专利名称：一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法
技术领域：
本发明涉及疫苗的制造与检验，具体涉及一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑 的染色计数方法。
背景技术：
近年来，重组鸡痘病毒活疫苗研制己成为疫苗研制的热点，许多国家已有 产品获准生产。在我国禽流感重组鸡痘病毒活疫苗已上市，还有多个产品处于
临床试验阶段。常用的鸡痘病毒活疫苗空斑形成单位(PFU)计数方法多以琼脂 覆盖法或显微镜下直接计数法进行。琼脂覆盖法操作繁琐，影响因素多，空斑 出现迟；显微镜下直接计数时常常因为空斑不典型，特别是孔板或培养瓶边缘 的空斑难以确认，或有细胞团块干扰，造成计数不准确。因此，在重组鸡痘病 毒活疫苗制造和检验中，迫切需要一种简易、快速、准确的检测疫苗病毒PFU
的方法。
技术内容
为了克服现有重组鸡痘病毒活疫苗空斑计数方法操作繁琐、计数不准确的 不足，本发明提供一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，有效地解决 了问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，是将重组鸡痘病毒活疫苗
10倍系列稀释，接种24孔培养板培养的次代CEF，每个稀释度接种3孔，72h 终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加 500ug/ml X-gal染色液染色，37'C培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放 倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量(PFU)。
由于近几年研制的重组鸡痘病毒活疫苗，插入的筛选标记基因一般都选择LacZ基因(表达e-半乳糖苷酶)，本研究利用重组鸡痘病毒携带UcZ标记 基因特点，建立了用X-gal直接进行病毒空斑染色计数PFU的方法。本方法可适 用于所有选择LacZ基因作为标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗的PFU检测。
X-gal染色原理是X-gal被重组鸡痘病毒表达的e -半乳糖苷酶裂解成半 乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚，5-溴-4-氯-3-羟基吲哚然后被氧化成5, 5'-二溴-4，4'-二氯-靛蓝(蓝色产物)。
本发明的有益效果是，X-gal染色计数法，细胞培养终止时间为72h，而 常规的琼脂覆盖法计数空斑要5 6天。染色计数法计数时，培养板边缘空斑染 色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰，识别容易，使得PFU计数快速而准确。
图l是X-gal染色的rFPV-llSH5A空斑(100 X)
A. 接种72h，染色的空斑。
B. 位于孔板边缘的染色空斑。
C. 接种48h,空斑染色细胞少
图2是两种PFU计数方法的计数结果
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员 通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这 些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方 法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
重组鸡痘活疫苗(rFPV-llSH5A):(陈素娟，孙蕾，石火英，彭大新，刘秀 梵；《禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达》中国兽医 学报，2007 ，27 (2 ): 200-2002)
实施例l.表达禽流感HA基因重组鸡痘活疫苗(rFPV-llSH5A)的检测。 取实验室制备的8批次rFPV-llSH5A疫苗细胞苗，分别进行染色计数法计数和 直接计数法计数。
染色计数法计数:rFPV-llSH5A疫苗细胞苗IO倍系列稀释，各取100ul 10'4 l(T6稀释度的病毒，接种到24孔培养板培养的次代鸡胚成纤维细胞(CEF)上， 每个稀释度接种3孔，吸附2h，加维持液，37°C C02培养箱，72h终止培养， 吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal 染色液染色，37'C培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放倒置显微镜下计 数蓝染的空斑。培养板边缘空斑染色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰， 识别容易，见图l。
染色计数法计数的PFU数是直接计数法的1. 6-3. 3倍，见图2。
权利要求
1、一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，其特征在于，是将带LacZ标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗稀释，接种次代CEF，72h终止培养，吸去培养液，加戊二醛固定液固定，吸去固定液后，加X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜或8-12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量。
2、 根据权利要求1所说的重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，其特 征在于，具体操作是将重组鸡痘病毒活疫苗10倍系列稀释，接种24孔培养 板培养的次代CEF，每个稀释度接种3 L， 72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L 戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37°C 培养箱过夜或8-12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫 苗病毒含量。
全文摘要
本发明涉及一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法。该方法是将带LacZ标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗稀释后接种次代CEF，72h终止培养，加戊二醛固定液固定后，用X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜或8-12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量。本发明方法与现有技术相比，具有操作简单、耗时短、计数准确的优点。
文档编号G01N1/30GK101566579SQ20091002729
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者刘秀梵, 彭大新, 甘军纪 申请人:扬州大学