定。第二，boPAGl浓度到期显著升高(Sasser等人，1986 ；Zoli等人，1992a ；Mialon等人，1993)，并且由于该分子的循环半衰期较长(Kiracofe等人，1993)， 在产后80-100天仍然可以检测到该抗原(Zoli等人，1992a ；Mialon等人，1993 ；Mialon等 人，1994 ；Kiracofe等人，1993)，这影响了产后早期配种的母牛的妊娠诊断。因此，只有在 产后70天或之后进行人工授精(“AI”)时，才可以在第30天对奶牛进行该试验。妊娠相关糖蛋白(PAG)在结构上与胃蛋白酶相关。它们被认为限于有蹄类哺乳动 物，并且其特征为在胎盘的外上皮细胞层(绒毛膜/滋养外胚层)特异性表达(Green等 人，2000 ；Hughes等人，2003 ；Xie等人，1997)。至少有些PAG没有作为蛋白酶的催化活性， 尽管每一种似乎都具有能够结合肽的裂隙(Guruprasad等人，1996)。据估计，牛、绵羊和大 多数、可能所有偶蹄目(Artiodactyla)反刍动物具有几十个PAG基因。PAG在序列上有高 度多样性，超变区主要限于表面暴露的环。在发展用于家畜的妊娠试验的尝试中发现了牛妊娠相关糖蛋白(boPAGs/PSPB/ PSP60) (Butler 等人，1982 ；Sasser 等人，1986 ；Zoli 等人，1991 ；Zoli 等人，1992a)。在每 次尝试中，给兔注射胎盘绒毛叶提取物，通过用来自未孕动物的组织提取物吸附除去不针 对胎盘抗原的抗体。得到的抗血清为早至授精后一个月对牛和绵羊的准确妊娠试验提供了 ■石出。甚至在最初的研究中(Butler等人，1982 ；Zoli等人，1991 ；Xie等人，1991 ；Xie 等人，1994 ；Xie等人，1996)，清楚知道boPAG在分子量和电荷方面是不均勻的，并且由于 已经纯化了许多同工型，证明它们的氨基末端序列不同(Atkinson等人，1993 ；Xie等人， 1997a)。进一步的文库筛查显示在反刍动物中有额外的转录物(Xie等人，1994 ；Xie等人， 1995 ；Xie等人，1997b)并且在非反刍动物如猪中存在PAG (Szafranska等人，1995)。PAG样 蛋白(也称为“胃蛋白酶原F”或“胃蛋白酶F”)在马和猫中已有描述(Green等人，1999 ； Guruprasad 等人，1996)。已经描述的牛 PAG 包括 boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG6、boPAG7、 boPAG9、boPAG7v、boPAG9v、boPAG15、boPAG16、boPAG17、boPAG18、boPAG19、boPAG20 和 boPAG21 (美国专利6，869，770)。关于通过测定这些PAG诊断早孕的方法的信息可见，例如， 美国专利6，869，770和美国专利申请公布No. 20050100975。在配种后第30天之前，大多数可以采用的检测牛怀孕的试验具有较低的准确性。 此外，许多已有的试验需要熟练的技术人员。因此，需要能够在配种后第30天之前快速、容 易地进行的准确、灵敏的牛妊娠试验。

发明内容
因此，本发明一方面提供灵敏和准确的早孕检测。在一个实施方案中，本发明提供 早孕检测，其中包括PAG高度特异性结构域的特异性多肽可以在妊娠第四周末期之前以高 度的灵敏性和特异性检测到。在这样的早期阶段诊断怀孕的能力在乳品工业特别有用，其 中动物通常至少在一天的一部分时间被限制，并且实施集中管理。此外，本发明的实施方案 将在其它动物的繁殖计划中得到应用。另一方面，本发明提供检测动物怀孕的方法，包括(a)从动物获得样品；(b)使该 样品接触抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包括2D9抗体或其片段或变体；和(c)检 测该抗体或抗体片段与样品中至少一种妊娠相关抗原(PAG)的接触，其中检测到PAG表明 该动物已怀孕。在一个实施方案中，使用的抗体包含与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的结构域。在一些实施方案中，所述动物 是反刍(Ruminantia)亚目的成员。在具体的实施方案中，反刍类动物是牛科(Bovidae)的 成员。在其它实施方案中，所述动物是山羊、绵羊、奇蹄目(Perissodactyla)的成员、马、犀 牛、犬、猫、人或大熊猫。产生2D9的杂交瘤细胞系于2007年8月2日保藏于美国典型培养物保藏中心专 禾llf呆藏部 1、二 (Patent Depository of the American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, Va.，20110-2209)，专利保藏号为 PTA-8566 (识别号为 M0N-PAG-2D9)。该保藏在 国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下进行。进行该保藏只是便于本 领域技术人员，而不是承认根据35U. S.C. §112需要保藏。在特定实施方案中，结构域与SEQ ID NO :1有98%或更高的序列同一性，包括与 SEQ ID NO :1的99%或更高的序列同一性。在进一步的实施方案中，结构域包括SEQ ID NO :1。在一些实施方案中，结构域与SEQ ID NO :2有92%或更高的序列同一性，包括与 SEQ ID NO :2的至少93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%或更高的序列同一性。在一 些特定实施方案中，结构域包括SEQ ID N0:2。在一些实施方案中，抗体或抗体片段进一步被定义为包含至少一个轻链和至少一 个重链的抗体。在具体实施方案中，轻链可以与SEQID N0 :1有大于97%的序列同一性。在 进一步的实施方案中，重链与SEQ ID NO :2有大于95%的序列同一性。在更特别的实施方 案中，重链与SEQ ID NO :2有大于98%的序列同一性。在其它实施方案中，重链包括SEQ ID NO :2。在一些另外的特定实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO 3的轻链和含有SEQ ID NO 4的重链。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体 2D9。检测的PAG 可以是任何 PAG，如 boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、 boPAG19、boPAG20 和 boPAG21。在一个实施方案中，PAG 是 boPAG6。在进一步的实施方案中，本发明涉及用于检测牛动物怀孕的方法，包括(a)从 动物获得样品；(b)使该样品接触2D9单克隆抗体；和(c)检测该抗体与样品中boPAG4、 boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21 中的一种或多种的接触， 其中检测到一种或多种PAG表明该动物已怀孕。用于检测怀孕的方法，例如，可以在人工授 精后的第 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 天或更多天后进行。样品可以是已知或怀疑含有PAG的任何样品。在具体的实施方案中，样品是唾液、 血清、血浆、血液、乳液或尿液。任何有效量的样品可以从动物获得。例如，所述量可以是 大约 5ii lUOu l、15ii l、20ii l、25ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii l、70ii l、80ii l、90ii 1、 100 u l、150ii l、200ii l、250ii l、300ii l、350ii l、400ii l>450u l、500ii l、550ii l、600ii 1、 700 u l、800ii l、900ii l、lml、l. 5ml、2. 0ml>2. 5ml、3. 0ml>3. 5ml、4. 0ml、4. 5ml,5. 0ml 或更
^^ o本发明的方法涉及本领域普通技术人员已知的任何检测抗体或抗体片段与PAG 接触的方法。例如，所述方法可以包括ELISA或Western印迹法。在具体实施方案中，待检
6测的 PAG 是 boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG6、boPAG7、boPAG9、boPAG7v、boPAG9v、boPAG15、 boPAG16、boPAG17、boPAG18、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21。在具体的实施方案中，PAG 是 boPAG6。在本发明方法的某些实施方案中，检测每个样品中一种以上的PAG。当应用于牛 以外的物种时，本发明将允许检测在滋养层(胎盘前)开始附着到或植入母亲子宫壁时产 生的其它PAG。这些物种中的“早期”PAG可以与在检测牛早孕中有用的PAG免疫学交叉反 应。在具体实施方案中，ELISA是夹心ELISA，包括PAG与固定到基底上的抗体或抗体 片段和酶标记的第二抗体制品的结合。例如，固定抗体或抗体片段的基底可以是管、孔、小 瓶、试纸(strip)、试条(dipstick)或生物传感器。例如，酶可以是碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶或任何酶标记。本发明通常也涉及由一种结构域编码的分离的和纯化的多肽，该结构域与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性。在具体实施 方案中，该结构域包含与SEQID NO :1的大于98%的序列同一性。在更特定的实施方案中， 该结构域包含SEQ ID NO :1。可能有一个或多个额外的氨基酸残基连接到该结构域的N-末 端或C-末端。在一个具体实施方案中，多肽是SEQ IDN0:1。在一些实施方案中，该结构域 包含与SEQ ID NO :2的大于95%的序列同一性。在更特定的实施方案中，该结构域包含与 SEQ IDN0:2的大于98%的序列同一性。在进一步特定的实施方案中，该多肽是SEQ ID NO: 2。在其它实施方案中，该多肽包含SEQ ID N0:3。在进一步的实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO :4。本发明也包括编码一种多肽的分离的和纯化的多核苷酸，该多肽具有与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或者与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的结构域。 在一些实施方案中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO :1有大于98%的序列同一性的多肽。在 具体实施方案中，该多核苷酸编码SEQ ID N0:1。在一些实施方案中，该多核苷酸编码一种 多肽，该多肽包含与SEQ ID NO :2有大于95%的序列同一性的结构域。在更特定的实施方 案中，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽具有与SEQ ID NO :2有大于98%的序列同一性的 结构域。在更特定的实施方案中，该多核苷酸编码一种多肽，该多肽包含SEQ ID N0:2。在 一些实施方案中，该多核苷酸包含与SEQ ID NO :5有大于98%的同一性或与SEQ ID NO 6 有大于95%的同一性的核酸序列。在一些具体实施方案中，该多核苷酸是SEQ ID N0:5，在 进一步特定的实施方案中，该多核苷酸是SEQ ID N0:6。本发明通常也涉及通常也涉及分泌单克隆抗体2D9的杂交瘤细胞。本发明也涉及用于检测动物中是否存在PAG的试剂盒，其中该试剂盒包括抗体或 抗体片段。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO :3的轻链。在进一步 的实施方案中，抗体或抗体片段包含含有SEQ ID NO :4的重链。在一个实施方案中，抗体或 抗体片段附着到支持体上。例如，所述支持体可以是聚苯乙烯板、试管、试纸、试条或生物传 感器。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括可检测标记。例如，可检测标记可以是连接 到抗体或抗体片段上的荧光标记。在其它实施方案中，可检测标记是化学发光标记。在进 一步的实施方案中，可检测标记是酶，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。试剂盒还可以包括 酶底物。在进一步的实施方案中，试剂盒包括缓冲液或稀释剂。试剂盒也可以任选地包括一次性移液管。其它试剂盒组分，包括试剂容器、说明书等，是本领域技术人员公知的，并且 预期也可用于此处所述的试剂盒中。本发明通常也涉及检测动物怀孕的方法，包括(a)从动物获得样品；(b)使该样 品接触本发明提供的抗体或抗体片段；和(c)通过与该抗体或抗体片段接触检测样品中的 PAG，其中检测到 boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21 中的一种或多种，包括它们所有可能的组合，表明该动物已怀孕。通过以下详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将是清楚的。但是应当理解， 虽然详细说明和具体实施例说明了本发明的优选实施方案，但是只是说明性的，因为基于 此详细说明，本领域技术人员将会明白本发明精神和范围内的多种变化和修改。


以下附图构成了本发明说明书的一部分，并且用于进一步说明本发明的某些方 面。参考这些附图中的一张或多张，结合此处所述的具体实施方案的详细说明，可以更好地 理解本发明。图1. 2D9轻链的核酸序列(SEQ ID NO 5)。加工形式的起始密码子(N_末端氨基 酸)和终止密码子以粗体示出。图2. 2D9重链的核酸序列(SEQ ID NO 6)。加工形式的起始密码子(N_末端氨基 酸)和终止密码子以粗体示出。图3A、3B.图3A_boPAG6的肽序列(上图)和通过LC_MS_MS分析确定的肽序列 (下图)(SEQ ID NO 7-18)表明，在富含PAG的制品免疫沉淀后从2D9-包被的磁珠上洗脱 的PAG主要对应于boPAG6。为了确定所有结合2D9的成分，对富含PAG的制品进行了免疫 亲和色谱纯化。对免疫亲和柱纯化的材料进行LC-MS-MS分析。该分析显示，boPAG6是主要 的结合 2D9 的 PAG，boPAG-4、boPAG-9、boPAG-20 和 boPAG21 是次要的结合 2D9 的 PAG。图 3B-从第55天牛胎盘制备的组织提取物经2D9免疫亲和色谱纯化的PAG的变性凝胶电泳 (SDS-PAGE)和Western印迹分析。考马斯染色的凝胶和使用PAG多克隆抗体的Western印 迹分析都显示位于67kD、55kD和50kD处的三条蛋白质条带是结合2D9的PAG。“Mz” =质 荷比肽的质量与电离的肽的电荷之比，减去水；“电荷”=离子电荷状态；“Mr (计算)，，= 计算的肽分子量；“起点”=与肽比对的蛋白质的起始氨基酸；“终点”=与肽比对的蛋白质 的终止氨基酸；“得分”=肽序列置信度的量度。图4.考马斯染色的SDS-PAGE，显示肉阜(caruncle)(子宫内膜)和绒毛叶 (cotyledon)(胎盘)组织提取物经免疫亲和色谱法纯化的结合2D9的PAG。切下蛋白条带 1-7，并进行胰蛋白酶消化，然后进行LC-MS-MS分析(SEQ ID NO :7_18)。图5.使用2D9-抗体包被的ELISA板和使用免疫亲和纯化的PAG作为标准建立的 PAG ELISA标准曲线的Log-logit转换。该分析显示从0. 5ng/ml到50ng/ml的线性反应。图6.所示表格显示在两个研究地点威斯康辛州和加利福尼亚州，与第28天超声 妊娠诊断相比，使用基于实验室的ELISA的第28天妊娠诊断的准确性。在这一 0研究中 检查了第28天妊娠试验在奶牛繁殖管理中的经济性。使用多克隆抗体的基于实验室的PAG ELISA用于妊娠诊断。成斯康辛州地点使用严格同步化繁殖，而加利福尼亚州地点使用同步 化繁殖(synchronized breeding)加上发情繁殖(breeding to heat)。每个地点的研究使用大约1000头牛。在第28天采集血样，并运送至实验室进行妊娠试验。结果在24小时内 返回农场，以便能够作出繁殖决定。也在第28天采血时通过超声确定妊娠状态。图7.威斯康辛州地点试验的繁殖参数的分析结果。该地点使用严格同步化繁殖 计划，使用第28天妊娠试验(早期再同步组)或第45天触诊(对照组，晚期再同步)。结 果表明与晚期再同步组(对照组)相比，早期再同步组(第28天妊娠试验)中授精之间的 天数和未孕期(days open)明显减少。图8.加利福尼亚州地点试验的繁殖参数的分析结果。该地点使用同步化繁殖加 发情繁殖，使用(早期再同步组)及不使用(晚期再同步组)第28天妊娠试验。结果表明 与晚期再同步组相比，授精之间的天数、授精次数和未孕期明显减少。图9.显色试验基础。使用2D9单克隆抗体作为捕获抗体和使用生物素标记的兔 多克隆抗体作为第二抗体发展的PAG免疫测定的结果。妊娠第28天和第55天采集的血浆 测试组(20个未孕和20个怀孕)样品显示未孕母牛(蓝色)与怀孕母牛(粉红色)完全 分开。未孕母牛获得的接近零的PAG值提示测试血浆中免疫反应性PAG的定量检测可能不 需要PAG标准。图10.在显色试验中使用全血样品进行的牛妊娠诊断的结果。目视观察结果。显 示蓝色反应溶液的试管(管1、3、6、9、10、14和15)为妊娠状态阳性结果，显示澄清背景的 试管(管2、4、5、7、8、11、12、13和16)为妊娠状态阴性(未怀孕)。为了用分光光度计读 数，可以向每个试管中加入等体积的(0.4ml)终止溶液(IN HC1)。添加终止溶液将使颜色 变为黄色。然后，可以在630nm用分光光度计测量每个样品的光密度(0D)。图11A，11B.使用2D9包被的塑料管进行的显色试验的结果。图11A-第28天血浆 组。图11B-第55天血浆组。第28天和第55天检测组的所有未孕母牛样品都产生0. 20D 或更低的颜色强度，而怀孕血浆样品产生高达1. 00D单位的颜色强度。在该分析中，当设置 0. 20D颜色强度为截值时，第28天血浆样品显示100%的灵敏性和100%的特异性。在相 同的颜色强度截值时，第55天血浆样品在塑料管分析中显示95%的灵敏性和100%的特异 性。图12.新鲜血浆样品的妊娠试验与使用多克隆抗体(多克隆多克隆，上图)和 2D9单克隆抗体和多克隆抗体(单克隆多克隆，下图)进行的PAG夹心ELISA的比较。注 意使用0. 20D颜色强度截值容易地区分的未孕母牛样品清楚地分开。所有怀孕母牛样品具 有> 0. 20D单位的颜色强度。单克隆多克隆分析具有100%的灵敏性和100%的特异性。图13.使用血样的显色试验的现场检测。检测了配种后第33-34天采集的54个 血样，由3个对颜色进行目视观察。3人之间对结果的目视评分未见不一致。图14.与54个样品的超声结果相比，显色试验的现场检测结果。该试验识别了所 有的怀孕母牛(100%灵敏度)，与超声结果相比有一个假阳性结果。有2个样品在显色试 验中为不确定的结果，后来发现为“未孕”母牛。但是，与超声相比，显色试验识别了 40头 未孕母牛中的37头(92. 5%特异性)。图 15.利用 BioEdit (v. 7. 0. 5. 3 ；www. mbio. ncsu. edu/BioEdit/BioEdit. html ； Hall, 1999)内的PR0TDIST(v. 3. 5c)的相邻系统发生树分析包产生的PAG同工型蛋白质序列簇。图16.PAG同工型1、4、6、9、16、17、19、20和21的直接比对。PAG同工型和变体
9的蛋白质序列以SEQ ID NO :51-62给出，来自于UniProt登录号Q29432、046492、046494、 A5PJW4、046497、A4FV16、Q9TTV8、Q9TTV7、A7MBA4、Q9TTV5、Q9TTV4 和 Q9TTV3。图17.用考马斯蓝染色的纯化的PAG批(每批5 μ g)的SDS-PAGE凝胶显示在50 与75kD之间有三个PAG条带(上、中、下条带)。1)蛋白质标准(Bio-Rad Cat. #161-0374)； 2)d55肉阜；3)d55绒毛叶；4)混合的d55肉阜和绒毛叶；5)d215肉阜；6)d215绒毛叶；7) 混合的d215肉阜和绒毛叶；8)蛋白质标准(Bio-Rad Cat. #161-0374)。说明性实施方案详述尽管几种分析可以用于检测怀孕，但是仍然需要提供用于准确和早期检测怀孕的 改进的分析，特别是对于产后2至3个月内或更早时配种的牛。本发明的某些实施方案涉及 确定牛的妊娠状态的方法，包括进行显色试验以检测从动物获得的样品中的PAG与多肽如 单克隆抗体2D9(表明牛怀孕的一种结合PAG的抗体)的结合。显色试验可以早期进行，如 授精后26天。显色试验可以使用多种形式中的任一种，如使用试管或ELISA板。在具体实 施方案中，该试验使用夹心免疫测定原理，其使用第二抗体。颜色，如蓝色，表示阳性试验， 而澄清的管表示阴性试验。本方法的实施方案可以在人工授精后30天之前容易地进行，并 且是高度灵敏和特异性的。此外，可以容易地和快速地同时分析多个样品，这进一步提高了 本方法的价值。也提供了某些新的结合PAG的多肽，它们可以用于检测受试者怀孕的方法中，以 及提供了编码此处所述的多肽的多核苷酸。其余的公开内容描述了本发明的各种特征和它 们的实施。I.多肽此处所述的本发明的某些实施方案涉及分离的和纯化的多肽，该多肽包括与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或者与SEQ IDNO :2有大于92%的序列同一性的PAG 结合结构域。在一些实施方案中，PAG结合结构域与SEQ ID N0:1有大于97. 1%、97. 3%、 97. 5%,97. 7%,97. 9%,98. 1%,98. 3%,98. 5%,98. 7%,98. 9%,99. 1%,99. 3%,99. 5%, 99. 7%、99.9%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，该PAG结合结构域与SEQ ID NO :2 有大于 92. 2 %,92. 6 %,93. 0 %,93. 4 %,93. 8 %,94. 2 %,94. 6 %,95. 0 %,95. 4 95. 8%,96. 2%,96. 6%,97. 0%,97. 4%,97. 8%,98. 2%,98. 6%,99. 0%,99. 4%,99. 8% 或100%的序列同一性。此处使用的“多肽”是指任意长度的连续氨基酸区段。在本方法的某些实施方案 中，其中使用的多肽是连续氨基酸，在其序列中包括与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同 一性或者与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的氨基酸序列。本领域普通技术人员 基于此处所述的公开内容，应当理解如何使用本领域技术人员公知的大量实验方法中的任 一种产生这样的多肽。术语“百分序列同一性”，如本领域已知的，是指通过比较序列确定的两个或多 个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也指多肽 或多核苷酸序列之间的序列相关程度，根据具体情况，通过这些序列串之间的匹配来确 定。“同一性”和“相似性”可以用已知方法容易地计算，包括但不限于Computational Molecular Biology(1988) ；Biocomputing Informatics and Genome Projects(1993)； Computer Analysis of Sequence Data,Part 1( ) ；Sequence Analysis in MolecularBiology (1987)；和Sequence Analysis Primer (1991)中所述的那些方法。优选的确定同 一性的方法被设计为提供测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法编入公 共可获得的计算机程序中。序列比对和百分同一性计算可以使用LASERGENE生物信息学 计算套件(DNASTAR Inc. , Madison, Wis.)的Megalign程序进行。序列的多重比对可以使 用采用缺省参数(空位罚分=10，空位长度罚分=10)的聚类比对方法进行(Higgins和 Sharp (1989).使用多重方法的逐对比对的缺省参数是KTUPLE 1，空位罚分=3，窗口 = 5， DIAGONALS SAVED = 5。技术人员应当理解，“多肽”的定义中固有这样一个概念在分子的限定部分内可 以进行的、仍然产生具有可接受水平的序列同一性或功能(例如结合PAG的能力)的分子 的改变的数目是有限的。此处所述的多肽定义内包括任意长度的氨基酸序列，只要该多肽保留所述的序列 同一性。此处所述的多肽的PAG结合结构域可以在C-末端或N-末端具有额外的氨基酸。 例如，多肽等价物可以包括连接至PAG结合结构域C-末端或N-末端的4、5、6、7、8、9、10、 15、20、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 个或更多的额
外的核酸。当然，具有不同取代的多种不同的多肽可以根据本发明容易地制备并使用。本发明可以使用从天然来源或从重组产生的材料纯化的多肽。本领域普通技术人 员知道如何从重组产生的材料产生这些多肽。这种材料可以使用20种在天然合成蛋白质 中常见的氨基酸或一种或多种修饰的或不常见的氨基酸。通常，“纯化的”是指已经进行分 级分离除去了各种其它蛋白质、多肽或肽的多肽组合物，该组合物基本上保留其活性。纯化 可以是基本纯化，其中多肽是主要的种类或者是均质的，该纯化水平允许准确的降解测序。氨基酸序列突变体包括在本发明中，并且包括在“多肽”的定义中。多肽的氨基酸 序列突变体可以是取代突变体或插入突变体。插入突变体一般包括在肽的非末端位点添加 材料。这可能包括插入少数残基、免疫反应性表位或只是一个残基。添加的材料可以是修 饰的，例如通过甲基化、乙酰化等修饰的。此外，也可以向肽的N-末端或C-末端添加额外 的残基。氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水 性、电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析显示精氨酸、赖氨酸和组氨 酸均是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸均具有类似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸均具有通常相似的形状。因此，基于这些考虑，丙氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘 氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，在此定义为生物功能等价物。在进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。每个氨基酸 已经基于其疏水性和电荷特征被分配亲水指数异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸 (+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)； 甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸 (-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺 (-3. 5)；赖氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。本领域通常理解氨基酸亲水指数在给蛋白质提供相互作用性生物功能中的重要 性(Kyte和Doolittle，1982，通过参考并入本文)。众所周知，某些氨基酸可以取代其它具有类似亲水指数或得分的氨基酸，而仍然保留类似的生物活性。在基于亲水指数进行改变 时，亲水指数在+2以内的氨基酸取代是优选的，在+1以内的是特别优选的，在+0. 5以内的 是更加特别优选的。应当理解，氨基酸可以取代其它具有类似亲水性值的氨基酸，而仍然获得生物学 等效的蛋白质。如美国专利4，554，101所详述的，氨基酸残基被赋予以下亲水性值精氨酸 (+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3. 0+1)；谷氨酸(+3. 0+1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺 (+0. 2)；谷氨酰胺(+0. 2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0. 4)；脯氨酸(-0. 5+1)；丙氨酸(-0. 5)； 组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮 氨酸("1. 8)；酪氨酸(-2. 3)；苯丙氨酸(-2. 5)；色氨酸(-3. 4)。在基于类似的亲水性值进行改变时，其亲水性值在+2以内的氨基酸取代是优选 的，在+1以内是特别优选的，在+0.5以内是更加特别优选的。II.多核苷酸本发明的各方面涉及编码一种多肽的多核苷酸，该多肽包括与SEQ ID NO 1有大 于97%的序列同一性或者与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的结构域。此处所述 的其它实施方案涉及编码一种多肽的分离的和纯化的多核苷酸，该多肽具有与SEQ ID NO 1有大于97%的序列同一性或者与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的结构域。也 公开了包含与SEQ ID NO :5有大于98%的序列同一性或与SEQ ID NO :6有大于95%的序 列同一性的核酸序列的多核苷酸。SEQID NO 5是指编码2D9轻链的cDNA的核酸序列，SEQ ID NO 6是指编码2D9重链的cDNA的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸与SEQ ID NO :5 有 98. 1 %、98· 2%、98· 3%、98· 4%、
98.5%,98. 6%,98. 7%,98. 8%,98. 9%,99. 0%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,
99.6%、99. 7%、99. 8%、99. 9%或100%的序列同一性。在一些实施方案中，多核苷酸 与 SEQID NO 6 有大于 95. 2%,95. 4%,95. 6%,95. 8%,96. 0%,96. 2%,96. 4%,96. 6%, 96. 8%,97. 0%,97. 2%,97. 4%,97. 6%,97. 8%,98. 0%,98. 2%,98. 4%,98. 6%,98. 8%, 99. 0%,99. 2%,99. 4%,99. 6%,99. 8%或 100%的序列同一性。多核苷酸可以从天然来源获得或者使用本领域普通技术人员已知的任何方法化 学合成。本发明也包括化学合成的这些序列的突变体。在特定实施方案中，可能希望使用包括其它元件的构建体，例如，包括C-5丙炔 嘧啶的构建体。含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的寡核苷酸已经证明高亲和力地结合 RNA(ffagner等人，1993)。在一些实施方案中，多核苷酸编码一种或多种额外的能够结合 PAG的氨基酸区段。III.抗体和抗体片段本发明的具体实施方案涉及抗体或抗体片段。术语“抗体”用来指任何具有抗原结 合区的抗体样分子，包括抗体片段，如Fab'、Fab、F(ab' )2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv (单 链Fv)等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的方法是本领域公知的。制备和表 征抗体的方法也是本领域公知的(参见,例如，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ；通过参考并入本文)。“小抗体”或“微抗体”也可用于本发明。小抗体是在C-末端具有寡聚结构域的SFv 多肽链，该结构域与sFv之间被铰链区隔开。Pack等人(1992)。寡聚结构域包含自结合的α-螺旋，例如亮氨酸拉链，它们可以进一步用额外的二硫键稳定化。寡聚化结构域被设计 为与跨膜的矢量折叠相容，该过程被认为促进了多肽在体内折叠为功能结合蛋白质。通常， 小抗体是使用本领域公知的重组方法产生的。参见，例如，Pack等人(1992) ；Cumber等人 (1992)。本发明也涉及抗体样结合拟肽。Liu等人，2003描述了“抗体样结合拟肽”(ABiP)， 它们是作为缩小的(pared-down)抗体起作用的肽，并且具有较长血清半衰期以及较不繁 杂的合成方法的特定优点。单克隆抗体(MAb)公认具有某些优点，例如再现性和大规模生产，并且其应用通 常是优选的。本发明因此提供人、鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和甚至鸡来源的单克隆抗体。由于 容易制备和易于获得试剂，鼠单克隆抗体通常是优选的。但是，也包括“人源化”抗体，以及来自小鼠、大鼠或其它物种、携带人恒定区和/ 或可变区结构域的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程化抗体及其片段。此处使用的术语 “人源化”免疫球蛋白是指包含人构架区和一个或多个来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫 球蛋白的互补决定区(CDR)的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提 供构架的人免疫球蛋白被称为“接受体”。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链 免疫球蛋白的抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、可以以可溶性或结合 形式标记的抗体的抗独特型(抗-id)抗体，以及通过任何已知技术提供的其片段、区域或 衍生物，所述方法例如但不限于酶切、肽合成或重组技术。此处所述的抗体能够结合PAG。此处定义的“多克隆抗体”是指来源于用抗原免疫的动物血清的不均一的抗体分 子群体。这些不同的抗体可以识别同一抗原上的几个表位。“单克隆抗体”含有基本均质的 抗原特异性抗体群体，该群体含有基本相似的表位结合位点。MAb可以通过本领域技术人员 已知的方法获得。参见，例如，Kohler和Milstein，1975 ；美国专利No. 4，376，110 ；Ausubel 等人，1992) ；Harlow和Lane 1988 ;Colligan等人，1993，其内容均通过参考并入本文。这 样的抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。产生 本发明的mAb的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。在体内或原位产生高效价mAb使其 成为目前优选的生产方法。“嵌合抗体”是其不同部分来源于不同动物种的分子，如具有来源于鼠mAb的 可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，它们主要用于降低应用时的免疫原性以及提高产 率。嵌合抗体及其生产方法是本领域已知的。示例性的生产方法在Cabilly等人，1984; Boulianne等人，1984 ；和Neuberger等人，1985中描述，均通过参考并入本文。“抗独特型抗体”(抗-Id)是识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇 的抗体。Id抗体可以通过用制备其抗-Id的mAb免疫作为mAb来源的相同种和属类型的动 物(例如小鼠株)来制备。被免疫的动物将通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-id 抗体)识别并且响应于免疫抗体的独特型决定簇。一种示例性的产生这种抗体的方法在美 国专利No. 4，699，880中描述，该专利通过参考并入本文。本发明的抗体可以包括至少一个重链、至少一个轻链、重链恒定区、重链可变区、 轻链可变区和/或轻链恒定区，其中多克隆抗体、单克隆抗体、其片段和/或区域包括至少 一个结合PAG —部分的重链可变区或轻链可变区。
本发明的某些实施方案涉及用于检测动物怀孕的方法，包括从该动物获得样品， 使该样品接触抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含可以结合boPAG4、boPAG6、 boPAG9、boPAG20和/或boPAG21中的一种或多种的结构域，以及检测该抗体或抗体片段与 样品中的一种或多种PAG的接触，其中检测到PAG表明该动物已怀孕。本领域普通技术人 员已知的任何方法都可以用来鉴定结合PAG的抗体。涉及定义IgG可变区的参考文献的例 子包括Mo等人(1993)和Leibiger等人(1999)，通过参考引入本文。IV.检测方法和测定形式本发明的某些实施方案涉及检测动物怀孕的方法，包括使从动物获得的样品接触 此处提供的抗体，并且检测样品中的至少一种妊娠相关抗原，其中检测到PAG表明该动物 已怀孕。本领域普通技术人员已知的任何方法都可以用来检测结合样品中的PAG的抗体或 抗体片段。本发明因此提供抗体在PAG的免疫检测中的应用。各种有用的免疫检测方法已经 在科学文献中描述，例如，Nakamura等人(1987)。免疫测定，在其最简单和直接的意义上来 说，是结合测定。某些免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用 组织切片的免疫组化检测也特别有用。但是，容易理解，检测不限于这些技术，Western印 迹法、斑点印迹法、FACS分析等也可以用于本发明。通常，免疫结合方法包括获得怀疑含有蛋白质、肽或抗体的样品，并且根据情况， 在允许形成免疫复合物的有效条件下使该样品接触根据本发明的抗体或蛋白质或肽。根据 本发明，优选的样品是流体，如乳汁、尿、血液、血清或唾液。在具体实施方案中，抗体连接到固体支持体上，如试管或孔的内壁，怀疑含有PAG 的样品将加至固定的抗体。抗体包被的试管系统在美国专利3，646，346和WO 98/16832中有述，该专利均通 过参考并入本文。然后可以在特定条件下检测PAG-抗体复合物的存在。任选地，这种免疫
复合物可以定量化。使选择的生物样品在足以允许形成免疫复合物(第一免疫复合物)的有效条件和 时间下接触抗体，通常是向样品中简单添加抗体组合物，并且温育混合物足以使抗体与样 品中存在的任何PAG形成免疫复合物(即结合)的一段时间。这一时间之后，通常洗涤样 品-抗体组合物，以除去任何非特异性结合的抗体种类，只允许在第一免疫复合物内特异 性结合的抗体被检测到。通常，免疫复合物形成的检测是本领域公知的，并且可以通过应用多种方法来实 现。这些方法通常基于检测标记或标记物，如放射性、荧光、生物和酶标记中的任一种。涉及 使用这些标记的美国专利包括 3，817，837 ；3, 850，752 ；3, 939，350 ；3, 996，345 ；4, 277，437 ； 4，275，149和4，366，241，均通过参考并入本文。免疫测定蛋白质的方法和进行该方法的试 剂盒可以在美国专利5，721，105中找到，该专利通过参考并入本文。在具体实施方案中，该方法包括使用第二结合配体如第二抗体和/或本领域已知 的生物素/亲和素配体结合排列。检测中使用的第二抗体本身可以连接到可检测标记上， 其中然后简单地检测该标记，由此允许测定组合物中第一免疫复合物的量。使用免疫捕获、 生物素/亲和素扩增和辣根过氧化物酶颜色产生来检测测试样品中生物分子的方法可以 在美国专利申请公布2003/508381中找到。
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通常，利用具有针对PAG或PAG特异性第一抗体的结合亲和力的第二结合配体可 以检测第一免疫复合物。在这些情况中，第二结合配体可以连接到可检测标记上。第二结 合配体本身通常是抗体，因此可命名为“第二”抗体。在足以允许形成第二免疫复合物的有 效的条件和时间下，第一免疫复合物接触标记的第二结合配体或抗体。然后通常洗涤第二 免疫复合物，以除去任何非特异性结合的标记的第二抗体或配体，然后检测第二免疫复合 物中剩余的标记。其它的方法包括通过两步法检测第一免疫复合物。如上所述，具有针对PAG或抗 PAG抗体的结合亲和力的第二结合配体，如抗体，用于形成第二免疫复合物。第二结合配体 含有能够将底物加工为可检测产物，因此随时间扩增信号的酶。洗涤后，第二免疫复合物与 底物接触，允许检测。在本发明的一个实施方案中，可以采用酶联免疫测定(ELISA)。参见，例如， Engvall, 1980 ；Engvall, 1976 ；Engvall, 1977 ；Gripenberg 等人，1978 ；Makler 等人，1981 ； Sarangadharan等人，1984。ELISA允许将物质被动吸附到固体支持体如塑料上，以便能够 在实验室条件下容易地处理。关于ELISA的全面论述，本领域技术人员可以参见"ELISA ； Theory and Practise“ (Crowther，1995)。ELISA方法的灵敏性取决于使用的酶的更新和检测酶反应产物的容易程度。这 些分析系统的灵敏性的提高可以通过使用酶的荧光和放射性底物来实现。本发明涉及 的免疫测定包括但不限于美国专利4，367，110(双单克隆抗体夹心测定)和美国专利 4，452，901 (Western印迹法)所述的方法。其它分析包括体外和体内的标记配体的免疫沉 淀和免疫细胞化学。在一个实施方案中，本发明包括“夹心”ELISA，其中本发明的抗PAG抗体被固定到 选择的表面上，如聚苯乙烯微孔板的孔中、试管或试条。然后，怀疑含有PAG的测试组合物 如临床样品与所述表面接触。结合并洗涤除去非特异性结合的免疫复合物后，可以用PAG 的第二抗体检测结合的抗原。在另一种示例性的ELISA中，将来自样品的多肽固定到表面上，然后接触抗PAG抗 体。结合并洗涤除去非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗体。在初始抗体连接到 可检测标记上的情况下，第一免疫复合物可以直接检测。或者，可以使用具有对第一抗体的 结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物，该第二抗体连接到可检测标记上。其中固定PAG的另一种ELISA包括在检测中使用抗体竞争。在这种ELISA中，将 标记的抗体添加到孔中，使其结合PAG，并利用它们的标记进行检测。通过在与包被孔温育 之前或期间将样品与标记的抗体混合来检测样品中的PAG的量。样品中PAG的存在用来减 少可与孔结合的抗体的量，因此降低了最终的信号。无论使用的形式如何，ELISA都具有某些共同的特点，例如包被、温育或结合、洗涤 除去非特异性结合的物质，以及检测结合的免疫复合物。在用抗原或抗体包被板时，通常将 板的孔与抗原或抗体的溶液温育过夜或特定的时间。然后洗涤板的孔以除去不完全吸附的 物质。然后用相对于测试抗血清为抗原中性的非特异性蛋白质封闭孔的任何剩余的可利用 表面。它们可包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、奶粉溶液或其它抗原中性蛋白质。包被允 许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，因此减少了抗血清非特异性结合到该表面上产生 的背景。
“在允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的有效条件下”是指该条件优选地包括用 如BSA、牛γ球蛋白(BGG)、蒸发乳或奶粉和磷酸盐缓冲液(PBS)/TWEEN等溶液稀释抗原和 抗体。这些添加的试剂也倾向于帮助减少非特异性背景。“合适的”条件也指在某一温度下温育一段时间，该温度和时间足以允许有效结 合。温育步骤一般是大约1小时到2小时到4小时，温度优选地为25°C至27°C，或者可以 在大约4°C过夜，等等。为了提供检测手段，第二或第三抗体具有结合的标记，以允许检测。通常，这是在 与合适的发色底物温育时将产生显色的酶。因此，例如，希望在利于形成进一步的免疫复合 物的条件下，第一或第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶偶联 的抗体接触并温育一段时间(例如，在室温下在含有PBS的溶液如PBS-TWEEN中温育2小 时)。与标记的抗体温育后，并且洗涤以除去未结合的物质后，对标记的量进行定量，例 如通过与显色底物如尿素和溴甲酚紫或2,2'-叠氮-二 _(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸 [ABTS]和H2O2—起温育，在过氧化物酶的情况下作为酶标记。然后通过测定产生颜色的程 度，例如，使用可见光谱分光光度计完成定量。ELISA的一个变化形式是酶联凝固分析或ELCA(美国专利4，668，621)，该方法使 用凝固级联与标记酶RVV-XA的组合作为通用检测系统。该系统用于本发明的优点是凝固 反应可以在生理pH下在多种缓冲液的存在下进行。因此能够保持复合分析物的完整性。根据本发明也可以在PAG鉴定中使用免疫组织化学(IHC)。包括检测新鲜冷冻的 和福尔马林固定的、石蜡包埋的由IHC研究制备的组织块。例如，每个组织块由50mg残余 的“粉碎的”胎盘组织组成。由这些微粒标本制备组织块的方法已经在以前的各种预后因 素(例如胸)的IHC研究中成功使用，并且是本领域技术人员公知的(Brown等人，1990; Abbondanzo 等人，1990 ；Allred 等人，1990)。简言之，冷冻切片可以如下制备在室温下在小塑料胶囊中在磷酸盐缓冲液 (PBS)中再水合50mg冷冻的“粉碎的”胎盘组织；通过离心沉淀颗粒；将其重悬浮于粘性包 埋介质(OCT)中；颠倒胶囊并再次离心沉淀；在_70°C异戊烷中急冻；切割塑料胶囊并取出 冷冻的组织柱；将组织柱固定在低温恒温器切片机夹具上；切割25-50个含有平均大约500 个明显完整的胎盘细胞的连续切片。永久切片可以通过类似的方法制备，包括在塑料微量离心管中再水合50mg样品； 沉淀；在10%福尔马林中重悬浮4小时进行固定；洗涤/沉淀；重悬浮于温2. 5%琼脂中； 沉淀；在冰水中冷却以使琼脂变硬；从管中取出组织/琼脂块；将该块浸入并包埋到石蜡 中；切成最多50个连续永久切片。V.蛋白质的纯化某些实施方案涉及分离的或纯化的多肽或使用分离的或纯化的多肽的方法。蛋白 质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术包括在一个水平上将细胞环境粗分级分离 为多肽和非多肽级分。在将该多肽与其它蛋白质分离后，感兴趣的多肽可以使用色谱和电 泳技术进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合于制备纯肽的分析 方法是离子交换色谱法、排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦。特别有效的纯化肽 的方法是快速蛋白质液相色谱法乃至HPLC。
本发明的某些方面涉及编码的蛋白质或多肽的纯化，在具体实施方案中，涉及其 基本纯化。本文使用的术语“纯化的多肽、蛋白质或肽”意指可与其它成分分离的组合物， 其中该蛋白质或肽相对于其可天然获得的状态纯化至任何程度。纯化的蛋白质或肽因此也 指脱离可能天然存在的环境的蛋白质或肽。通常，“纯化的”是指已经分级分离除去各种其它成分并且该组合物基本保留其表 达的生物活性的蛋白质或肽组合物。当使用术语“基本纯化的”时，该术语是指组合物中蛋 白质或肽构成该组合物的主要成分，如构成该组合物中蛋白质的大约50%、大约60%、大 约70%、大约80%、大约90%、大约95%或更多。适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域技术人员公知的。其中包括，例如，硫酸 铵、PEG、抗体等沉淀或通过污染蛋白质的热或酸性pH变性，然后离心；色谱步骤，如离子交 换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱法；等电聚焦；凝胶电泳；和这些和其它技术的 组合。本领域公知，据认为进行各个纯化步骤的顺序可以变化或者某些步骤可以省略，而仍 然导致用于制备基本纯化的蛋白质或肽的合适的方法。通常不需要多肽总是以最纯化的状态提供。实际上，想到较低程度基本纯化的产 物在某些实施方案中有用。部分纯化可以通过使用较少的组合纯化步骤或者通过使用相同 普通纯化方案的不同形式来实现。例如，应当理解，使用HPLC装置进行的阳离子交换柱色 谱法通常比使用低压色谱系统的相同技术导致更高的纯化倍数。显示较低相对纯化程度的 方法可能在蛋白质产物的总回收率或者保持表达蛋白质的活性方面具有优点。VI.试剂盒在另外的实施方案中，本发明提供了用于通过上述免疫检测方法检测PAG的试剂 盒，如诊断牛怀孕的免疫检测试剂盒。在具体的实施方案中，试剂盒中包括包含与SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或与SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的结构域的抗 体。该试剂盒可以包括一个或多个容器装置。容器，例如，可以是小瓶、试管、瓶、小瓶或注 射器。在具体实施方案中，抗体是单克隆抗体2D9。在具体实施方案中，试剂盒包括一个 或多个预结合有抗体的试管或微量滴定板的孔。可替代地，试剂盒可以包括预结合到柱基 质上的抗体。试剂盒可以允许测定一个样品或一个以上的样品。在一些实施方案中，试剂 盒包括多个用允许同时或连续免疫检测大量样品的抗体包被的微量滴定板或试管。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式中任意一种，包括与给定抗体相关的和 /或连接的可检测标记。也涉及与第二结合配体相关的和/或连接的可检测标记。示例性 的第二配体是具有对于第一抗体的结合亲和力的第二抗体。在一些实施方案中，试剂盒包括具有对于第一抗体的结合亲和力的第二抗体。第 二抗体可以与可检测标记连接或不连接。在一些进一步的实施方案中，试剂盒包括具有对 于第二抗体的结合亲和力的第三抗体，该第三抗体与可检测标记连接。如上所述，大量示例 性的标记是本领域已知的，和/或本发明可以使用所有这些标记。试剂盒可以任选地包括适当等分的PAG的组合物，以提供阳性对照。试剂盒的成 分可以在水性介质中和/或以冻干形式包装。Vl I.实施例包括以下实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解， 下面这些实施例中公开的技术代表了发明人发现的在实施本发明中工作良好的技术，因此 可以被认为构成了实施本发明的优选方式。但是，本领域技术人员基于本公开内容应当理 解，可以对公开的具体实施方案进行许多变化，而仍然获得相同或相似的结果，而不背离本 发明的精神和范围。实施例1结合2D9的PAG的鉴定进行了研究来鉴定结合2D9的蛋白质、对2D9抗体进行表征和测序、以及对PAG的 2D9结合位点作图。为了实现这一点，采用了两种方法(如下所述)。材料与方法使用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG。根据厂商说明(Dynal)，将纯化的2D9偶联至 甲苯磺酰基(Tosyl)活化的Dynal磁珠上。抗体包被的磁珠与100微克富含PAG的制品(从 第55天的胎盘获得)在Ix PBS中温育30分钟，并用相同的缓冲液充分洗涤。使用pH 3. 0 乙酸洗脱结合的蛋白质，并进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹用兔抗-PAG多克 隆抗体显示。从SDS-PAGE上切下免疫反应性蛋白条带，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS 分析(图3)。力特· 55碰_(賴_)禾口M和十(月台I) _吿細_馳_ 免疫亲和饩谱。简要地说，根据厂商说明(Sigma，St. Louis)，将纯化的2D9 (IOmg)偶联至1 克CNBr活化的sepharose上。2D9-亲和树脂(大约5. Oml)与25ml组织提取物在pH 7. 0 下温育过夜，进行结合。次日，将树脂装柱，并用Ix PBS洗涤，以除去未结合的材料，并用pH 3.0乙酸洗脱。洗脱的材料的pH在洗脱后立即用IM Tris中和至pH 7.0。对洗脱的材料 进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹用兔抗-PAG多克隆抗体显示。从SDS-PAGE 上切下蛋白条带1-7，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS分析(图4)。利用BLAST分析确 定肽序列的身份。通过用2D9-结合抗原作为PAG标准(通过免疫亲和色谱法纯化的)获得的ELISA 数据的log-log转换确定PAG对2D9的结合亲和力(图5)。使用从0. 05ng/ml到50ng/ ml (0. 083nM到8. 3nM)的一系列PAG标准进行该分析。ELISA分析重复8次。数据用SoftMax (Molecular Devices, Inc. , Sunnyvale, CA)进行分析。结果2D9偶联的磁珠对PAG的免疫沉淀。对磁珠洗脱的材料进行的SDS-PAGE和Western 印迹分析显示在67kD处有一条蛋白条带。肽指纹分析和LC-MS-MS分析确定该蛋白条带为 boPAG6 (图3)。但是，该分析没有显示所有结合2D9的PAG，因为该分析使用100微克富含PAG 的制品进行免疫沉淀实验。通过在PH 5.0下对胎盘组织提取物进行胃酶抑素-亲和色谱以 及随后在PH 9. 5洗脱，分离该材料。该制品也被称为“酸性PAG”，一种富集的早期PAG抗原 制品。为了鉴定所有结合2D9的PAG，使用组织提取物进行免疫亲和色谱法(见下文)。使用2D9-免疫亲和饩谱法从组织提取物纯化的PAG的分析。免疫亲和柱洗脱的材 料的考马斯蓝染色显示分子量为67kD、55kD和50kD的3个蛋白条带。在使用兔抗PAG抗 体的Western印迹分析中也发现所有这三个蛋白条带都是免疫反应性的。基于这些结果，
18在SDS-PAGE后切下所有蛋白条带(图4)，并进行肽指纹分析和LC-MS-MS。得到的肽序列 的身份通过BLAST分析确定。表1显示肽序列结果的概况以及通过BLAST分析确定它们为 对应于 boPAG-4、boPAG-6、boPAG_9、boPAG-20 和 boPAG21 序列的 PAG。关于表 1 中各参数 的含义，参见图3的说明。表1.肽序列结果的概况
蛋白条带编号存在于条带3、S、6和7中牛(gi286G3710)妊娠相关糖蛋白4Mz电荷Mr(计算)起点终点评分肽序列494.789 72969.564732333197.72%VPGOAYILK (SEO ID NO: 19)523.779 921027.512736236999.00%LYFSVFDR (SEO ID N0:20)544.765 721069.519312713698.95%TFSITYGSGR (SEQ ID NO:21)608.826 221197.621623224194.10%GELNWIPLMK (SEO ID NO:22)671.69531994.051319521299.00%LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO:23)820.457 432440.267817219487.95%FDGVLGLSYTNISPSGAIPIFYK (SEQ ID NO:24)
蛋白条带编号存在于条带1、2、4和S中牛(gi28603714)妊娠相关糖蛋白6Mz电荷Mr(计算)起点终点评分肽序列886.423521752.872219621188.08%NEGAISEPVF AFYLSK (SEQ ID NO:25)881.939421743.886514716295.46%IGDLVSTDQPFGLCLK (SEQ ID NO:26)809.713132408.173623125091.77%GELNWVPLIQVGDWFVHMDR (SEQ ID NO:27)671.671831994.051319421197.94%LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO:28)615.302621210.602218319398.74%TFSGAFPIFDK (SEQ ID NO:29)592.932131757.815421222799.00%DKQEGSVVMFGGVDHR (SEQ ID N0:30)511.906631514.693621422790.49%QEGS VVMFGG VDHR (SEQ ID NO:31)467.22422914.428636236891.26%YFSVFDR (SEQ ID NO:32)
19 该分析显示，3个蛋白条带中的每一个都具有一种以上的PAG (表1)。67kD的条带 含有对应于boPAG6和boPAG20的肽。55kD的蛋白条带含有属于boPAG6和boPAG9的肽。 50kD的蛋白条带对应于boPAG4和boPAG21，以及作为次要成分的boPAG9。这些结果表明， 2D9单克隆抗体结合boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20和boPAG21。该单克隆抗体结合所 有5种PAG共有的表位。序列比较显示这些PAG之间具有高度的序列同一性。使用结合2D9的PAG作为标准获得的PAG ELISA结果(图5)用于使用SoftMax 计算Kd值。2D9的Kd值确定为0.9nM(图5)。因此，2D9是PAG的高亲和力单克隆抗体。 这些结果表明，PAG单克隆抗体2D9结合来自第55天胎盘组织提取物的boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20和boPAG21。通过LC-MS-MS获得的肽序列的身份符合以前表征的这5种 PAG 的序列(boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20 和 boPAG21)。实施例2蛋白质和mRNA测序纯化的2D9的蛋白质测序。对2D9进行测序以确定2D9的PAG-抗原结合序列。 2D9的测序利用蛋白质和DNA测序方法实现。首先，通过变性凝胶电泳分离2D9抗体的重 链和轻链。切下凝胶条带，并且分开进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。分离得到的肽，并 且通过LC-MS-MS (液相色谱-质谱-质谱)法测序。选择在质量和序列分析中置信得分> 90%的肽。利用得到的肽序列装配大约80%的轻链序列和大约50%的重链序列。2D9重链和轻链mRNA的测序。在第二种方法中，使用从2D9PAG杂交瘤细胞制备的 总RNA，通过使用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，将对应于2D9重链和轻链的mRNA 进行测序。简要地说，产生PAG单克隆抗体的杂交瘤细胞在无血清组织培养基中生长，以产 生IxlO6个细胞。离心细胞，将得到的细胞沉淀物在液氮中急冻。细胞沉淀物贮存在-80°C 直到使用。使用购自Ambion，Inc.，Austin, TX的细胞-cDNA试剂盒II产生第一链互补 DNA(cDNA)。将杂交瘤细胞中的RNA进行反转录，以产生cDNA，而不需单独的RNA提取步 骤。使用一组为扩增小鼠重链和轻链所有亚类而设计的引物，利用聚合酶链反应(PCR)，用 得到的cDNA模板扩增轻链和重链(Chardes等人，1999)。分离得到的PCR产物。使用DNA STAR 软件包组装序列数据。重复整个研究以确保序列的准确性。PCR扩增和测序的第二 次重复包括额外的弓I物来提高覆盖率。序列分析显示2D9重链来源于小鼠IgGl γ亚类，轻链来源于κ型。重链由448 个氨基酸残基组成，轻链由219个氨基酸残基组成。2D9轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。2D9重链的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。2D9轻链的核酸序列如SEQ ID NO: 5所示(图1)。2D9重链的核酸序列如SEQ ID NO 6所示(图2)。实施例3基于免疫测定的妊娠试验在牛中的可行性研究进行了大规模研究，以评估第28天早孕试验在奶牛繁殖管理中的经济性。研究动 物位于两个不同的地点，一个在加利福尼亚州，另一个在成斯康辛州。每个地点有1，050只 动物。在最初的配种后进行如下所述的基于免疫测定的妊娠试验或标准触诊。将样品连夜 运送至实验室。该研究使用对兔抗PAG多克隆抗体优化的标准ELISA。基于试验性研究， PAG ELISA使用的截值为1.7ng/ml。在第28天采集血样，并运送至实验室进行妊娠试验。 通过PAG ELISA完成妊娠诊断，产生结果报告，并且农场人员在24小时内可以获得。早期 再同步(resynch)组基于PAG试验的妊娠诊断结果进行繁殖决定。晚期再同步组(对照) 的繁殖决定基于第35-45天的触诊进行。两个地点的结果在图6-8中示出。图6显示与基于超声的妊娠诊断相比，使用PAG ELISA的基于实验室的妊娠诊断 的准确性。图6显示在两个研究地点，威斯康辛州和加利福尼亚州，与基于第28天超声的 妊娠诊断相比，使用基于实验室的ELISA的第28天妊娠诊断的准确性。在这一 β研究中 检查了第28天妊娠试验在奶牛繁殖管理中的经济性。使用多克隆抗体的基于实验室的PAG ELISA用于妊娠诊断。成斯康辛州地点使用严格同步化繁殖，而加利福尼亚州地点使用同步化繁殖加上发情繁殖。每个地点的研究使用大约1000头牛。在第28天采集血样，运送至 实验室进行妊娠检测。结果在24小时内返回农场以便能够作出繁殖决定。在第28天采血 时也通过超声确定妊娠状态。图7和图8显示在两个不同的繁殖方案中，用于确定早孕检测在奶牛繁殖管理中 的经济性的繁殖参数的结果。结果清楚地显示，与对照相比，在早期同步组中未孕期显著减 少10-15天。另外，在两个地点都观察到授精之间的天数的减少。这些结果表明，授精27-30天后使用PAG ELISA的早孕试验比触诊允许更早的繁 殖。早孕试验显著减少了母牛再繁殖中的“未孕期”。另外，早孕试验显著减少了授精之间 的天数。使用早孕试验的发情繁殖策略显示减少了每次妊娠的授精次数。实施例4现场(On-Farm)试验概念牛妊娠试验(试纸)进行进一步的研究以评估在开发使用试纸的“现场”妊娠试验中使用2D9的可行 性。试纸使用侧流技术，该技术与家庭妊娠试验中使用的技术相同。侧流试纸在样品施加 末端具有胶体金偶联的抗体，并且在试纸中部具有作为测试线放置的捕获抗体。如果样品 中存在测试抗原(PAG)，则金偶联的抗体将结合抗原，产生的复合物向测试线迁移。在测试 线处，捕获抗体(也针对PAG)将结合该复合物并且在该线处浓缩。当测试线处有足够的复 合物作为抗体夹心体时，由于胶体金标记的抗体与测试抗原结合，将出现可见的紫色线。生 产并测试了具有40种以上的抗体组合(包括2D9作为捕获抗体)的侧流试纸。测试的侧 流试纸组合没有一种产生可接受的灵敏性和特异性。结果，评估了用于开发“现场”试验的 其它快速诊断试验形式。在评估的形式中，具有内部肋片的塑料管显示有希望的结果。因 此，选择这种试管形式作为显色试验进一步优化。实施例5现场试验概念牛妊娠试验(多孔板)在进一步的研究中，使用第28天从证实怀孕的母牛采集的血浆样品确定显色试 验的灵敏性和特异性。颜色强度如下确定将样品溶液转移到2D9包被的多孔板。在读板 器(SpectraMax, Molecular Devices, Inc.，CA)中读板。血浆组由20个怀孕的20个未孕 的样品组成。每个样品测定两次。基于从40个样品获得的颜色强度的光密度，通过使用 0. 20D单位截值作为背景颜色，该试验显示100%的灵敏性和100%的特异性(图9)。实施例6现场试验概念牛妊娠显色试验(塑料管)材料与方法。下列方案描述了使用2D9包被的塑料管的妊娠试验的优化程序。可 以对使用K3EDTA采血管采集的全血样品或对血浆样品进行该试验。材料。具有内部肋片的试管(#214-2131-010)购自Evergreen Scientific Company, Los Angeles，California。PAG单克隆抗体2D9和兔多克隆抗体通过蛋白G亲 和色谱法纯化。兔多克隆抗体的生物素标记使用Roche生物素标记试剂盒(#1-418-165， Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana)按照厂商说明进行。链霉亲禾口 素-PolyHRP20 (#RDI-PHRP20-SA)购自 Research Diagnostics, Inc, Concord, MA。Sure Blue Reserve (#53-00-03)购自 KPL，Inc, Gaithersburg, MD。含有 TWEEN20 的 SuperBlock(#37516)从 Pierce Biotech, Rockford, IL 获得。在磷酸盐缓冲液(PH7. 4)中具有已知浓度的纯化的2D9单克隆抗体；包被缓冲液0. IM Na2CO3, PH 9. 3 ；洗涤缓冲液含有0. 05% Tween20的IxPBS ；稀释缓冲液在洗涤缓冲液中的10% SuperBlock 。多克隆抗体的生物素标记。纯化的兔多克隆抗体(Img)用于按照试剂盒生产商 (Roche)推荐的程序进行生物素标记。简言之，将7. 6μ1于DMSO中的活化的生物素试剂 加至1.5ml试管中含有Img抗体的1.0ml PBS溶液中。将试管置于45rpm的旋转摇床上， 室温2小时。该步骤后，将内容物转移到透析slide-A-lyzer (Pierce Biotech,#63380)， 并于4°C对IxPBS透析16小时，更换2次缓冲液。从Slide-A-Iyzer回收生物素标记的 IgG，并作为用含BSA的PBSl 100稀释的贮存液贮存。该溶液在使用前用稀释缓冲液 1 2000稀释，用于妊娠试验。试管的抗体包被。纯化的单克降抗体2D9在0. IM碳酸钠缓冲液(pH 9. 3)中稀释 至浓度为ι. 25μ g/ml，用于包被试管。试管用0. 4ml碳酸钠缓冲液中的0. 5 μ g抗体4°C 包被16-18小时。对于温育，试管置于具有紧密闭合的气密盖子加用于湿润的湿纸巾的塑 料容器内部，并保持于4°C。温育后，除去抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤试管两次。然后用 0. 4ml superblock-TWEEN20于37°C封闭试管1小时。温育后，除去superblock，并将试管 置于干燥室中室温干燥2小时。该步骤后，密封试管，并在不合湿气的塑料容器中4°C贮存 直到使用。包被的试管在6个月内可用，具有最小的试验性能损失。样品采集。使用OvSynch同步方案使母牛达到同步发情。每个同步配种使用大约 200头母牛。总共815头母牛通过人工授精(Al)配种，AI日为第0天。将第26天和第28 天的800头母牛的血样采集到含有抗凝剂K3EDTA(BD#366643)的试管中，并通过连夜运输 在冰上运送到实验室。血样在收到后直接用于显色试验。在大约第29天通过超声检查母 牛的妊娠状态，并在大约第60天通过直肠触诊再次证实。在该研究结束时可以获得797头 母牛的妊娠诊断数据，并用于分析试验的准确性。显色试验程序通过颠倒最多10次混合血样，以便于样品转移。将400微升(0. 4ml)血液转移 到每个管中，将试管在37°C水浴中温育15分钟。温育后，吸出血样，向试管中填充洗涤缓 冲液(含有0. 05% Tween20的IxPBS)。吸出洗涤缓冲液，并用洗涤缓冲液再洗涤试管两 次。第三次洗涤后，向每管中加入0. 4ml用稀释缓冲液(含有10% SuperblockT20 的洗 涤缓冲液)1 2000稀释的生物素标记的抗PAG多克隆抗体，并在37°C水浴中温育15分 钟。温育后，吸出试管的内容物，并用洗涤缓冲液洗涤两次。然后，向每管中加入含有0. 4ml 链霉亲和素_PolyHRP20(l 30，000)的稀释缓冲液，并在37°C水浴中温育15分钟。第三 次温育后，吸出每管的内容物，并用洗涤缓冲液洗涤试管两次。然后，加入0.4ml HRP底物， SureBlueReserve ，并在室温下温育15分钟。温育后，在接收来自怀孕母牛的样品的试管 中观察到深蓝色(图10)。接收来自未孕动物的样品的试管保持无色(图10)。可以目视 观察颜色以推断妊娠状态。但是，为了在实验室中对颜色进行定量，向每管中加入等体积的 (0. 4ml)终止溶液(IN HCl)，使蓝色变为黄色。然后将每一样品的一等份(0.2ml)转移到 ELISA板上，在430nm记录光密度。大于或等于0. 2的OD值被认为是“怀孕的”，而低于0. 2 的值被认为是“未孕的”。颜色强度截值0. 20D是以前使用用于妊娠诊断的血浆测试组样品 确定的。
23
以下是试管试验程序步骤的概述1.加入 400μ 1 样品，37°C 15 分钟2.血液洗涤3次，血浆洗涤2次3.加入400 μ 1生物素标记，370C 15分钟4.洗涤2次5.加入 400 μ 1 Poly-HRP20,37°C 15 分钟6.洗涤2次7.力口入 400 μ 1 SureBlue Reserve 8.读数一 5min_15min (蓝色=怀孕；无色=未孕)测试分析参数的定义灵敏性血液试验确定怀孕母牛已怀孕的能力特异性血液试验确定未孕母牛未怀孕的能力显色试验的优点试验用品包括用于采血的紫色帽采血管(3. 0!111，含K2EDTA)、预 包被的试管、试剂、洗瓶和移液管。需要37°C孵箱/加热水池(waterback)/加热部件。与 平板ELISA不同，该试验不需要离心机来分离血浆，因为全血可以直接用于该试验。该试 验也不需要如平板振荡器的装置、洗涤装置(洗板器)或读数装置(读板器)。洗涤可以 用洗瓶实现，移液管用于除去洗涤之间的洗涤缓冲液。颜色可以目视观察。但是，在实验室 中，在显色试验结束时(第8步后)，向所有管中加入0.4ml终止溶液IN HC1，并将一等份 (0. 2ml)转移到ELISA板中，用读板器记录颜色强度。与常规平板ELISA (4小时)相比，总 分析时间大约为2小时。该颜色分析可以任选地是多路分析，如使用96孔、48孔或24孔 板。结星。使用第28天血浆测试组(20个未孕和20个怀孕样品)的显色试验的结果 在图IlA中示出，使用第55天血浆测试组(20个未孕和20个怀孕样品)的试验结果在图 IlB中示出。所有未孕样品的颜色强度值均< 0. 20D，而怀孕样品显示颜色强度> 0. 20D。通过使用该截值，两个测试组(图IlA和11B)显示> 95%的灵敏性和特异性。也 用该系统测试了一组新鲜血浆样品，显示能够清楚地区分未孕母牛和怀孕母牛(图12)。实施例7现场试验概念牛妊娠显色试验(塑料管)该试验如上所述在现场进行，使用37°C水浴，不使用额外的设备。在该现场试验 中，检测了 58个血样。使用0. 4ml血样进行了显色试验(图13)，并通过超声进行妊娠的 确认(图14)。由3人观察颜色，试验结果的目视评分没有不一致。显色试验能够鉴别所 有14头怀孕母牛。所有3人将2个样品评为“不确定”，因为其有蓝色背景，发现该样品为 “未孕的”。与超声相比，该现场试验显示100%的灵敏性和92. 5%的特异性(37/40)。实施例8基于夹心免疫测定的妊娠显色试验(塑料管)材料与方法.使用PAG单克隆抗体2D9作为捕获抗体和使用生物素标记的兔多克 隆抗体作为第二抗体发展了基于夹心免疫测定的试验。PAG单克隆抗体包被在透明塑料管 或孔的内部，并作为陷阱。使用的试管是内部具有肋片的试管，以提高抗体包被的表面积 (Evergreen Scientific，Los Angeles，CA)。使用链霉亲和素-HRP (辣根过氧化物酶)/HRP
24底物系统检测复合物。链霉亲和素Poly_HRP20获自Research Diagnostics Inc. ,Concord, MA,辣根过氧化物酶获自KPL，Inc.，Gaithersburg, MD。试管或孔中的颜色(蓝色或黄色) 显示检测到复合物，表明样品中存在PAG。关于建立用于检测怀孕母牛和小母牛血清中PAG 的ELISA的信息可见Green等人，2005。分析标准是0. 5ng至6. Ongo该试验需要大约4小 时完成。该试验可以使用农场或类似地点的简单的实验室用品进行。在该实施例中，37°C 孵箱和移液器是除试剂以外仅需的物品。显色试验概念可以与Ovsynch、再同步和定时人工 授精(Ovsynch，Resynch and Timed Artificial Insemination，TAI)结合作为牛繁殖管理 工具的一部分。该试验概念也可以扩展到其它分析物，如孕酮和其它妊娠抗原，以提高诊断 的准确度或促进第26天前妊娠的检测。多路分析可以使用例如96孔或48孔盘或或使用 多个试管来进行。表2.分析试剂、用品和供应商信息 M^.通过与第29天超声和第60天直肠触诊的结果相比较，对从第26天和第28 天动物采集的797个血液样品的妊娠试验的灵敏性和特异性进行了评估。获得血浆样品。 妊娠诊断的截值为0. 20D单位。表3显示与第29天的基于超声的妊娠诊断和第60天的直 肠触诊相比，血液检验的准确度。表3.与第29天超声(US)和第60天直肠触诊相比，血液检验准确度的分析
这些结果表明，用PAG单克隆抗体2D9发展的牛妊娠试验具有商业上可接受的准 确度，以及低假阴性结果。该抗体可以用于开发用来早在配种后第26天高灵敏性和特异性 地检测牛妊娠状态的快速试验形式。进一步的分析显示，通过将截值调整为0. 350D单位， 测试精度可以提高到99%的灵敏性和94%的特异性。实施例9适于发展牛妊娠试验的早期PAG蛋白亚群的分离组织采集。授精后50-60天从早孕的牛中采集胎绒毛叶组织。妊娠50-60天是怀 孕的优选时期，因为在这一妊娠阶段或前后，早期PAG蛋白亚群占总PAG蛋白的高百分比。 但是尽管在授精后50-60天或前后，希望的早期PAG蛋白的百分比较高，但是总蛋白质和可 获得的组织的量较少。在授精后61-250天或前后，总PAG蛋白和胎绒毛叶和肉阜组织的量 高的多。可以用于鉴定结合2D9的蛋白质以及对PAG的2D9结合位点作图的方法。有四种 方法可用于鉴定结合2D9的蛋白质、对2D9抗体进行表征和测序，以及对PAG的2D9结合位 点作图。进行以下研究1.用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG(从第55天胎盘获得的)。根据厂商说明 (Dynal)，将纯化的2D9偶联至甲苯磺酰基活化的Dynal磁珠上。抗体包被的磁珠与100微 克富含PAG的制品在Ix PBS中温育30分钟，并用相同的缓冲液充分洗涤。结合的蛋白质 使用PH 3. 0乙酸洗脱，并进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹用兔抗-PAG多克隆 抗体显示。从SDS-PAGE上切下免疫反应性蛋白条带，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS 分析。以下方法是可以进行的替代免疫沉淀法2.用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG(从第61-250天胎盘获得的)。根据厂商说明 (Dynal)，将纯化的2D9偶联至甲苯磺酰基活化的Dynal磁珠上。抗体包被的磁珠与100微 克PAG制品在Ix PBS中温育30分钟，并用相同的缓冲液充分洗涤。结合的蛋白质使用PH 3. 0乙酸洗脱，并进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹可以用兔抗-PAG多克隆抗 体显示。然后从SDS-PAGE上切下免疫反应性蛋白条带，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS 分析。早期PAG蛋白亚群(特别是PAG 4、6、9、20和21)的高度纯化的制品可以利用该程 序纯化。进行以下研究3.由牛妊娠第55天的肉阜(子宫内膜)和绒毛叶(胎盘)组织制备的组织提取物的免疫亲和色谱。简要地说，根据厂商说明(Sigma，St. Louis)，将纯化的2D9 (IOmg)偶 联至1克CNBr活化的s印harose上。2D9-亲和树脂(大约5. Oml)与pH 7.0的25ml组 织提取物温育过夜，进行结合。次日，将树脂装柱，并用Ix PBS洗涤，以除去未结合的材料， 并用PH 3.0乙酸洗脱。洗脱的材料的pH在洗脱后立即用IM Tris中和至pH 7.0。对洗 脱的材料进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹用兔抗-PAG多克隆抗体显示。从 SDS-PAGE上切下蛋白条带1-7，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS分析。利用BLAST分析 确定肽序列的身份。以下是可以进行的替代色谱方法4.由牛妊娠第61-250天的肉阜(子宫内膜)和绒毛叶(胎盘)组织制备的组织 提取物的免疫亲和色谱。简要地说，根据厂商说明(Sigma，St. Louis)，将纯化的2D9 (IOmg) 偶联至1克CNBr活化的s印harose上。2D9-亲和树脂(大约5. Oml)与pH 7.0的25ml组 织提取物温育过夜，进行结合。次日，将树脂装柱，并用Ix PBS洗涤，以除去未结合的材料， 并用PH 3.0乙酸洗脱。洗脱的材料的pH在洗脱后立即用IM Tris中和至pH 7.0。洗脱的 材料可以进行凝胶和Western印迹分析。Western印迹可以用兔抗-PAG多克隆抗体显示。 从SDS-PAGE上切下蛋白条带1-7，并在胰蛋白酶消化后进行LC-MS-MS分析。然后可以利 用BLAST分析确定肽序列的身份。早期PAG蛋白亚群(特别是PAG 4、6、9、20和21)的高 度纯化的制品可以利用该程序纯化。实施例10另外的结合2D9的PAG的鉴定如实施例1所总结的，发现MAb 2D9可识别五种PAG同工型(4、6、9、20和21)。通 过对从配种后55天收集的胎盘组织获得的纯化PAG样品进行LC/MS/MS肽测序，鉴定这些 同工型。MAb 2D9进一步用于PAG的纯化和鉴定，包括将抗体偶联至CNBr活化的树脂，以 产生免疫亲和柱。纯化样品中存在的PAG可以被2D9结合(识别)。以类似的方式，在PAG ELISA中，牛全血或血浆样品中存在的PAG可以被2D9结合并且引发指示怀孕的阳性ELISA 反应。免疫纯化过程中纯化PAG的洗脱进行如下改变将pH从3. 0调整为2. 5，并在洗脱 液收集过程中立即中和至PH 7.0。使用纯化的样品，通过SDS-PAGE显示纯化的PAG，基本 如上所述进行(例如实施例1)。发现类似的条带图案，具有三个介于50和75kDa之间的主 要条带。除了配种后55天从牛收集的胎盘组织以外，也从配种后215天的牛胎盘组织纯化 了 PAG。PAG蛋白质家族的某些成员(同工型)比其它成员在妊娠过程中早期表达。这组 在妊娠过程中较早表达的PAG通常被称为早期PAG，而那组在妊娠过程中较晚表达的PAG通 常被称为晚期PAG。来自配种后55天的胎盘组织代表表达早期PAG的妊娠期，而来自配种 后215天的胎盘组织代表包括晚期PAG表达的妊娠期。通过SDS-PAGE显示来自第55天和 第215天胎盘组织的纯化PAG，显示了相同的位于50和75kDa之间的三条带，但是第215胎 盘组织的较高分子量条带的比例(强度)较大。使用2D9免疫亲和柱纯化来自第55天和第215天胎盘组织的PAG样品的肽，并通 过LC/MS/MS肽测序进行分析，以鉴定样品中存在的PAG同工型。将肽序列与从UniProt数 据库(WWW. uniprot. org)获得的PAG同工型序列(如表4中列出的)进行比较。表5显示 肽序列结果的概况和它们通过BLAST分析被鉴定为对应于boPAG-16、boPAG-17和boPAG_19
29序列的PAG。表5中提到的“泳道”和“条带”(下、中)在图17中显示。在纯化PAG样品 中表征的PAG同工型的概况在表6中示出。表4.具有 UniProt 登录号的 PAG 同工型(SEQ ID NO :51_62) · 表5.肽序列结果概况(包括SEQ ID NO :63_74)。“MH+”=肽的质荷比，加水；“电 荷”=离子电荷状态；“P(p印)，，=肽序列的概率；“起点”=与肽比对的蛋白质的起始氨基 酸；“终点”=与肽比对的蛋白质的终止氨基酸 蛋白条带编号存在于条带泳道3(中)> 泳道4(中)、泳道5(中 >、泳道6(中)牛(gi75051662)妊娠;te关糖J!■白 19MH+电荷起点终点P(PeP)肽序列1760.8385032122291.00E-06KDKQEGSVVMFGGVDHRY (SEQ ID N0:70)1088.5371121261374.36E-06KTFSITYGSGRI (SEQ ID NO:71)2243.0661632132311.32E-03DKQEGSVVMFGGVDHRYYR (SEQ ID NO:72)1046.5305223613709.55E-04RLYFSVFDRG (SEQ ID NO:73)1770.9061321962136.03E-09KNQGAISEPVFAFYLSKD (SEQ ID NO:74)表6.在第55天和第215天胎盘组织中表征的PAG同工型 表4所示的多肽序列使用例如来自PHYLIP软件包(Felsenstein，1989)的 PROTDIST v. 3. 5c进行比对。对比对的序列应用PR0TDIST的相邻系统发生树分析包，以产 生如图15所示的树。PAG的比对显示在图16中。对PAG同工型1、4、6、9、16、17、19、20和 21进行这种分析，以基于它们的相似性和差异区显示同工型的相关性。根据该分析，除PAG 1 以外，PAG 4、6、9、16、17、19、20 和 21 聚类在一起。
氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺根据本申请的公开内容，此处公开和请求保护的所有组合物和方法不需要过多的 实验都可以制备和实施。尽管已经通过优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是 本领域技术人员应当明白，可以对此处所述的组合物和方法的步骤或步骤顺序进行改变， 而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，应当明白，某些化学和生理学均相关的 试剂可以替换此处所述的试剂，而获得相同或相似的结果。本领域技术人员明白的所有这 些类似的替代物和改变都被认为处于由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念 之内。参考文献以下参考文献通过参考具体并入本文，提供用于补充本文所述内容的示例性的程 序上的或其它方面的细节美国专利3646，346
美国专利3817，837
美国专利3850，752
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美国专利3996，345
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3权利要求
免疫学结合至少两种选自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、PAG20和PAG21的PAG的抗体或其片段。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段免疫学结合PAG4、PAG6、PAG9、 PAG16、PAG17、PAG19、PAG20 和 PAG21。
3.以ATCC保藏号PTA-8566保藏的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
4.以ATCC保藏号PTA-8566保藏的分离的细胞，或其产生抗体2D9的后代细胞。
5.编码抗体重链或轻链结构域的分离的多核苷酸，其中所述重链或轻链结构域选自a)与SEQID NO 1有至少97%的序列同一性的多肽序列；b)与SEQID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列；c)包含SEQID NO 1的多肽序列；和d)包含SEQID NO 2的多肽序列。
6.权利要求5的多核苷酸，其中所述结构域包含与SEQID NO :1有大于97%的序列同 一性的多肽序列。
7.权利要求6的多核苷酸，其中所述结构域包含SEQID N0:1。
8.权利要求5的多核苷酸，其中所述结构域包含与SEQID NO :2有大于92%的序列同 一性的多肽序列。
9.权利要求8的多核苷酸，其中所述结构域包含SEQID N0:2。
10.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸被进一步定义为编码SEQID N0:3的 多肽序列。
11.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸被进一步定义为编码SEQID N0:4的 多肽序列。
12.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:5。
13.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:6。
14.一种包含抗体重链或轻链结构域的分离的多肽，其中所述重链或轻链结构域选自a)与SEQID NO 1有至少97%的序列同一性的多肽序列；b)与SEQID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列；c)包含SEQID NO 1的多肽序列；和d)包含SEQID NO 2的多肽序列。
15.权利要求14的多肽，其进一步限定为包含与SEQID NO :1有至少97%的序列同一 性的序列和与SEQ ID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列。
16.权利要求15的多肽，其中所述多肽免疫学结合选自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、 PAG17、PAG19、PAG20 和 PAG21 的至少第一 PAG。
17.包含权利要求14的多肽的抗体或其片段。
18.—种检测牛动物怀孕的方法，包括a)从牛动物获得样品；b)使该样品接触权利要求1的抗体或其片段；和c)确定该样品是否含有能够被所述抗体或其片段免疫学结合的至少第一妊娠相关抗 原(PAG)，其中样品中存在该PAG指示怀孕。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体或其片段是单克隆抗体2D9。
20.权利要求18 的方法，其中所述 PAG 选自 PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、 PAG20 禾口 PAG21。
21.权利要求20的方法，其中所述PAG是PAG6。
22.权利要求18的方法，其中确定样品是否含有至少第一妊娠相关抗原包括ELISA或 Western印迹法。
23.权利要求22的方法，其中所述ELISA是夹心ELISA，包括PAG与固定到基底上的抗 体或其片段和酶标记的第二抗体制品的结合。
24.权利要求23的方法，其中所述酶是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
25.—种试剂盒，包括(a)权利要求1的抗体或其片段；和(b)所述抗体或其片段的容器。
26.权利要求25的试剂盒，进一步含有用于检测所述抗体或其片段与至少第一妊娠相 关抗原(PAG)之间的免疫结合的装置。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述抗体或其片段附着到支持体上。
28.权利要求27的试剂盒，其中所述支持体是聚苯乙烯板、试管或试条。
29.权利要求25的试剂盒，进一步包括可检测标记。
30.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记是荧光或化学发光标记。
31.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记是酶。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述酶是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
33.一种纯化至少第一妊娠相关抗原(PAG)的方法，包括a)获得包含至少第一妊娠相关抗原(PAG)的样品；和b)基于PAG对权利要求1的抗体或其片段的亲和力，相对于所述样品纯化PAG。
34.权利要求33的方法，其中所述样品从第50天到第250天的牛胎盘获得。
35.权利要求34的方法，其中所述样品从第61天到第250天的牛胎盘获得。
36.权利要求33的方法，其中所述纯化包括免疫沉淀、Western印迹法或免疫亲和色谱法。
全文摘要
本文公开了用于检测动物怀孕的抗体和方法。在某些方面，使用的抗体免疫学结合至少两种选自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、PAG20和PAG21的PAG。也提供了编码抗体的核酸，以及试剂盒、使用方法和另外的抗体相关组合物。
文档编号G01N33/53GK101918445SQ200880124722
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月13日
发明者J·格林, M·F·麦克格拉斯, N·马赛亚拉甘, R·M·罗伯斯 申请人:孟山都技术公司;密苏里大学管理者