专利名称：Mpo奶牛隐性乳房炎检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及医学检测领域，具体涉及一种奶牛乳房炎检测试剂盒。
背景技术：
奶牛乳房炎是由病原微生物感染而引起乳房组织及乳头发炎的一种疾病，它是世 界奶牛养殖业中发病率最高、流行广泛、造成损失最大的疾病之一。乳房炎分为临床乳房炎 (Clinicalmastitis)、隐性乳房炎(mastitis)及慢性乳房炎(chronic mastitis)，其中 隐性乳房炎乳汁无肉眼可见变化，临床症状不明显，常不易被发现和重视。据报道，全世界 约有22亿头奶牛，其中有1/3的奶牛患有乳房炎，临床型乳房炎发病率仅为10% 20%， 而绝大部分是更为普遍的隐性乳房炎，在我国隐性乳房炎的发病率更高[3_4]。隐性乳房炎 使泌乳奶牛每年的产奶量下降10% 11% [5]，且降低牛奶的品质，增加奶牛淘汰和后备奶 牛的成本、药物开支、兽医服务费用和额外劳力费用，还延长产后发情和妊娠时间，给奶牛 产业带来巨大经济损失。可见，隐性乳房炎的早期诊断对减少奶牛业经济损失具有重要意 义。对于奶牛隐性乳房炎的诊断方法国内外都做了长期、大量的研究，但是我国目前 尚缺乏用于临床上奶牛隐性乳房炎检测的经济、简便、准确度高而又适于广泛应用的早期 诊断方法，目前，国内外奶牛隐性乳房炎的检测方法有体细胞计数(SCC)检测法、手握式导 电仪检测法、凝固酶试验(TCT)、单克隆抗体的免疫方法、DNA指纹图技术检测法、PCR检测 法等，这些方法要求专业化程度高、设备昂贵，在我国小型养殖场均很难得到广泛的应用， 且许多方法需在专业实验室才能完成，不利于推广，有些方法在临床应用时不能够快速、简 便地做出诊断。
发明内容本实用新型的目的在于公开一种以髓过氧化物酶(MPO)为检测指标，运用双抗体 夹心BA-ELISA法为检测方法，更符合快速、简便、高灵敏度、高特异性的现代诊断方法要 求，适合工业化生产，保存期更长的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒。本实用新型的目的是这样实现的ΜΡ0奶牛隐性乳房炎检测试剂盒由酶标包被 板，A号液1瓶，B号液1瓶，C号液1组，D号液1瓶，E号液1瓶，F号液1瓶，两片封板膜 组成。本实用新型还有这样一些技术特征1、所述的酶标包被板为兔抗MPO多抗包被并封闭的8X12孔酶标板，分为标准品 孔、样品孔及空白对照孔，是将兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶标板，在4°C过夜后用封闭液 封闭，在37°C温育Ih JnMPO悬液，37°C温育Ih而成；2、所述的A号液为生物素标记的鼠抗MPO单抗，即二抗，在检测操作过程中添加本 液体后需在37°C温育Ih ；3、所述的B号液为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，在检测操作过程中添加本液体后需在37°C温育Ih ；4、所述的C号液为MPO标准品，分为含量为Ong/ml的Cl号液，含量为2. 5ng/ml 的C2号液，含量为5. Ong/ml的C3号液，含量为lOng/ml的C4号液，含量为25ng/ml的C5 号液，含量为50ng/ml的C6号液6瓶；5、所述的D号液为底物溶液TMB，在检测操作过程中添加本液体后需在37°C温育 30min ；6、所述的E号液为2mol/L的H2SO4终止液；7、所述的F号液为浓缩洗涤液PBST，用于洗涤温浴后的酶标板，每次需三次重复 洗涤；8、所述的封板膜为96孔，用于酶标板加样和加酶的温育，以及显色。本实用新型为一种专用于奶牛隐性乳房炎诊断的试剂盒，研发人员在比较 了多种奶牛乳房炎检测方法后，设计了本检测试剂盒。其原理是牛髓过氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO)是多形核粒细胞、单核细胞、巨噬细胞释放的嗜天青颗粒的主要成 份，并在炎症过程中扮演了吞噬和溶菌的重要角色。研究报道奶牛发生乳腺炎时乳汁中MPO 作为指示物含量增高，奶样中的体细胞数(SCC)和MPO浓度的相关系数值为0.91，奶样中 随着SCC的增高，MPO的水平也增高达到2000ng/mL，同时也可分离到大量细菌。免疫学分 析MPO单克隆抗体与奶液中成分乳铁蛋白、乳过氧化物酶、牛血清白蛋白、ΜΡ0、淋巴细胞、 少量体细胞的乳样之间ELISA反应没有交叉性，表明MPO分子在乳房炎中具有很高的特异 性。通过对牛奶中MPO的检测来判断乳房内中性粒细胞(PMN)的活性状态，可对奶牛隐性乳 房炎做出早期诊断。本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MPO水平。通过 ELISA方法，制备的MPO抗体同MPO的特异性反映，从而能够准确的检测到标本中的MPO含 量。通过MPO含量和体细胞数SCC之间的换算，达到检测奶牛隐性乳房炎的目的。用纯化 的抗体包被酶标板，制成固相抗体，往包被多抗的酶标板中依次加入待检奶样、生物素标记 的鼠抗MPO单抗、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液2M H2SO4的作用下转化成最终的黄色。颜 色的深浅和样品中的MPO呈正相关。在终止反应后30min内，用酶标仪在450nm波长下测 定吸光度(0D值)，绘制标准曲线，计算样品浓度。
图1为实施例酶标板结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型做进一步的说明实施例结合图1，本实施例包括兔抗MPO多抗包被并封闭的8 X 12孔酶标板1 一块，生物 素标记的鼠抗MPO单抗A号液一瓶，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素B号液一瓶，标准品含 量为Ong/ml的Cl号液，含量为2. 5ng/ml的C2号液，含量为5. Ong/ml的C3号液，含量为 10ng/ml的C4号液，含量为25ng/ml的C5号液，含量为50ng/ml的C6号液各一瓶共六瓶，D 号液底物溶液TMB —瓶，2mol/L的H2SO4终止液E号液一瓶，F号液浓缩洗涤液PBST —瓶，
496孔封板膜两片。各试剂在使用前平衡至室温，操作步骤如下(1)根据待测样品数量取出所需酶标板并标记标准品孔、样品孔及空白对照孔，标 准品孔按照标准品次序C1-C6加入，各50ul ；样品孔加入50ul待测样品；空白对照孔加入 50ul蒸馏水，室温孵育lh，洗涤3次，甩干。(2)除空白对照孔外，标准品孔、样品孔均加入A号液100yL，37°C孵育，洗涤3 次，甩干；(3)除空白对照孔外，标准品孔、样品孔，均加入B号液100μ L，37°C孵育，lh，洗涤 3-5次，甩干；(4)除空白对照孔外，标准品孔、样品孔均加入D号液，37°C孵育，15min ；(5)各孔均加入E号液，各50 μ L，终止反应；(6) 30min内，用酶标仪测定在450nm波长下各孔的OD值；(7)绘制标准曲线标准曲线的纵坐标为不同浓度MPO标准品相对应的0D450nm 值，横坐标为MPO标准品浓度，连接各点，绘制曲线；然后作图得标准曲线，并建立回归方 程；(8)结果判断根据各样品的0D450nm值在标准曲线上求出其对应的浓度范围。
权利要求MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于它是由酶标包被板，A号液1瓶，B号液1瓶，C号液1组，D号液1瓶，E号液1瓶，F号液1瓶，两片封板膜组成。
2.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的酶标包 被板为兔抗MPO多抗包被并封闭的8X12孔酶标板，分为标准品孔、样品孔及空白对照孔， 是将兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶标板。
3.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的A号液 为生物素标记的鼠抗MPO单抗，即二抗。
4.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的B号液 为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
5.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的C号液 为MPO标准品，分为含量为Ong/ml的Cl号液，含量为2. 5ng/ml的C2号液，含量为5. Ong/ ml的C3号液，含量为lOng/ml的C4号液，含量为25ng/ml的C5号液，含量为50ng/ml的 C6号液6瓶。
6.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的D号液 为底物溶液TMB。
7.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的E号液 为2mol/L的H2SO4终止液。
8.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的F号液 为浓缩洗涤液PBST。
9.根据权利要求1所述的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的封板膜 为96孔。专利摘要本实用新型的目的在于公开一种以髓过氧化物酶MPO为检测指标，运用双抗体夹心BA-ELISA法为检测方法，更符合快速、简便、高灵敏度、高特异性的现代诊断方法要求，适合工业化生产，保存期更长的MPO奶牛隐性乳房炎检测试剂盒。用纯化的抗体包被酶标板，制成固相抗体，往包被多抗的酶标板中依次加入待测奶样、生物素标记的鼠抗MPO单抗、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
文档编号G01N33/535GK201654036SQ20092024439
公开日2010年11月24日 申请日期2009年12月21日 优先权日2009年12月21日
发明者吕英, 李庆章, 杨宇, 石晶, 边艳杰, 高学军 申请人:东北农业大学