专利名称：基于近红外光谱技术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法
技术领域：
本发明涉及中成药、保健食品或食品的分析技术领域，具体涉及一种对中 成药、保健食品或食品进行快速无损检测的方法，尤其涉及一种基于近红外光 谱技术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法。
技术背景中药具有毒副作用小，效果好，作用及疗效可靠等优点，不但国人一直认 可，而且国际上也兴起了中药热。 一些不法分子在利益的驱使下，利用西药疗 效快、作用迅速和中药成分复杂的特点，在中成药中违法添加化学药物，并随 意夸大疗效，高价销售牟取暴利，给人民群众的身体健康造成了严重危害，影 响中药声誉。当前，很多保健食品和食品也打着中药的旗号，鱼目混珠，滥竽 充数。虽然在中成药中添加化学成分本身并不违规，国家也曾批准了很多这样 中西药结合的药物，目的是将中药的调理作用与西药的速效有机结合起来，但 中西药结合必须经过严格的临床实验，擅自添加是一种非常危险的行为，会对 患者的生命安全带来不可预料的危害。中药本身成分复杂，各成分之间干扰严重，检验标准还很不完善。单味的 中药成分已很复杂，复方中成药其化学成分更为复杂多样，加上生产工艺的影 响，使得中成药中添加化学成分的鉴别方法要求更具专属性。目前常用的检测 分析手段有理化反应、薄层色谱、高效液相色谱法、高效液相色谱一质谱联用 等技术，其中最有效的手段是高效液相色谱一质谱联用方法，但该方法存在仪器价格昂贵、维护成本较高、操作繁琐、分析周期长、对仪器操作人员的要求 高，且只能在少数检测条件较好的实验室中使用等问题。针对当前中成药、保健食品和食品中擅自添加化学成分的行为日益猖獗， 严重威胁人民群众的身体健康，而我国现行质量标准尚不能对此进行有效监 管，监管覆盖面太小等问题，大力发展药品的快速检测技术是解决此问题的有 效手段之一。快速检测技术能够在现场对药品进行快速检测和筛查，将可疑样 品带回实验室后用法定检验方法确证。通过应用快速检测技术，监督检验的效 率将大大提高、成本大大降低、监管覆盖面大大增加，将成为打击非法添加行 为的有力工具。公开号专利CN1275038C采用酸化提取、氧化去除干扰和三硝基苯酚沉淀 三个步骤的理化反应方法检测西地那非；公开号专利CN101021483A采用有 机溶剂提取、浓硫酸显色两个步骤的理化反应方法检测他达拉非及其衍生物， 但是这些方法存在需对样品进行预处理，需使用化学试剂，分离过程相对麻烦， 不能同时对添加的多种化学成分进行检测鉴别等不足。近红外光谱技术是20世纪90年代以来发展最快、最引入注目的光谱分析 技术之一，它与化学计量学和计算机软件技术有机结合后在药物分析、过程控 制等方面得到了迅速的发展。近红外光谱主要为有机分子的倍频和合频吸收， 能够获得样品分子结构、组成和物理状态的丰富信息，它具有无需对样品预处 理，不使用化学试剂，不破坏样品，分析速度快，收集信息量大，能在几分 钟内仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集即可完成其多项性能 指标的测定，对于经常性的质量监控是十分经济和快速的。与常规分析技术不同，近红外光谱是一种间接分析技术，必须通过建立校正模型来实现对未知样品的定性或定量分析，具体的分析过程主要包 括以下几个步骤 一是选择有代表性的样品并测量其近红外光谱；二是采 用标准或认可的参考方法测定关心的组分或性质数据；三是将测量的组分 或性质数据与近红外光谱进行关联，用适当的化学计量方法建立鉴别模 型；四是测定未知样品组分或性质。发明内容本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种基于近红外光谱技 术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法，检测速度快、不 破坏样品、无需样品预处理、不使用化学试剂，可同时检测多种化学成分，能 满足日常监督检验的需要。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的一种基于近红外光谱技术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成 分的方法，该方法包括建立定性鉴别模型和未知样品检测两个阶段在建立鉴 别模型阶段，需要收集各种添加已知化学成分的代表性阳性样品和阴性样品， 用已知的检验方法测定添加已知化学成分的种类和数量，同时采集近红外光 谱，通过化学计量学方法建立添加化学成分信息与近红外光谱的关联关系即鉴 别模型；在未知样品的检测阶段，采集未知样品的光谱后用鉴别模型判断样品中是否添加了化学成分，模型自动将样品光谱与建模样品库中的参考光谱进行 比较后给出判别结果，就可将添加有化学成分的样品快速筛查出来。 上述方法具体包括如下步骤-(1) 收集不同厂家不同品种的样品作为代表性样品建立参考样品库；(2) 采集参考样品库中各代表性样品的近红外光谱；(3) 用已知的检验方法对参考样品库中各代表性样品进行定性和定量分析，并区分阳性样品和阴性样品；(4) 收集待检测化学成分的对照品并采集近红外光谱；(5) 根据步骤(2)所得各光谱和步骤(4)所得光谱，选择特征谱段，通 过化学计量学方法建立鉴别模型；(6) 采集待测样品的近红外光谱，并利用步骤(5)建立的鉴别模型进行分 析，判断待测样品中是否添加化学成分。上述方法主要是对中成药、保健食品或食品中是否添加化学成分进行快速 检测，所述化学成分包括很多，主要是指在中成药、保健食品或食品中非法添 加的一些化学成分，如补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中非法添加PDE5 型抑制剂(phosphodiesterase type隱5 inhibitor,磷酸二酯酶5型抑制剂)就是其 中的一种典型代表，包括西地那非类、他达拉非类、红地那非类等化学成分， 添加情况普遍，且针对检验标准的高科技造假日益增多。上述步骤(1)中，鉴别样品中是否添加化学成分需要将未知样品光谱与 参考样品光谱进行比较，因此建立稳定可靠的参考样品库，应尽可能从不同的 途径收集各种不同品种、不同生产厂家的样品。 一般情况下，参考样品库应至 少包括IO个以上阳性样品或10个以上阴性样品。如建模初期收集阳性样品比 较困难，可根据该化学成分的有效剂量和用量加入拟检化学成分自制阳性样叩o上述步骤(2)中，对参考样品库中的样品进行近红外光谱分析时应针对不同的样品剂型选择合适的检测方式固体制剂一般采用漫反射方式(如光纤 漫反射和积分球漫反射等)；液体制剂一般采用透射方式。对于胶囊剂，近红外光能穿透胶囊壳，根据需要可透过胶囊壳测量样品，也可收集胶囊内的样品直接测试；对于糖衣片，需要去除糖衣后测量；对于薄膜衣片，浅色薄膜衣可以直接测量，黑色或棕褐色薄膜衣需要去除薄膜衣后测量。上述步骤(3)中，选择国家标准方法或文献方法对参考样品库中的各样 品分别进行定性和定量分析，测定参考样品库中各样品是否添加化学成分以及 添加的化学成分的量。 一般采用液相色谱和液质联用方法进行定性和定量分 析。上述步骤(4)中，根据步骤(3)的分析结果，可以判断出样品库中各样 品添加什么化学成分，然后收集这些化学成分的对照品，采集近红外光谱；上述步骤(5)中，将上述步骤(4)获得的近红外光谱和上述步骤(2) 获得近红外光谱进行对比，找出添加化学成分的特征谱段。特征谱段的选择是 建立鉴别模型的关键步骤，样品中所添加化学成分的特征谱段应能够区分阳性 样品和阴性样品，因此建立鉴别模型时应尽量选择在步骤(4)的光谱中吸收 值较强而且在步骤(2)的阴性样品光谱中无干扰的特征谱段进行建模。上述步骤(5)中，通过对比步骤(4)和步骤(2)的近红外光谱得到化 学成分的特征光谱后，再通过化学计量学方法，结合步骤(3)的定性定量分 析结果，建立是否添加化学成分的定性鉴别模型。通过化学计量学方法建立定 性鉴别模型是本技术领域人员建立模型的常规操作，常用的化学计量学方法有 最近邻法、判别分析法、主成分分析法、聚类分析法或簇类独立软模式法(SIMCA)等。本发明人通过实验对比发现，采用最近邻法建模效果最好， 如可采用Bruker公司的OPUS软件的IDENT程序建立鉴别模型。IDENT程序定性分析的思路是判定未知样品光谱与建模样品库中平均参考光谱的差异。在分析过程中未知样品图谱与各平均参考光谱进行比较，比较 的结果称为光谱距离，也称为匹配值。未知样品光谱与平均参考光谱匹配越好， 距离越短，匹配值越小。有多种比较未知样品光谱与参考光谱的方法，例如标 准化法、因子化法、第一范围标定法、重现水平归一化法或主成分分析法等， 本发明优选采用因子化法，光谱距离的计算采用欧氏距离。因子化法是将谱图表示为因子谱的线性组合。因子法与传统的主成分分析 法类似，不同之处在于因子化法采用每一类样品的平均光谱进行分析。当有^类样品时，s张平均光谱转换为s张相互正交因子谱(loadings)的线性组合a = tla. f！ + t2a. f2 + t3a. f3 + ...其中a矢量表示一张光谱；因子谱表示为fp f2， f3等；t表示因子得分 (scores)。因子得分代表因子谱的贡献，因子得分数值越大，贡献越大，相应 因子谱的光谱强度也越大。因子化法能对复杂的近红外光谱数据进行降维处 理，有利于添加化学成分特征光谱的提取，建立鉴别模型时，选择化学成分特 征光谱的因子得分来建立模型。上述步骤(6)中，取需要检测的样品(如中成药、保健食品或食品等)， 先采集待测样品的近红外光谱，用步骤(5)建立的鉴别模型进行对比分析， 从而判断待测样品中是否添加化学成分。对比分析方法可采用本领域技术人员 在进行近红外光谱分析时常用的技术，如与阈值对比分析等。阈值是指对建模样品库中每一类样品平均参考光谱定义的一个欧氏距离 限度，就是给平均参考光谱定义的置信区间。建立鉴别模型的过程就是使参考 样品库中添加同一种化学成分的所有样品的单独参考光谱与它们平均参考光 谱的欧氏距离都小于阈值，而库中所有其它的光谱同这个平均参考光谱的欧氏距离都大于阈值。光谱a和光谱b的光谱距离D按下述方法计算光谱距离D越小，光谱a与光谱b越相似。阈值A的计算方法如下其中，A^为建模样品库中各参考光谱与平均参考光谱的最大距离值，s为标 准偏差，x是自定义的置信水平因子(缺省值为0.25)，如果待测样品光谱的 点落在添加同一种化学成分样品的置信区间内，即匹配值小于阈值，那么就认 为待测样品与参考样品库中添加了那种化学成分的样品属于同一类，否则就不 属于同一类。上述步骤(6)，通过鉴别模型对待测样品进行检测分析后，可初步判断出 待测样品中是否非法添加化学成分，对阳性样品还需要进一步抽验，用国家标 准方法或文献方法进一步地确认(如液相色谱和液质联用方法)。因此本发明 方法的主要作用是实现从大量的样品中快速筛查出是否非法添加化学成分的 可疑样品。在具体应用本发明的定性鉴别模型时，可根据实际应用情况适当地增加代 表性样品，扩充参考图谱图库，从而不断完善鉴别模型。本发明的方法中，所用到的建立鉴别模型的样品以及待测样品，其非法添 加的化学成分的浓度应在近红外光谱分析方法的可检测范围内。本发明的方法，在利用鉴别模型对待测样品进行检测时，可采用多层识别 的方法进行，多层识别是指基于某一特征谱段、光谱预处理方法和化学计量学 方法建立定性模型时，当这个条件不能完成所有建模品种的彼此识别而只能使 其中一部分品种彼此识别时，可以选择另外一组识别条件用来区分前一层模型不能区分识别的品种；这样的过程可以重复多次使用，直至能够将所有的阳性 样品与阴性样品完全区分识别。如添加了PDE5型抑制剂的样品称为阳性样品，未添加PDE5型抑制剂的样品称为阴性样品，因为PDEs型抑制剂分为西地那非类、他达拉非类和红地那非类等，所以阳性样品又可以细分，如添加西地那 非的称为西地那非阳性样品，添加他达拉非的称为他达拉非阳性样品等等。本 发明的近红外光谱鉴别模型应能够将各类阳性样品与阴性样品彼此区分识别， 需要时可通过上述多层识别的方式完成。本发明的方法，为了提高鉴别模型的准确性，可将同类样品进一步细分为 不同的亚类分别区分识别，如西地那非阳性样品又可分为西地那非阳性样品1或西地那非阳性样品2，阴性样品分为阴性样品1和阴性样品2。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1. 本发明采用近红外光谱技术对中成药、保健食品或食品中非法添加的化 学成分进行快速检测，检测速度快、且不破坏样品，无需样品预处理，也无需 使用化学试剂，可同时检测多种非法添加的化学成分，能够满足日常监督检验的需要，从而可以大大提高监督检验的效率，降低监督检验的成本；2. 本发明的方法收集代表性样品建立参考样品库，通过选择添加化学成分 的特征光谱，并将阳性样品和阴性样品细分为类和亚类，采用最近邻法和多层 识别的方式进行建模，使得定性鉴别模型更加准确；3. 本发明通过预先建立定性鉴别模型，后续只需要采集待测样品的近红外 光谱，通过阈值来判断待测样品光谱是否属于建模样品库中的参考光谱，即可 迅速检测出待测样品中是否含有非法添加的化学成分。目前文献报道了大量在补肾壮阳类样品中非法添加的PDE5型抑制剂，因 此本实施例以检测补肾壮阳类中成药、保健食品或食品中是否非法添加有 PDEs型抑制剂为例，详细介绍本发明方法的具体实施过程，但本实施例仅作 为本发明的示例而不对本发明做任何限定，本领域技术人员可以清楚地通过本 实施例的描述了解本发明，并应用于其他中成药、保健食品或食品中是否含有 非法添加的化学成分的快速检测。PDE5型抑制剂按照化学结构可以分为西地那非类(如枸橼酸西地那非、 豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非)、伐地那非类(如伐地那非、伪伐地那非)、 他达拉非类(如他达拉非、氨基他达拉非)和红地那非类(如红地那非、羟基 红地那非)等，其中添加频率最高的为西地那非，其次为他达拉非。非法添加 化学成分的剂型主要为硬胶囊剂，其次为片剂和丸剂。按照包装和剂型分别建立的近红外光谱分析模型准确性较高。结合收集样 品的实际情况，本实施例选择建立西地那非和他达拉非胶囊剂的鉴别模型，然 后对胶囊剂包装的补肾壮阳类中成药、保健食品和食品中是否添加PDEs型抑 制剂进行快速检测，其具体步骤如下(1) 从市场收集59个不同厂家不同浓度的补肾壮阳类样品作为代表性样 品建立参考样品库，包括中成药、保健食品和食品； .(2) 采集上述59个样品的近红外光谱用德国Bruker公司的MPA和 MATRIX-F型光谱仪分别采集近红外光谱，测量方式为光纤漫反射，透过胶囊 壳测量样品，测定条件为分辨率8cm'1，扫描次数32次，数据范围4,000至 12,000cm—1，检测器为铟镓砷，每个样品测量3次；(3) 对上述59个样品进行液相色谱和液质联用分析，定性分析区分阴性 样品和阳性样品，(本实施例定义添加了西地那非的样品为西地那非阳性样品， 添加了他达拉非的样品为他达拉非阳性样品，未添加西地那非和他达拉非的样品称为阴性样品)；根据液相色谱和液质联用分析结果，参考样品的59个样 品中西地那非阳性样品16个，他达拉非阳性样品17，阴性样品26个；(4) 收集西地那非和他达拉非对照品，分别采集近红外光谱；(5) 建立鉴别模型采用Bruker公司OPUS软件的IDENT程序建立定性 鉴别模型，具体步骤如下a. 根据步骤(3)的分析结果，按照所添加化学成分的种类和浓度，59个 代表性胶囊剂样品进一步细分为西地那非阳性样品1、西地那非阳性样品2、 西地那非阳性样品3、他达拉非阳性样品1、他达拉非阳性样品2、阴性样品1 和阴性样品2七个亚类。59个样品中，5个为西地那非阳性样品1， 9个为西 地那非阳性样品2， 2个为西地那非阳性样品3， 6个为他达拉非阳性样品1， 11个为他达拉非阳性样品2， 12个为阴性样品1， 14个为阴性样品2。样品数 量为5个或5个以上的采用平均光谱建模，低于5个的用原始光谱建模；b. 选择特征谱段对于补肾壮阳类样品，西地那非阳性样品的优选特征谱 段为6240cm" 5960cm—1和5670cm" 5635cm"，他达那非阳性样品的优选特征 谱段为6120cm" 6010cm"、 5900cm" 5860cm"、 5725cm" 5690cm"和5670 cm-1~ 5635 cm-1。C.光谱的校正与预处理光谱校正与预处理是本领域技术人员在对光谱进 行分析处理时的常规操作，其作用是将光谱规范化、消除背景干扰、提高光谱 质量，并将隐藏在图谱中信号差异放大出来，使定性鉴别更加直观、可靠。本实施例选择"二阶导数"与"矢量归一化"的组合作为预处理方法；d. 选择因子化法计算光谱距离， 一般选择1 2个因子；e. 模型验证与模型参数的优化验证建模样品库中不同品种平均光谱的置 信区间是否重叠，如果发现重叠，需要通过选择不同的谱段、因子得分、平滑 点、调整阈值等方法去除重叠；本实施例采用多层识别(五层)将上述阳性样 品与阴性样品完全区分识别第一层识别西地那非阳性样品1和西地那非阳性样品2;第二层识别西地那非阳性样品3;第三层识别他达拉非阳性样品1; 第四层识别他达拉非阳性样品2;第五层为阴性样品l和阴性样品2，不需要 进一步区分识别，定义为一类；用上述五层识别方式建立的定性模型，能将建模样品库的上述七个亚类完 全区分鉴别。(6)利用上述步骤(5)建立的鉴别模型对未知样品进行分析，检测样品中是否添加PDE5型抑制剂，结果判定规则如下a.鉴别模型的判别结果有四种"西地那非阳性"(包括西地那非阳性样品 1、西地那非阳性2和西地那非阳性3)、"他达拉非阳性"(包括他达拉非阳性 样品1和他达拉非阳性2)、"阴性"(包括阴性1和阴性2)和"其他"(即不 能识别)；PDE5型抑制剂的化学结构比较相似，添加了其他PDE5型抑制剂的 样品极有可能在与西地那非和他达拉非阳性样品的特征谱区也出现类似的特 征谱段，因此判定结果为"其他"有可能是样品中添加了除西地那非和他达拉 非的其他PDEs型抑制剂，如伐地那非、红地那非、羟基豪莫西地那非等；虽 然本实施例的鉴别模型只选择了西地那非和他达拉非阳性样品，但也能同时鉴 别出其他结构相似的PDE5型抑制剂；当待测样品介于两类西地那非阳性置信区间之间或两类他达拉非阳性置信区间之间、又不位于阴性样品的置信区间 时，判定结果也会为"其他"；因此，除阴性外，"西地那非阳性"、"他达拉非 阳性"和"其他"均判定为阳性；b. 补肾壮阳类样品中存在多种添加PDEs型抑制剂的情况，大部分添加一种化学成分，其次为添加两种化学成分，添加三种及以上化学成分的样品较少； 本发明的方法主要是对样品进行快速筛査，筛查出来的可疑样品还需用液相色 谱和液质联用分析等技术进一步确认，因此本发明的定性鉴别模型的判定规则 为不管样品中添加了几种PDE5型抑制剂，只要鉴别出添加了其中一种即判断 为阳性；c. 补肾壮阳类样品中添加的PDE5型抑制剂种类很多，绝大部分为西地那 非、伐地那非和他达拉非的衍生物，当添加了其他PDEs型抑制剂被判断为西 地那非阳性或他达拉非阳性时，结果正确。从市场收集305个不同厂家不同浓度的补肾壮阳类样品作为未知样品采 用本实施例的方法进行检测，同时将这305个未知样品采用液相色谱和液质联 用分析，将两种方法的检测结果进行比较，结果发现假阳性样品2个，假阴性 样品2个，准确率达到98.7%，由此说明本发明的基于近红外光谱技术快速检 测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法能够满足监督检验在现场对 样品进行快速无损筛査的要求。
权利要求
1、一种基于近红外光谱技术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法，其特征在于该方法包括建立鉴别模型和待测样品检测两个阶段，具体包括如下步骤(1)收集不同厂家不同品种的样品作为代表性样品建立参考样品库；(2)采集参考样品库中各代表性样品的近红外光谱；(3)用已知的检验方法对参考样品库中各代表性样品进行定性和定量分析，并区分阳性样品和阴性样品；(4)收集待检测化学成分的对照品并采集近红外光谱；(5)根据步骤(2)所得各光谱和步骤(4)所得光谱，选择特征谱段，通过化学计量学方法建立鉴别模型；(6)采集待测样品的近红外光谱，并利用步骤(5)建立的鉴别模型进行分析，判断待测样品中是否添加化学成分。
2、 根据权利要求l所述方法，其特征在于所述步骤(3)中，对参考样品 库中的各代表性样品进行定性和定量分析后，将同类样品进一步细分为不同的 亚类分别区分识别。
3、 根据权利要求l所述方法，其特征在于所述步骤(5)中，选择特征谱 段建立鉴别模型是选择在步骤(4)的对照品近红外光谱中吸收值较强而且在 步骤(2)阴性样品的近红外光谱中无干扰的特征谱段。
4、 根据权利要求1步骤(5)所述方法，其特征在于所述建立鉴别模型采 用最近邻法。
5、 根据权利要求l的方法，其特征在于所述步骤(5)中，建立鉴别模型 时通过多层识别区分各种建模品种。
6、根据权利要求l的方法，其特征在于所述步骤(6)中，采用阈值来判 断样品近红外光谱是否属于建模样品库中的参考光谱。
全文摘要
本发明公开一种基于近红外光谱技术快速检测中成药、保健食品或食品中添加化学成分的方法，该方法包括六个步骤(1)收集代表性样品建立参考样品库；(2)采集参考样品库中各样品的近红外光谱；(3)用已知检验方法对参考样品库中的各样品进行定性和定量分析；(4)收集待检测化学成分的对照品，采集近红外光谱；(5)选择特征谱段，用适宜的化学计量学方法建立定性鉴别模型；(6)采集待测样品的近红外光谱，利用定性鉴别模型对该近红外光谱进行分析，从而判断出待测样品中是否添加有化学成分。本发明检测速度快、不破坏样品、无需样品预处理、不使用化学试剂、一次实验可同时检测多种非法添加的化学成分，能够满足日常监督检验的需要。
文档编号G01N21/49GK101620178SQ200910040388
公开日2010年1月6日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者严全鸿, 毅 雷, 饶春意 申请人:广东省药品检验所