专利名称：一种检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸
条及其制备方法。
背景技术：
乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的包膜病毒，属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时，可以干扰肝脏的功能，随即免疫系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果，肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括慢性肝脏功能不全，肝硬化和肝细胞癌(HCC)。 HBeAg在乙型肝炎病毒感染后与乙肝表面抗原阳性同时或其后出现，HBsAg在血内的高峰期亦是HBeAg的高峰期。HBeAg阳性说明乙型肝炎病毒在体内复制活跃，传染性强，HBeAg在HBsAg转阴前可先转阴。如果HBeAg持续阳性，则可发展为慢性持续性乙型肝炎病毒感染。 目前的HBeAg病原学诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、
免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)，这些方法都有各自的特点和适用对象。 ELISA和CLIA方法是目前临床免疫分析中普遍使用检测技术，但反应时间相对较
长，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，无法满足临床急诊术前检
测，抢救前指导用药的要求，也限制了在一些基层医疗单位的应用。胶体金或乳胶颗粒为代
表的快速检测试纸条，缺点是结果需要肉眼观察，容易受观察者主观判断的影响，且灵敏度较低。 磁性免疫层析(Mgnetic I匪noChromatographic Test, MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。它是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测测量磁场强度来示踪待测样品的含量。该技术与传统技术相比具有下述优势a.所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍；c.读数快速，可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；d.线形范围可达4个浓度数量级的范围内呈线性；e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，是当今即时检验(Point of CareTest，POCT)技术发展的先进代表。 目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。
发明内容
本发明的目的即是将磁性免疫层析技术应用在HBeAg免疫分析中。将HBeAb共价偶联于超顺磁颗粒上，将HBeAb包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，可以实现快速灵敏地检测，本技术既可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。 为达到上述的目的，本发明的技术方案如下将包被膜、结合HBeAb的磁颗粒垫、
样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制
成，其中所述的包被膜上预包被有HBeAb检测线，以及预包被了二抗的质控线。 选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫
为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所
述的样品垫处理液是含有1% _5%酪蛋白(casein)和0. 1% _1%的聚乙烯醇(PVP)，以及
0. 01-0. 2%吐温-20 (Tween-20)的0. 02M， pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。 检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤A、磁颗粒的制备选用直径为50-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥
珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将二抗标记到磁颗粒上，将HBeAb以1 : 3_1 : 10的比例
(体积比)与二抗标记磁颗粒混合； B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 ill/cm的量喷涂于磁颗粒垫上； C、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将HBeAb以及二抗稀释到0. 5_2mg/m的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0. 5-1. 0cm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂封存备用； D、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35t:烘干8小时； E、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。 所述的步骤A中HBeAb-磁颗粒的制备使用含有0. 1 % Tween-20的50mM，pH4. 5-5. 0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，使用含有0. 1% Tween-20的50mM， pH4. 5_5. 0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入二抗，使二抗与磁颗粒的分子比例为5 : 1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS室温封闭30分钟；洗涤磁颗粒，使用含有1 % PVP，1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mM pH8. 2_9. 0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，将HBeAb以1 : 3-1 : 10的比例(体积比)与二抗标记磁颗粒混合，4。C保存备用；
所述的步骤B中，磁颗粒的喷涂方法是将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50iU/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。
所述的步骤C中，包被膜的制备方法是用包被缓冲液(0. 02M PB， pH7. 0_7. 6)将HBeAb稀释为0. 5mg/ml，二抗稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以1 yl/cm的量将二者以0. 6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂封存备用。 与传统的快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点 1)通过在磁颗粒上引入二抗系统，使得试纸条的制备过程大大简化，适合大规模生产。 2)运用磁性检测仪来进行结果的判读，依据检测线与质控线的磁性检测值比值进行阴阳性判断，避免了主观性，结果准确、可靠。 本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用单位。
图1为本发明检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条结构示意图。 为进一步说明本发明检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，特举
以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
具体实施例方式
本发明所述的检测血液中乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条，如图1所示，该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、结合了 HBeAb的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，并在上层覆盖透明塑料密封膜，组装而成的试纸条。 在具体实施例中，所采用HBeAb为商品化抗体。利用双抗体夹心法原理检测HBeAg的标本，当待测标本中含有HBeAg时，抗原会先和磁颗粒上结合的HBeAb结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达HBeAb包被线T处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T处，另外，未结合HBeAb-磁颗粒会继续前行到达质控线C时，包被膜上二抗会与磁颗粒上的HBeAb结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全， 一般反应十五分钟后即可使用磁性免疫层析仪器读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，计算T/C的比值，根据预设的界限比值即可判定结果的阴阳性。整个读
卡、计算、与预设界限值比对的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出阴阳性结果。 本发明所述的检测血液中乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例 实施例1 检测血液中乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法 本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤 A、抗体的制备选用商品化的HBeAb，对20mM， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PBS，
4t:透析过夜备用。 B、包被膜的制备 包被缓冲液的配制0. 02M pH 7. 2的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0. 22 y m微
孔滤膜过滤除菌后置4t:保存备用，有效期两周。 封闭液的配制含0. 5% BSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS) ，0. 22 ii m微孔滤膜过滤除菌后置于4t:保存备用，有效期一周。
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包被膜的制备用包被缓冲液(0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PB)将HBeAb稀释为O. 5mg/ml，二抗稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以1 yl/cm的量将二者以0. 6cm的间隔均匀喷印于3. 5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0. 5%BSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均适用)的PBS，)中浸泡10分钟后于25-35。C烘干8小
时，加入干燥剂封存备用。
C、磁颗粒的制备 醋酸钠缓冲液的配制用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4. 7 (pH4. 5_5. 0均适用)，浓度为50mM的醋酸缓冲液，加入Tween-20至终浓度为0. 1 % ， 0. 22 y m微孔滤膜过滤除菌后4t:保存备用，有效期两周。 硼酸保存缓冲液的配制用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8. 5 (pH8. 2-9. 0均适用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP， Casine， Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1%，1 % ， 0. 5 % ， 5 % ， 0. 22 ii m微孔滤膜过滤除菌后fC保存备用，有效期一周。
HBeAb磁颗粒的制备使用含有0. 1 % Tween-20的50mM pH4. 7 (pH4. 5-5. 0均适用)醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入二抗，使二抗与磁颗粒的分子比例为5 : 1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5% BSA的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PBS，室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1 % PVP， 1 % Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mmolpH8. 5 (pH8. 2-9. 0均适用)的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，将HBeAb以l : 3-1 : IO的比例(体积比)与二
抗标记磁颗粒混合，4t:保存备用。 D、磁颗粒的喷涂与冻干 使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以50 y 1/cm的量均匀喷涂于0. 8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，
E、样品垫的处理 将1. 8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35。C烘干8小时。 样品垫处理液是含有1% -5% Casein和O. 1% _1 %的PVA以及O. 01-0. 2%Tween-20的0. 02M pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PBS溶液。
F、试纸条的组装及切割 下述所有操作都必须在湿度小于20%，温度20-25t:的房间内进行。
试纸板的组装使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3. 5cm宽的包被膜，2. 5cm宽的吸水纸，0. 8cm宽的磁颗粒垫，1. 8cm宽的样品垫组装于9. 8cm宽度透明塑料底板上，贴上上层透明塑料盖板，组装成试纸板。 试纸条的裁切使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0. 5cm宽的成品试纸条。 G、试纸卡的组装 将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。 H、确定该批次的二维码信息
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品名HBeAg磁性检测卡 批次试纸卡的组装日期，格式为年/月/日，XXXX/XX/XX 阴阳性判读标准的确定取100份确认HBeAg标本(强弱均有)、500份随机标本使用该批次试纸卡检测，使用磁性检测仪检测结果，计算每个检测卡的Tl/C值，T2/C值，使用统计学方法计算均值和标准差，确定T/C < 0. 1， T/C > 0. 2为阳性，二者之间为灰区。
1、二维码的打印粘贴 将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2%确保二维码粘贴无误。
J、成品包装 将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液，即制成试纸盒，该试纸盒于室温避光保存，保质期为18个月。层析缓冲液配方为1% Tween-20，0. 5% TritonX-IOO， 1% NP-40，0. 05% NaN3，20mmo1 pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PBS，。
实施例2 本发明的检测卡的使用方法
1、加样 从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50 ii 1样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50 ii 1层析缓冲液，等待反应进行15分钟。 2、测量及结果输出 将MICT检测仪预先开机，将检测卡插入检测仪的插卡口 ，运行仪器，仪器会自动读取卡上的二维码信息并进行测量，即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。
权利要求
一种检测乙肝e抗原(HBeAg)的磁性免疫层析试纸条，其特征在于该试纸条是将包被膜、结合了乙肝e抗体(HBeAb)的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝e抗原检测线“T”和质控线“C”。
2. 根据权利要求1所述的包被膜，其特征在于所述的膜为硝酸纤维素膜。
3. 根据权利要求1所述的包被膜，其特征在于所包被的物质为HBeAb和二抗。
4. 根据权利要求1所述的磁颗粒垫，其特征在于所采用的垫为玻璃纤维垫。
5. 根据权利要求1所述的磁颗粒垫，其特征在于所采用的磁颗粒为超顺磁颗粒，该磁颗粒上偶联有HBeAb。
6. 根据权利要求6中所述的HBeAb免疫磁颗粒，其特征在于所述的HBeAb免疫磁颗 粒制备是先将二抗偶联到磁颗粒上，再将HBeAb与磁颗粒标记二抗连接，形成磁颗粒_ 二 抗-HBeAb复合物。
7. 根据权利要求3、5、6所述的HBeAb，其特征在于所述的HBeAb可以是单克隆抗体、 多克隆抗体。
8. 根据权利要求3中所述的二抗，其特征在于所述的二抗应与连接于磁颗粒上的 HBeAb抗体配对。
9. 根据权利要求5、6中所述的磁颗粒，其特征在于所述的磁颗粒的粒径在50-300nm。
全文摘要
本发明涉及一种检测血液中乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。本发明将磁性微粒子免疫层析技术引入到乙肝e抗原检测中，该试纸条是将包被膜、结合了乙肝e抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有乙肝e抗原检测线和质控线。本发明具有操作简便，灵敏度高，特异性好等优点。
文档编号G01N33/532GK101750498SQ20091023633
公开日2010年6月23日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者于尚永, 唐宝军, 应希堂, 胡国茂, 詹先发, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司