专利名称：氯霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测氯霉素残留量的试剂盒，特别是检测 动物源食品中氯霉素残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (EnzymeLinked Immunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术 之后发展起来的一种酶免技术。 背景技术：
氯霉素是一类广谱抗生素，对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌均有 抑制作用，在畜禽疾病控制和治疗中起到了重要作用，但氯霉素存在严重副作用，可引起再 生障碍性贫血、粒细胞缺乏症，对早产儿和新生儿能招致药物蓄积中毒，还可引起中毒性精 神病等。欧美等发达国家已经相继或严格禁止使用。中国国家质检总局专门就氯霉素先后 发了两个紧急通知(国质检食函[2001]510号，国质检食函[2001]578号)，禁止在出口水 产品的饲料、养殖(包括环境、器械等的消毒)、加工、保鲜、包装和运输等生产环节使用氯 霉素。因此加强对氯霉素药物的残留检测是非常有必要的。 目前国内外有关动物源食品中氯霉素药物检测方法大都采用液相色谱法或气相 色谱法进行检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂贵，检测过程繁琐，不适合现场 监控和大量样本筛查。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的氯霉素 残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术 含量不高，可进行一次连续多个样品中氯霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时 间。 本实用新型的技术方案是一种检测动物源食品中氯霉素残留量的酶联免疫试剂 盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、 一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固 相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装 酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被氯霉素偶联抗原制成检测 板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将放入真空铝箔袋中，将7瓶 2ml标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml氯霉素抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、 7ml终止液、40ml浓縮洗涤液、50ml浓縮复溶液试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃 瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在 硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析 孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔 袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的氯霉素将和 酶标板微孔条上预包被的氯霉素偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底 物显色，样本吸光度值与样本中所含氯霉素的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其 对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素残留量，其操作简便易行。 经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度肠衣样本的最低检测限为0. 1 ii g/kg、 蜂蜜样本的最低检测限为0. 15ii g/kg、牛奶样本的最低检测限为0. 05ii g/kg、肌肉和肝脏 样本的最低检测限为0. 05ii g/kg ;肠衣样本的回收率为75% ±15%;蜂蜜样本的回收率为70% ±10%;牛奶样本的回收率为85% ±10%;肌肉和肝脏样本的回收率为85% ±10%。 相对于其他氯霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，且所需仪器同类实验室一般均有配 备，所需成本较低。 本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源食品中氯霉素 残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm); 图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm); 图3为本实用新型酶联板的俯视图； 图4为本实用新型盖板膜平面图； 图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图； 图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图； 图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。 参见附图酶标反应微孔条(2)预包被氯霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框 支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱 内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓縮洗 涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓縮复溶液；白色帽(6)的白色塑料 试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显 色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂 瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml氯霉素抗体工 作液，黑色帽的白色塑料试剂瓶(9)用于封装2ml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有 15个瓶位，放置位置依次为40ml浓縮洗涤液瓶位(18) ， 50ml浓縮复溶液(11) ， 7ml显色液 A液瓶位(14) ， 7ml显色液B液瓶位(13) ， 7ml终止液瓶位(12) ， 7ml氯霉素抗体工作液瓶位 (16) ， 12ml酶标二抗瓶位(15) ， 7瓶2ml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19) 是硬纸盒。 本实验新型的实施例 —、样本的前处理 1.配液 配液1 :0. 36mol/L亚硝基铁氰化钠(Na2Fe (CN) 5 NO 2H20)溶液称取10. 7g七 水合亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100ml 配液2 :lmol/L硫酸锌(ZnS04 7H20)溶液 称取28. 8g硫酸锌加去离子水溶解定容至100ml 配液3 :乙月青-水溶液 量取84ml无水乙腈加入到16ml去离子水中混匀 配液4:复溶工作液 用去离子水将2X浓縮复溶液按l : l体积比进行稀释用提取样本的复溶. 配液5 :洗涤工作液 用去离子水将20X浓縮洗涤液按l : 19体积比进行稀释用于酶标板的洗涤。[0028] 2.样本处理步骤 肌肉、肝脏样本 称取3. 0±0. 05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入乙酸乙酯6ml，振荡 10min，4000rmp/min，室温离心10min ;移取4ml上层有机相至10ml干净的玻璃试管中， 于5(TC水浴氮气流下吹干；加入正己烷lml，涡动30s，再加复溶工作液lml，涡动lmin ; 4000rmp/min，室温离心15min ;取下层100 yl用于分析。 蜂蜜样本 称取2.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加4ml去离子水，振荡至蜂蜜全 部溶解；加入4ml乙酸乙酯上下振荡10min，4000rmp/min，室温离心10min ;移取lml上层有 机相至50ml聚苯乙烯离心管中，于5(TC氮气流下吹干；加入0. 5ml复溶工作液，涡动2min 溶解干燥的残留物；取100 iU用于分析。 肠衣样本 称取1.0士0.05g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml乙酸乙酯， 振荡10min，4000rmp/min，室温离心10min ;取出5ml上层有机相至10ml干净的玻璃试管 中，于5(TC水浴氮气流下吹干；加入lml正己烷，涡动30s，再加0. 5ml复溶工作液强烈振荡 lmin，4000rmp/min，室温离心5min ;除去上层有机相，取下层100 yl用于分析。 牛奶样本取牛奶样本，4000rmp/min， l(TC离心10min，吸除上层脂肪；取5ml去除脂肪牛奶 样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入0. 36mol/L亚硝基铁氰化钠溶液150 yl出现沉淀， 振荡15s，再加入lmol/L硫酸锌溶液150iU，振荡lmin充分混合；4000rmp/min， 15。C离心 10min，移取上层液；用复溶工作液以等体积稀释上层液；取100 iU用于分析。 二、使用试剂盒的操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种液 体试剂使用前均须摇匀。 2、取出板架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗涤液在使用前也需要回温。 4、编号将样本溶液和标准品工作液对应微孔按序编号，每个样品溶液和标准品 工作液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 ii 1到各自的微孔 中，然后加抗体工作液50 ii 1/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25t:环境中反应60min。 6、取出微孔板，甩出孔内液体，用洗涤液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头剌破)。 7、加入酶标二抗工作液100 iU/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板置于25t:环境 反应30min，取出重复步骤6。 8、显色每孔先加入底物液A液50 iU，再加B液50 y 1，轻轻振荡混匀，25。C环境 中避光显色15min。 9、测定每孔加入终止液50 ii 1，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD (若无酶标仪，则不加终止液用 目测法可进行判定)。[0047] 三、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与氯霉素残留量成负相关。 1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。假设样 本1的吸光度值为0. 410，样本2的吸光度值为0. 920，标准液吸光度值分别是Oii g/L为 2. 160 ;0. 05 ii g/L为1. 701 ;0. 15 ii g/L为1. 342 ;0. 45 ii g/L为0. 869 ; 1. 35 ii g/L为0. 431 ; 4. 05 ii g/L为0. 183。则样本1的浓度范围是1. 35 y g/L_4. 05 y g/L再乘以其对应的稀释 倍数即可得出样本中氯霉素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 15 ii g/L-O. 45 y g/L 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中氯霉素残留的浓度范围。 2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) = - x 100%
B0 B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L标准溶液的平均吸光度值 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度(P g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应 的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际残留量。 四、测定前的注意事项 1、室温低于2(TC或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性， 重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。 4、反应终止液为2mol/L硫酸，避免接触皮肤。 5、储存条件 保存试剂盒于2-『C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 6、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、0D值的变化。
不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 7、试剂变质的迹象 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、加A、 B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间到35min。 9、该试剂盒最佳反应温度为25t:，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求一种检测氯霉素残留量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被氯霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽 的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑 料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止 液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓縮洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓縮复溶液用蓝色 帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔 预包被氯霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，2ml/瓶； 酶标二抗1瓶，12ml ;抗体工作液1瓶，7ml ;显色液A液1瓶，7ml ;显色液B液1瓶，7ml ;终 止液1瓶，7ml ;浓縮洗涤液1瓶，40ml ;浓縮复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源食品中氯霉素残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、氯霉素抗体工作液、氯霉素6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的氯霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中氯霉素的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201438191SQ20092010667
公开日2010年4月14日 申请日期2009年4月2日 优先权日2009年4月2日
发明者万宇平, 何丽霞, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 汪善良, 罗晓琴, 赵正苗 申请人:北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司