专利名称：乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法
技术领域：
本发明涉及一种水产动物发育及核行为观察的荧光染色方法，特别涉及乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法。
背景技术：
乌贼，俗称墨鱼，属头足纲，十腕目。乌贼肉含有多种氨基酸，营养丰富，肉味鲜美。乌贼墨有凝血作用，主要用于止血，治疗血性疾病；还可保护造血干细胞，含有抗癌物质，具有抗肿瘤活性；乌贼骨称海螵蛸，具有收敛、制酸、止血等功效，曾是我国的四大渔业对象之一，对温度的适应性较强，在我国沿海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。由于过度捕捞和生态恶化，自20世纪70年代以来，先后出现了衰退现象。有关乌贼胚胎发育及核行为的基础研究，国内外报道都很少。对乌贼的胚胎发育及核行为观察，旨在为乌贼基础生物学研究积累资料，为乌贼的苗种生产及后续的增养殖提供理论依据。研究人员在观察了乌贼幼体的胚胎时，由于在镜检时过程中乌贼墨颜色为黑色，会严重影响肉眼的镜检的准确性，所以需要一种新的方法来解决这一问题，另外普通肉眼镜检方法必需剥去受精卵的卵膜，而破坏受精卵表面存在的物质及结构，甚至导致整个卵变形，严重影响观察结果的客观性。
发明内容
本发明的目的是提供乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，以此解决乌贼墨影响镜检效果、普通镜检完全卵膜而破坏受精卵表面存在的物质及结构的技术问题，并且该操作方法步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤
① 选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；
② 将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4'C保存，并且保存期间更换固定液2
次至4次；③ 将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗2次至3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；
④ 将经步骤(D处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。
为优化上述技术方案，采取的技术措施还包括
步骤②中固定液按重量分数含有戊二醛2份至4份、多聚甲醛2.5份至5份、过滤海水90份至96份。
步骤③中的染色剂为4， 6-二脒基苯基吲哚，染色时间为30min至50min。步骤③中的染色剂为Hoechst33258荧光染料，染色时间为5min至8min。缓冲液为pH7. 4的磷酸缓冲液。步骤 中，荧光显微镜的观察波长为360nm至370nm。
步骤①乌贼卵的长径为7.5mm至15.0mm、短径为6. 5mm至9. Omm;乌贼卵的内的卵黄长径为3. 0mm至3. 6mm、短径为2. 3mm至2. 9mm。
过滤海水中含有磷酸缓冲液，并且磷酸缓冲液在过滤海水中的浓度为0.1mol/L。过滤海水中含有1 g/mS至100g/m3的EDTA钠盐。与现有技术相比，本发明的优点在于
1. 将受精卵进行固定，可以在很长的时间内进行观察，不受胚胎发育时间的限制，且卵形保存完整，避免活体卵质地较软操作不便的影响。
2. 此方法可以解决卵为非透明的乌贼的胚胎观察时所遇到的必须剥去卵膜造成受精卵表面存在的物质及结构遭到破坏问题。3. 荧光染色后在观察前用锋利薄刀片将卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，利于观察，由于选取的避免了卵个体适中，可以有效避免椭球形无法在玻片上观察到动物极发育的过程的缺陷。
4. 本发明方法的步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜
下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。
图1是本发明实施例的乌贼胚胎核行为观察效果图。
具体实施例方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例l:乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤① 选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；
② 将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4'C保存，并且保存期间更换固定液3
次；
③ 将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；
④ 将经步骤③处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。
步骤②中固定液按重量分数含有戊二醛2份、多聚甲醛2.5份、过滤海水95.5份。步骤③中的染色剂为4,6-二脒基苯基吲哚，染色时间为30min。其中4 , 6-二脒基苯基B引哚为4' ，6' -2 diamidino-2-phenylindole hydrochloride。缓冲液为pH7. 4的磷酸缓冲液。步骤④中，荧光显微镜的观察波长为365nm。
步骤①乌贼卵的长径为7.5mm、短径为6. 5mm;乌贼卵的内的卵黄长径为3. Omm、短径为2. 3mm。
实施例2:乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤-
① 选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；乌贼卵，个体大，呈椭球形被包三层卵膜，细胞分裂、发育发生在动物极(卵小头)，外层卵膜结构致密，不利于本发明方法所用的固定液的渗透，故要出去外层的两层卵膜，只保留最内的一
层卵膜；保留最内的一层卵膜的另一个优点在于卵不会变形，且不会破坏受精卵表面存在的物质及结构，确保观察结果的准确性。
② 将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4'C保存，并且保存期间更换固定液4次。适当次更换固定液能确保固定液充分均匀的渗透进乌贼卵，利于对其核行为状态的固定。
③ 将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；缓冲液冲洗能去除多余的附着在卵表面的固定液，排除多余固定液对染色剂的干扰，从而保证观察结果与背景的清晰度。
④ 将经步骤③处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。
步骤②中固定液按重量分数含有戊二醛2份、多聚甲醛2.5份、过滤海水95.5份。步骤③中的染色剂为Hoechst33258荧光染料，染色时间为5min。
5缓冲液为pH7. 4的磷酸缓冲液。
步骤④中，荧光显微镜的观察波长为365nm。
步骤①乌贼卵的长径为15.0mm、短径为9.0ram;乌贼卵的内的卵黄长径为3. 6mm、短径为2. 9mm。
过滤海水中含有磷酸缓冲液，并且磷酸缓冲液在过滤海水中的浓度为0.1mol/L。过滤海水中含有5g/m3的EDTA钠盐。
本发明方法将受精卵进行固定，可以在很长的时间内进行观察，不受胚胎发育时间的限制，且卵形保存完整，避免活体卵质地较软操作不便的影响。并且可以解决卵为非透明的乌贼的胚胎普通镜检观察时所遇到的必须剥去卵膜造成受精卵表面存在的物质及结构遭到破坏问题。
荧光染色后在观察前用锋利薄刀片将卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，利于观察，由于选取的避免了卵个体适中，可以有效避免椭球形无法在玻片上观察到动物极发育的过程的缺陷。本发明方法的步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
权利要求
1、乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是具有如下步骤①选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；②将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4℃保存，并且保存期间更换所述的固定液2次至4次；③将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗2次至3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；④将经步骤③处理后的所述的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。
2、 根据权利要求l所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是-步骤②中所述的固定液按重量分数含有戊二醛2份至4份、多聚甲醛2.5份至5份、过滤海水90份至96份。
3、 根据权利要求2所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是步骤③中的染色剂为4， 6-二脒基苯基吲哚，染色时间为30min至50min。
4、 根据权利要求2所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是步骤③中的染色剂为Hoechst33258荧光染料，染色时间为5min至8min。
5、 根据权利要求3或4所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是所述的缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液。
6、 根据权利要求5所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是步骤④中，所述的荧光显微镜的观察波长为360nm至370nm。
7、 根据权利要求6所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是步骤①所述的乌贼卵的长径为7.5mm至15.0mm、短径为6. 5mm至9. Omra;所述的乌贼卵的内的卵黄长径为3. 0咖至3. 6ram、短径为2. 3mm至2. 9咖。
8、 根据权利要求5所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是所述的过滤海水中含有磷酸缓冲液，并且所述的磷酸缓冲液在所述的过滤海水中的浓度为0.1mol/L。
9、 根据权利要求6所述的乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其特征是所述的过滤海水中含有lg/r^至100g/mS的EDTA钠盐。
全文摘要
本发明公开了乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤①选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；②将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4℃保存，并且保存期间更换固定液2次至4次；③将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗2次至3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；④将经步骤③处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。其具有不破坏受精卵表面存在的物质及结构的优点，并且该操作方法步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。
文档编号G01N21/64GK101493414SQ20091009630
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者吴常文, 徐佳晶, 迟长凤 申请人:浙江海洋学院