专利名称：稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用。
背景技术：
戊型肝炎病毒(H印atitis E virus, HEV)是一种经粪口途径传播的非甲-非乙 型肝炎病毒，可以在人群引起暴发流行，主要侵害青壮年，在孕妇可造成20%的病死率， 1986-1988年我国新疆南部地区因饮水污染导致戊型肝炎流行，共计发病119280例，死亡 707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年来戊型肝炎发病率有逐年增加的趋 势，据我国卫生部统计，戊肝发病率2003年比2002年上升40. 4%。因此，戊肝防控已列入 各级公共卫生机构的工作日程。 近年来研究发现HEV可以感染猪、牛、羊、鼠、鸡等，在猪和鼠的抗体阳性率高于 50%，由此推测动物是HEV传播的重要中间宿主。基因序列分析表明从动物体内分离的戊 型肝炎病毒与人的HEV有极高的基因同源性，并且已有人食用野猪肉和鹿肉而感染戊肝的 报道，证明戊肝是一种可以通过食物传播的人畜共患疫病。葛胜祥等(2003)对我国20个 省、市、自治区的120个养猪场的8626只成年猪进行了 HEV血清学调查，结果表明平均感染 阳性率为83.4%，其中最高省份为内蒙古(100%)，最低为湖北(68%)。鉴于我国HEV居 高不下的感染率，对猪戊肝病毒的表位进行研究，建立特异、有效的猪戊肝检测方法，研制 安全、有效的猪戊肝疫苗，了解的流行发病规律，阻断该病由猪向人的传播，对于保证人民 的健康安全意义重大。 近年来，越来越多的戊型肝炎诊断试剂盒被研制开发出来。评价诊断试剂盒的标 准应包括灵敏度、特异性、精密性及稳定性等方面。其中稳定性为评价该诊断试剂的重要指 标，即试剂制备后，经过一段时间贮存和运输，活性是否改变，是试剂内在质量的重要方面。 先进的酶联试剂盒抗原预包被在微孔板上，酶结合物稀释至工作浓度，显色剂配成液体，以 上三种成份活性易丢失。如何使其稳定是一重要研究课题，有关这方面的报道甚少。戎广亚 等戎广亚，孙杰，周继文等，新型戊型肝炎诊断试剂盒的研制及其应用，中国病毒学，1998， 13(1) :64-69对人戊型肝炎诊断试剂盒中的封闭液和酶结合物稀释的稳定性进行研究，结 果证明海藻糖加入封闭液中可有效地保护戊肝抗原活性，海藻糖加入酶结合物中可以使 稀释至工作浓度的HRP-羊抗人IgG活性稳定。但是，到目前为止，还没有稳定剂海藻糖在 猪戊肝诊断试剂盒的应用报道。 虽然猪戊肝研究越来越得到科学界的重视，但目前国内外对猪戊肝的研究多限于 局部区域的流行病学调查和一些简单的动物感染试验，在猪戊肝防控研究方面尚有以下有 待回答问题和技术瓶颈。即目前还没有猪戊肝病毒的表位研究报道，市场上用于猪戊肝检 测的试剂盒是用于人戊肝检测的试剂盒，虽然猪戊肝病毒与人戊肝病毒序列同源性很高， 但是他们之间毕竟还是有些差别，用人的戊肝病毒表位来检测猪戊肝病毒就特异不高，不 能特异反映出猪戊肝流行规律。因此研制稳定、快速、特异猪戊肝诊断试剂盒，一方面可以 用于猪戊肝流行的监控；另一方面也可以控制猪戊肝的流行，阻断戊肝由猪向人传播打下坚实的基础，对于保证人民的健康安全意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用，利用稳定剂海藻糖能在酶结合物稀释液保持稳定的功能，来维持猪戊肝病毒试剂盒的稳定性。 本发明所述的猪戊肝病毒试剂盒以Zhao Kai等Zhao Kai， Liu Qiwen， YuRuisong， et al. Screening of specific diagnostic peptides of swine hepatitisEvirus-Virol J，2009，6 :186-doi :10. 1186/1743-422X-6-186.筛选出来的来自猪HEVswCH25的合成多肽swHEVll作为包被抗原制作而成，其制备方法如下
抗原稀释取10ul浓度为10mg/ml的多肽(将5mg合成的多肽溶解在0. 5ml 二甲基亚砜(DMS0)而得)与90ul PBS液混匀，得到的抗原稀释液溶度为lug/ul。再取15ul抗原稀释液与5ml包被液混匀，得到的抗原稀释溶度为3ug/ml。在酶标板上加入抗原稀释溶度100ul/孔，4。C包被12h。 封闭吸去包被夜，每孔加入200ul封闭液于37t:封闭2h后，用TBST液洗板3次后，拍干，将酶标板封好放入4t:下，以备后用。
所述猪戊肝病毒试剂盒的主要成分为 猪HEV阳性对照血清、猪HEV阴性对照血清、HRP标记IgG酶结合物稀释液、样品稀释液、0. 1% TBST(洗涤液)、底物溶液、终止液。 所述稳定剂海藻糖能保持该猪戊肝诊断试剂盒在诊断猪戊肝病毒抗体的稳定性。
其中，在该猪戊肝诊断试剂盒的酶结合物稀释液中添加有海藻糖，其添加量为酶结合物稀释液的8-12wt^。其具体应用如下 当酶标记抗体稀释至工作浓度后，活性很不稳定。本发明在稀释液中加入酶结合物稀释液10wt^的海藻糖稳定剂，观察稳定剂对辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG保护作用。加入稳定剂后，酶标抗体至37t:、4d后，活性无明显变化，而不加稳定剂酶标抗体活性几乎完全丧失(参见表l)。说明稳定剂海藻糖对二抗具有稳定保护的作用。
表1酶结合物稀释液对抗原活性的保护作用
温度吸光度
12
4°C0，0.卯2
37。C 4d0.0421.169 其中1为酶结合物稀释液中不含海藻糖，2为酶结合物稀释液中含有海藻糖。
有益效果 本发明利用稳定剂海藻糖能使酶结合物稀释液保持稳定的功能，有效地维持了猪戊肝病毒试剂盒的稳定性。
具体实施例方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
—、实验试剂和材料 多肽swHEVll (由GL-Biochem(shanghai) Ltd.多肽合成仪合成)，Na2HP04(上海新华化工厂)，NaH2P04 (上海新华化工厂)，Na2C03 (上海试剂二厂)，NaHC03 (上海文旻生化科技有限公司)，NaCl (国药集团化学试剂有限公司)，KC1 (上海试一化学试剂有限公司)，Tris-Base (上海双向巴斯科技发展有限公司)，Tween-20 (Farco Chemical Supplies) ， 二甲基亚砜(上海凌峰化学试剂有限公司)，3， 3， 5， 5-四甲基联苯胺(TMB)(上海斯高勒生物科技有限公司)，柠檬酸(上海化学试剂有限公司)，柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司)，H202 (上海化学试剂有限公司)，浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)，BSA(上海斯高勒生物科技有限公司)，二抗(Immunology Co固ltantsLaboratory， Inc.) ， D_海藻糖(上海沪峰生物科技有限公司)，万泰试剂盒(北京万泰生物药业有限公司)。酶标板(厦门 市云鹏科技发展有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，洗板机(Wellwash 4 MK2)禾口酶标仪(Multiskan MK3) (Thermo electron corporation), PH检测仪(Mettler Toledo)，微量振荡器和漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
二、待测材料的准备从屠宰场采集猪血，猪血在室温自然凝固，再置37t:温箱lh，然后放4t:冰箱过夜，待血块收縮后分离血清，血清为淡黄色透明液体。用万泰试剂盒检测所采血清，把其所检测出来的阳性血清作为阳性对照，把其所检测出来的阴性血清作为阴性对照。
三、酶联免疫吸附(ELISA)方法建立 以Zhao Kai等Zhao Kai，Liu Qiwen，Yu Ruisong，et al. Screening ofspecificdiagnostic peptides of swine hepatitis E virus. Virol J， 2009，6 :186. doi :10. 1186/1743-422X-6-186.筛选出来的来自猪HEV swCH25的合成多肽swHEVll作为包被
抗原制作成猪戊肝诊断试剂盒。
实施例1 在酶结合物稀释液中加入稳定剂海藻糖和不加入稳定剂海藻糖的酶标板稳定性的测定 (1)抗原稀释取10iU浓度为10mg/ml的多肽(将5mg合成的多肽溶解在0. 5ml 二甲基亚砜匿S0而得)与90iU PBS液混匀，得到的抗原稀释液溶度为lug/iU。再取15iU抗原稀释液与5ml包被液混匀，得到的抗原稀释溶度为3ii g/ml。在酶标板上加入抗原稀释溶度100 ii 1/孔，4。C包被12h。
(2)封闭 吸去包被液，每孔加入200 ii 1封闭液于37t:封闭2h。
(3)加一抗 用TBST液洗板3次，每孔加100 y 1样品稀释液和10 y 1血清，震荡混匀，置37°C温育lh。 (4)加二抗(酶结合物稀释液中分别含8wt^、10wt^、12wt^的稳定剂海藻糖和不含海藻糖，将酶结合物稀释液置于37°CT 4d)。
用TBST液洗板5次，每孔加100 y 1 二抗，置37。C温育lh。 二抗中酶结合物稀释液和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG是以1 : 10000稀释。
(5)显色 用TBST液洗板5次，每孔加底物液lOOul， 37度显色lOmin。
(6)终止 每孔加50 ii 1 lmol/1 HC1的终止液来终止反应，用酶标仪测0D450值，其结果参见表l。从该结果可以看出加入稳定剂后，酶标抗体至37t:、4d后，活性无明显变化，而不加稳定剂酶标抗体活性几乎完全丧失，说明稳定剂海藻糖对二抗具有稳定保护的作用。
注上述各溶液的配方 PBS液(pH7. 4) :Na2HP04 0 . 5 7 5g， NaH2P04 0. 114g，蒸馏水500ml 。 包被液(pH9. 6) :Na2C03 1. 59g， NaHC03 2. 93g，蒸馏水1000ml 。 封闭液BSA(牛血清白蛋白)3g， TBS(三乙醇胺缓冲盐溶液)液(pH8. 6) 100ml。 TBS液(pH8. 6) :NaCl 16g， KC1 0. 4g， Trizma-Base (氨基丁三醇碱)2. 42g，蒸馏
水2000ml。 TBST(三乙醇胺吐温20缓冲盐溶液)液(pH8. 6) :TBS液(pH8. 6) 1000ml， Tween-201. Oml 。 样品稀释液BSA lg， TBST液100ml。
酶结合物稀释液BSA lg， TBST液100ml 。 柠檬酸缓冲液(pH3. 5-4. 0):柠檬酸0. 84g，柠檬酸钠0. 294g，蒸馏水100ml 。
终止液(1M HC1):浓盐酸(含量36-38wt% )40. 88ml ，蒸馏水459. 12ml 。
底物溶液10ml拧檬酸缓冲液
TMB临用前加入 40mg
30%11202临用前加入 3iU。 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
一种稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用，其特征在于，稳定剂海藻糖在保持所述猪戊肝诊断试剂盒诊断猪戊肝病毒抗体稳定性时的应用。
2. 根据权利要求1所述的稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用，其特征在于， 在所述猪戊肝诊断试剂盒的酶结合物稀释液中添加海藻糖。
3. 根据权利要求2所述的稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用，其特征在于， 所述海藻糖的添加量为酶结合物稀释液的8-12wt%。
全文摘要
本发明公开了一种稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用，在所述猪戊肝诊断试剂盒的酶结合物稀释液中添加8-12wt％的海藻糖，利用该稳定剂海藻糖能使酶结合物稀释液保持稳定的功能，来维持猪戊肝病毒试剂盒的稳定性。
文档编号G01N33/576GK101710120SQ200910201070
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月14日 优先权日2009年12月14日
发明者于瑞嵩, 刘启文, 吴潇, 唐雪明, 朱宏, 李震, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院