专利名称：纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法。更确切地 说，特别是涉及一种复合纳米金和聚噻吩灵敏快速检测目标靶DNA的方法。属靶基因检测 领域。
背景技术：
人类、病毒以及细菌的特异性核酸序列检测在疾病诊断中正变得越来越重要。尤 其近年来一些病原体引起的爆发性疫情给人类的健康以及社会经济带来严重损失。因此， 对病原体进行快速、准确的诊断不仅对传染性疾病的预防和控制有着非常重要的意义，对 临床疾病的指导也起着积极的指导意义。至今为止许多技术，包括电化学、荧光、电泳、电化 学发光、酶、表面等离子共振(SPR)以及原子力显微镜等方法被用于人类和病原体基因的 检测。这些技术方法尽管有其各自的优势以及较高的灵敏度，但大多需要基因的扩增以及 昂贵的检测仪器等，最近几年来许多研究都在努力提高目标靶基因检测的敏感度而不需要 靶序列的扩增和富集的过程。然而，大多数这些方法仍需要复繁琐的步骤。因此建立简单、 特异、快速的基因检测方法对疾病的早期诊断具有重要的意义。近年来，金纳米颗粒和水溶性荧光共轭聚合物作为高灵敏的生化传感元件的独特 性质在生物大分子(如核酸、蛋白质)特异性识别、检测方面的研究越来越受到人们的关 注。纳米金颗粒具有很好的生物相容性，颗粒直径小，比表面积大，在可见区内具有较高的 消光系数和特殊的光学性质，因此可作为一个信号分子识别的理想颜色显示剂，用于DNA 杂交的比色分析检测。但是通常需要在纳米金颗粒表面修饰寡核苷酸探针，才能达到特异 性识别靶生物分子的目的，因此成本较昂贵。研究表明，ssDNA和dsDNA对未标记的纳米金 颗粒有不同的静电作用，因而对纳米金颗粒的稳定性有所不同，根据此特性可以鉴别ssDNA 和dsDNA。另一方面，携带着离子功能的共轭聚合物也一直是高性能和快速反应的化学和生 物传感器运用的候选者。例如聚噻吩衍生物为带正电离子、有荧光色团的水溶性多聚物，在 能量转换、机械压力以及离子结合的情况下可显示出明显的颜色变化。因此，用聚噻吩作为 传感材料的传感器已引起研究者的广泛注意。聚噻吩可以与带负电离子的寡聚核苷酸结合 形成化学计量的聚合电解质复合物(二聚体)，而使聚噻吩衍生物本身的荧光淬灭而呈现 红光；当未标记的互补的寡核苷酸探针增加到多聚物中，聚合电解质复合物进一步与完全 互补的寡聚核苷酸结合形成三聚体，此时聚噻吩衍生物骨架紧密地缠绕在双链互补核苷酸 骨架的带负离子的磷酸上形成了一个螺旋结构，从而限制了链内和链间的荧光淬灭导致荧 光信号增强发出黄色的光谱，并且从颜色上也可辨别出明显的改变，最关键的是聚噻吩衍 生物本身能够产生信号级联放大，这为低浓度基因的检测提供了一种新方法。鉴于以上对纳米金和聚噻吩衍生物作为高灵敏度的生化传感元件的独特特性，本 发明试图将两者结合起来用生物比色方法检测目标靶DNA，本发明是基于纳米金结合聚噻 吩衍生物为传感材料的非标记DNA检测方法，为了增加这个传感器的选择性和敏感性，未 修饰的聚噻吩衍生物被用于做颜色变化和扩增指示剂。该发明基于聚噻吩衍生物与ssDNA/dDNA结合时使得DNA-纳米金溶液的稳定性发生变化而引起颜色改变产生信号级联放大的 原理，通过颜色转变显示剂以及扩增标签的双重作用实现DNA的高灵敏快速检测，从而建 立利用纳米金结合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析平台。该复合纳米金和聚噻吩作 为传感材料用于DNA的检测比纳米金和聚噻吩单独作为传感材料用于DNA的检测灵敏度大 大提高，并且操作简单，不需要特殊的仪器设备，可望应用于临床检验医学及环境中靶目标 DNA的快速诊断和检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米金结合聚噻吩衍生物快速检测目标靶DNA的方 法，以弥补现有技术中的缺陷。本发明提供一种纳米金结合聚噻吩选择性灵敏检测目标靶DNA的方法，包括(一 )检测试剂及探针的准备(1)纳米金溶液的制备配置浓度为ImM HAuC14溶液及浓度为38. 8mM的柠檬酸三钠溶液。将HAuC14溶 液加热至130°C，保证加热过程中搅拌充分，约20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶 液(此过程中注意保温，不要让HAuC14溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形 成为酒红色溶液。以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均勻的13nm纳米金 溶液，4°C保存备用。(2) HlNl DNA检测探针的设计及合成甲型Hmi流感原名猪流感，现已成为全球流行病。发展快速简便的检测方法对 流感的预防和早期诊断都具有重要的意义。本发明以HlNl (GenBank :CY048965. 1)序列为 靶目标基因模板，建立利用未修饰的纳米金结合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析方 法。DNA探针序列(探针的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)为H1N1DNA 探针5，-ACGGAAGGAGTGCCAA-3，；互补的靴H1N1DNA 5，-TTGGCACTCCTTCCGT-3，；非互补DNA (HCV DNA 对照)5，-A GTAGTGTTGGGTCGC-3，；(3)聚噻吩衍生物(PMNT)的制备在检测DNA杂交中，本发明选择阳离子共轭聚[3_ (3，-N, N, N-triethylamino-l，-propyloxy)-4-methyl-2,5-thiophene hydrochloride] (PMNT)作为颜色指示剂，选择性灵敏地检测单双链DNA。按照Hoang-Anh等 人的方法(HO Hoang-Anh ；B0ISSIN0T Maurice ；BERGERON Michel G.，etal. Colorimetric and fluorometric detection of nucleic acids using cationicpolythiophene derivatives. Angew. Chem. 2002,41 :1548-1551)合成 PMNT。(二)目标靶序列的检测1，单链或双链DNA杂交溶液制备取去离子水 4. 5μ L，力口入 5μ L 0. 2Μ NaCl/0. IM phosphate buffer(pH7. 4) > 0. 25 μ L (100 μ Μ) HmiDNA探针以及0. 25 μ L(IOOyM)非互补的寡核苷酸DNA，充分混勻，制 备单链DNA溶液；另取去离子水4μ L，加入5μ L的0.2M NaCl/0. IM phosphate buffer (pH 7),0. 5 μ L(IOOyM)HlNl DNA 探针以及 0. 5 μ L (100 μ Μ)完全互补的靶 Hmi DNA，充分混勻，互补的的两个单链DNA经过杂交形成双链的DNA，制备为双链DNA溶液。2.基于纳米金结合聚噻吩用于互补靶DNA的检测取两管纳米金溶液(浓度12nM) 100 μ L，分别加入单链DNA溶液(非互补的探针)、双链DNA溶液(序列完全互补)各lyL，混勻，观察纳米金溶液的颜色。再分别加入Iul聚 噻吩(0. 05mg/ml).充分混勻，观察纳米金溶液的变化(见图)。上述纳米金-DNA-聚噻吩混合液各取100 μ L，分别加100 μ L去离子水混勻。用紫 外-可见分光光度计(型号为JASCO V-670)检测200nm 800nm区间紫外吸收强度。吸 收/发射狭缝宽度为lnm，工作电压为700伏，所有实验在室温下进行。所述步骤(二)/⑴中的制备单、双链DNA杂交溶液的杂交缓冲液为0.2M NaCl (含 IOnM phosphate buffer)，PH7.4 ；所述步骤(二 )/(1)中寡核苷酸探针与杂交缓冲液的浓度比为 100 μ M 1Μ(1 10)；所述步骤(二)/ (2)中的纳米金颗粒大小为13nm，纳米金溶液浓度为12nM，聚噻 吩衍生物溶液的浓度为0. 05mg/ml.所述步骤(二)/(2)中的DNA探针与聚噻吩衍生物的浓度比为接近1 1所述步骤(二)/(2)中的目标靶序列的检测是指以靶Hmi DNA作为杂交模板，未 修饰的纳米金复合聚噻吩超敏性、选择性和快速DNA检测流程见附图1。本发明根据纳米金和水溶性阳离子共轭聚合物的结构特征，将纳米金颗粒结合阳 离子共轭聚合物_聚噻吩用于靶DNA的检测。在一定条件的情况下，单链和双链DNA具有 稳定纳米金的作用。未经修饰的纳米金溶液加入DNA探针与待检测的目标靶序列，纳米金 溶液无明显变化(未加入NaCl溶液情况下)。在聚噻吩存在的条件下，因为阳离子共轭聚 合物聚噻吩与包围着纳米金的单链DNA结合，促使纳米金颗粒进一步的团聚，而使得纳米 金溶液发生明显的颜色变化；而聚合物与双链DNA形成三聚体的结构在溶液中能够较为稳 定纳米金溶液，纳米金没有明显的聚集。因此通过肉眼观察聚噻吩在单、双链DNA纳米金溶 液中的不同颜色变化，或检测紫外吸光度可达到检测目标靶DNA的目的(见图1)。综上所述，本发明利用未修饰的纳米金结合水溶性共轭聚合物聚噻吩对单、双链 DNA具有不同的颜色反应，可方便地选择性地检测目标靶DNA。该方法操作简单、快速，可通 过裸眼进行观察，不需要特殊的仪器设备，使得检测方便易行。该检测方法可检测与已知探 针互补的靶DNA序列，具有特异、快速、高灵敏度的特点，可应用于临床医学和环境监测中 人类及微生物基因的检测。
图1为互补的靶DNA的检测流程。图2为单独的纳米金溶液、包含单链DNA的纳米金溶液、包含双链DNA的纳米金溶 液分别加入聚噻吩后肉眼可观察到的颜色变化成像。图中，A :ssDNA和dsDNA分别加入纳米金溶液中(未加NaCl)并无颜色变化；Al 纳米金溶液；A2 :ssDNA+纳米金溶液；A3 dsDNA+纳米金溶液B 将聚噻吩衍生物分别加入ssDNA+纳米金溶液以及dsDNA+纳米金溶液后，单、双 链DNA溶液发生明显的颜色变化；Bl 纳米金溶液；B2 ssDNA+纳米金+聚噻吩衍生物溶液；B3 :dsDNA 2+纳米金+聚噻吩衍生物溶液。图3为单独的纳米金溶液、包含单链DNA的纳米金溶液以及包含双链DNA的纳米金溶液加入聚噻吩后的紫外吸收光谱区别示意图。图4基于未修饰纳米金比色检测DNA单链或双链流程示意图。图5基于未修饰的纳米金溶液比色反应检测单链、双链DNA ；A 纳米金溶液；B ssDNA+纳米金溶液+NaCl ；C :dsDNA+纳米金溶液+NaCl ；D 纳米金溶液+NaCl。图6基于纳米金溶液检测单链、双链DNA紫外吸收光谱；图中，1单独的纳米金溶 液；2为包含单链DNA的纳米金溶液以及3为包含双链DNA的纳米金溶液加入NaCl溶液 (0. 2M)后的紫外吸收光谱图。图7基于聚噻吩衍生物比色反应检测单链、双链DNA成像；A单独聚噻吩溶液；B包 含单链DNA的聚噻吩溶液；C包含双链DNA的聚噻吩溶液颜色变化成像。图8基于聚噻吩衍生物比色反应检测单链、双链DNA紫外吸收光谱区别示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1(一 )检测试剂及探针的准备(1)纳米金溶液的制备配置浓度为ImM HAuC14溶液及浓度为38. 8mM的，柠檬酸三钠溶液。将HAuC14溶 液加热至130°C，保证加热过程中搅拌充分，约20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶 液(此过程中注意保温，不要让HAuC14溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形 成为酒红色溶液。以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均勻的13nm纳米金 溶液，4°C保存备用。(2) HmiDNA检测探针的设计及合成本发明以Hmi (GenBank :CY048965. 1)序列为靶目标基因模板，建立利用未修饰 的纳米金复合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析方法。DNA探针序列如下，探针的合成 由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。H1N1DNA 探针5，-ACGGAAGGAGTGCCAA-3，；互补的靴H1N1DNA :5，-TTGGCACTCCTTCCGT-3，；非互补DNA (HCV DNA 对照)5，-AGTAGTGTTGGGTCGC-3，；(3)聚噻吩衍生物的制备在检测DNA杂交中，本发明选择阳离子共轭聚合物[3-(3，-N, N, N-triethylamino-Γ -propyloxy) -4-methyl-2, 5-thiophene hydrochloride] (PMNT)作颜色指示剂，选择性灵敏地检测单双链DNA。按照Hoang-Anh等 人的方法(HO Hoang-Anh ；B0ISSIN0T Maurice ；BERGERON Michel G.，et al. Colorimetric and fluorometric detection of nucleic acids using cationicpolythiophenederivatives. Angew. Chem. 2002,41 :1548-1551)合成 PMNT。(二)目标靶序列的检测1，单链和双链DNA杂交溶液制备取去离子水 4· 5μ L，力口入 5μ L 0. 2Μ NaCl/0. IM phosphate buffer(pH7. 4) > 0. 25 μ L (100 μ Μ) HmiDNA探针以及0. 25 μ L(IOOyM)非互补的寡核苷酸DNA，充分混勻，制 备单链DNA溶液；另取去离子水4 μ L，加入5μ L的0.2M NaCl/0. IM phosphate buffer (pH 7),0. 5 μ L(IOOyM)HlNl DNA 探针以及 0. 5 μ L (100 μ Μ)完全互补的靶 Hmi DNA，充分混 勻，互补的的两个单链DNA经过杂交形成双链的DNA，制备成双链DNA溶液。(见图1)聚噻吩加入单链或双链DNA纳米金溶液中可引起不同的颜色反应，含有单链DNA 的纳米金溶液加入阳离子的聚噻吩后，因为和纳米金周围的DNA探针结合，发生明显的聚 集反应，而包含双链DNA的纳米金溶液没有明显的聚集反应。2.基于纳米金结合聚噻吩衍生物用于互补靶DNA的检测取两管纳米金溶液(浓度12nM) 100 μ L，分别加入单链DNA溶液(非互补的探针)、 双链DNA溶液(序列完全互补)各lyL，混勻，观察纳米金溶液的颜色。再分别加入Iul聚 噻吩(0.05mg/ml).充分混勻，观察纳米金溶液的变化(见图2和图3)。检测DNA的灵敏度 为 49nM。上述纳米金-DNA-聚噻吩混合液各取100 μ L，分别加100 μ L去离子水混勻。用紫 外-可见分光光度计(型号为JASCO V-670)检测200nm 800nm区间紫外吸收强度。吸 收/发射狭缝宽度为lnm，工作电压为700伏，所有试验均在室温下进行。实施例2本发明提供的纳米金结合聚噻吩衍生物检测与纳米金、聚噻吩衍生物单独检测目 标靶DNA的方法的比较1.基于纳米金溶液比色检测单链、双链DNA1. 1制备单链、双链和单碱基突变DNA溶液取一 Ependoff管加入去离子水3 μ L，HlNl DNA探针1 μ L,非互补DNA (HCV DNA对 照)1 μ L以及0. 2Μ NaCl/lOmM PB溶液5 μ L，充分混勻，配制非双链DNA溶液(单链DNA) 的浓度为20 μ M ；另取一个管子加入去离子水1 μ L，Him DNA探针2 μ L、互补的靶Hmi DNA 2 μ L、0. 2M NaCl/lOmMPB溶液5 μ L，配制双链DNA溶液的浓度为20 μ Μ。1. 2.互补靶DNA的检测室温下，取单链DNA溶液、双链DNA溶液各5 μ L分别加入100 μ L的纳米金溶液。 再分别加入NaCl溶液(浓度0. 2Μ) 5 μ L/次，加四次；观察纳米金溶液颜色的变化(见图 3。另外，上述纳米金-DNA-NaCl混合液各取100 μ L，分别加100 μ L去离子水混勻。用紫 外_可见分光光度计(型号为JASCO V-670)检测400nm 800nm区间紫外吸收强度。吸 收/发射狭缝宽度为lnm，工作电压为700伏。图4-6为基于未修饰纳米金比色反应检测单链或双链DNA流程示意图，比色反应 检测单链、双链DNA以及基于纳米金溶液检测单链或双链的紫外吸收光谱。检测单链或双 链DNA的灵敏度为0. 8 μ M。2.基于单一聚噻吩衍生物比色法检测目标靶DNA2. 1制备单链、双链和单碱基突变DNA溶液
取一 Ependoff管加入去离子水3 μ L，HlNl DNA探针1 μ L,非互补DNA (HCV DNA对 照)1 μ L以及0. 2Μ NaCl/lOmM PB溶液5 μ L，充分混勻，配制非双链DNA溶液(单链DNA) 的浓度为20 μ M ；另取一个管子加入去离子水1 μ L，H1N1DNA探针2 μ L、互补的靶H1N1DNA 2 μ L、0. 2M NaCl/lOmMPB溶液5 μ L，配制双链DNA溶液的浓度为20 μ Μ。2. 2基于聚噻吩衍生物的靶DNA检测室温下，取单链DNA溶液、双链DNA溶液各2 μ L力卩入20 μ 1聚噻吩衍生物溶液中(浓度为0. 05mg/mL)，充分混勻，肉眼观察颜色变化。其中C管为聚噻吩衍生物溶液对照管 (见图7和8)。检测灵敏度为1. 8 μ M。3.本发明提供的纳米金结合聚噻吩检测目标靶DNA方法如实施例1所述。通过对纳米金结合聚噻吩衍生物检测目标靶DNA与纳米金、聚噻吩衍生物单独分 别检测目标靶DNA的方法的进行比较，三种方法检测单双链DNA的灵敏度分别为纳米金溶 液(加入0. 2Μ NaCl)检测DNA灵敏度为0. 8 μ Μ，聚噻吩检测DNA灵敏度为1. 8 μ Μ，纳米金 结合聚噻吩衍生物检测DNA灵敏度为49ηΜ.可以发现纳米金结合聚噻吩衍生物检测方法检 测DNA单双链DNA的方法灵敏度最高。
权利要求
一种纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法，包括(一)检测试剂及探针的准备(1)纳米金溶液的制备首先，配置浓度为1mM HAuCl4溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，并将HAuCl4溶液加热至130℃，在加热过程中搅拌充分，20分钟时迅速加入柠檬酸三钠溶液25ml，在加入过程中不使HAuCl4溶液降温，持续搅拌至溶液冷却至室温、形成酒红色溶液，最后用硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，4℃保存备用。(2)H1N1DNA检测探针的设计及合成以流感病毒H1N1序列为靶目标基因模板，建立利用未修饰的纳米金复合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析方法，DNA探针序列为H1N1 DNA探针5’-ACGGAAGGAGTGCCAA-3’；互补的靶H1N1 DNA5’-TTGGCACTCCTTCCGT-3’；非互补DNA5’-AGTAGTGTTGGGTCGC-3’；(3)聚噻吩衍生物的制备在检测DNA杂交中，选择阳离子共轭聚合物[3-(3’-N，N，N-triethylamino-1’-propyloxy)-4-methyl-2，5-thiophene hydrochloride]作颜色指示剂，选择性灵敏地检测单链或双链DNA；(二)目标靶序列的检测1.单链或双链DNA杂交溶液制备取去离子水4.5μL，加入5μL 0.2M NaCl/0.1M pH＝7.4的phosphate buffer、0.25μL 100μM H1N1 DNA探针或0.25μL 100μM非互补的寡核苷酸DNA，充分混匀，制备单链DNA溶液；或另取去离子水4μL，加入5μL的0.2MNaCl/0.1M pH＝7的phosphate buffer、0.5μL 100μM H1N1 DNA探针以及0.5μL100μM完全互补的靶H1N1 DNA，充分混匀，互补的的两个单链DNA经过杂交形成双链的DNA，制备为双链DNA溶液；2.基于纳米金结合聚噻吩用于互补靶DNA的检测取两管浓度为12nM纳米金溶液100μL，分别加入非互补的探针单链DNA溶液和序列完全互补双链DNA溶液各1μL，混匀，观察纳米金溶液的颜色；再分别加入浓度为0.05mg/ml 1μl聚噻吩，充分混匀，观察纳米金溶液的变化。
2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(1)中寡核苷酸探针与 杂交缓冲液的浓度比为1 10。
3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的纳米金颗粒为 13nm、纳米金溶液浓度为12nM。
4.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的DNA探针与聚 噻吩衍生物的浓度比为1:1。
5.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(一)/(1)中使用的硝酸纤维 尼龙膜的孔径为0. 22 μ m。
6.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的目标靶序列的 检测是指以靶Hmi DNA作为杂交模板。
7.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于纳米金结合聚噻吩衍生物检测灵敏度为49nM 。
全文摘要
本发明涉及一种纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法，包括检测试剂(纳米金和聚噻吩衍生物)及探针的准备；目标靶序列的检测等。该发明基于聚噻吩衍生物与ssDNA/dDNA结合时使得DNA-纳米金溶液的稳定性发生变化而引起颜色改变产生信号级联放大的原理，通过颜色转变显示剂以及扩增标签的双重作用实现DNA的高灵敏快速检测，从而建立利用纳米金结合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析平台。该方法操作简单，不需要特殊的仪器设备，具有特异、快速和高灵敏的特点，可望应用于临床检验医学及环境中靶目标DNA的诊断和检测。
文档编号G01N21/33GK101818198SQ20101011818
公开日2010年9月1日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者娄新徽, 张宏莲, 毛红菊, 王树, 赵建龙, 郭青川, 金庆辉 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所