专利名称：：H5n1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及H5m亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途。
背景技术：
：禽流感(avianinfluenza,Al)是由A型流感病毒引起的一种家禽和野禽感染的疾病综合征。其病原禽流感病毒(avianinfluenzavirus,AIV)属正粘病毒科，流感病毒属，为单股负链RNA病毒。对A型流感病毒，根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，又将流感病毒进一步分为不同的亚型。目前，A型病毒有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，这些亚型均在禽流感病毒中存在。禽流感病毒依据病毒毒性又分为两类高致病性禽流感病毒(HPAI)，它可以导致全身性的致死感染，最快在感染后M小时内杀死鸟类，通常在一周内致死；低致病性禽流感病毒(LPAI)，它很少会引起严重疾病的爆发，相关的患病率和致死率也比HPAI低。在1997年5月，一株H5WAIV在香港一名三岁男孩中分离得到，男孩最终死于由REYE综合症引起的严重流感肺炎，这表明携带HPAIH5N1病毒的鸟类可以直接将病毒传向人类。与HPAIH5N1相关的最严重一次爆发出现在2003-2004年亚洲的10个国家，导致大约1.5亿只禽类死亡。尽管HPAI病毒的爆发在大多数国家中主要限制在家禽中(主要是鸡类)，但是存在潜在的可能传向人类，越南，泰国和柬埔寨三个国家共计发生53例感染HPAI病毒死亡案，且这次爆发的致死率远远高于1997年那次(54.6%对33.3%，据官方报道的病患数字)。禽流感的爆发引起了世界范围内对高致病性禽流感病毒在无免疫力人群中大规模传染的担忧，迫切需要人们对高致病性禽流感病毒进行系统研究。假病毒(pseudotypevirus)是指一种病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的包膜，而基因组保持着病毒本身基因组特性的病毒W]。假病毒技术的应用主要是基于两点即一种有囊膜的病毒其感染细胞仅仅是由其包膜蛋白所决定的，其次，一种病毒的包膜能够整合到另外一种病毒颗粒的表面。假病毒感染系统易于操作，它在细胞内只能进行单一周期复制，安全性好；其在体外环境下模拟天然病毒感染细胞的过程，具有广泛的宿主范围，更高的转染效率，还具有抵抗血清补体的攻击，非细胞周期依赖性地高效转染静止细胞等优点，因而假病毒在研究病毒进入过程、受体鉴定、中和抗体检测、疫苗评价等方面具有重要作用。在国外，已对一些危险病毒构建了一系列以反转录病毒为载体的假病毒体系，如人免疫缺陷病毒，丙型肝炎病毒，埃博拉病毒，SARS冠状病毒等。目前存在若干种假病毒制备系统，常见的如在鼠白血病病毒(MuLV)基础上构建的假病毒系统。对于MuLV系统来说，主要由3个质粒组成，分别为MuLV基因组质粒(包括包装信号、标记基因LacZ)、MuLV结构蛋白表达质粒(gag，pol)和外源囊膜表达质粒。当将三种质粒共转染HEK293T(人胚肾293T)细胞时，上清当中就会产生病毒样颗粒，这些复制缺陷型病毒颗粒可以感染许多种细胞类型。本发明将采用一种新的假病毒系统制备方法，并探讨这种方法的安全性和有效性。禽流感病毒表面抗原血凝毒(HA)和神经氨酸酶(NA)与病毒的致病性、复制及传播关系密切。HA表面抗原介导了病毒与宿主细胞表面受体的结合并促进了病毒融合过程中病毒RNA的释放。HA分子的前体在翻译后被宿主细胞内的蛋白酶切割成HAl和HA2亚基，在HA2的氨基末端产生了一个融合遗传区域，介导了病毒与细胞质膜的融合。因此，HA表面抗原在病毒的致病性方面起着重要角色，是病毒感染细胞的先决条件。NA是禽流感病毒表面的另一种重要抗原，它通过水解宿主细胞表面特异性受体糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸，促进成熟的病毒从宿主细胞中释放从而进一步感染其它宿主细胞。已知H5m亚型高致病性禽流感病毒具有高度传染性，且病死率较高，直接用H5m亚型高致病性禽流感病毒开展研究具有相当大的危险性，且需要苛刻的实验条件，因此研制H5m亚型高致病性禽流感病毒的假病毒感染模型非常必要和急需。
发明内容本发明的假病毒以HIV病毒包装质粒pNL4-3Luc+Env-Vpr-为假病毒包装质粒，该质粒可以表达荧光素酶作为报告基因，Vpr为复制酶蛋白基因，其缺陷导致病毒无法复制，Env编码病毒的包膜糖蛋白，其缺陷使得该质粒无法表达膜蛋白，Env及Vpr基因的同时缺失，使该质粒不具有感染能力以及进一步复制产生新一轮的病毒的能力，保证生物安全性。本发明通过聚合酶链反应(PCR)方法，将H5W禽流感病毒的HA和NA全长基因连入一个真核细胞表达载体pBudCE4.1，相比将两个基因连入不同的载体，这保证了基因表达效率的一致性，将该质粒作为外源目标膜蛋白基因与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装出子代禽流感假病毒颗粒。该假病毒颗粒具有感染禽流感病毒易感细胞系(如MDCK)的功能。通过假检测病毒感染细胞后所表达的荧光素酶，就可以定量地反映假病毒对细胞的感染情况并进而判断假病毒的有效性。由此完成本发明。因此，本申请提供一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因。在一个具体实施例中，所述包装质粒表达报告基因。在一个具体实施例中，所述报告基因编码荧光素酶。在一个具体实施例中，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+Env_Vpr_；pHR，CMV-Luc和pCMVRΔ8.2。在一个具体实施例中，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、Η5亚型和Η7亚型的HA基因和NA基因。在一个具体实施例中，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCCNO:V200917的禽流感假病毒。本申请还提供一种制备禽流感假病毒的方法，该方法包括使用含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒和包装质粒共转染宿主细胞，培育该宿主细胞，和从培养基上清中收集禽流感假病毒。在一个具体实施例中，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+EmTVpf；pHR’CMV-Luc和pCMVRΔ8.2。在一个具体实施例中，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、H5亚型和H7亚型的HA基因和NA基因。在一个具体实施方式中，所述宿主细胞选自HEK293T细胞和细胞。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因含于相同的一个质粒中。在一个具体实施例中，使用真核细胞表达载体来构建同时含有HA基因和NA基因的质粒。在一个具体实施方式中，所述真核细胞表达载体选自pBudCE4.1、pcDNA3.1和pCMV/R。本申请还提供禽流感假病毒的用途，用于测定感染者体内的中和抗体的效价或寻找禽流感病毒表面中和抗体结合的表位，或者用于体外药物筛选或疫苗效果评价。在一个具体实施方式中，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCCNO:V200917的禽流感假病毒。本申请还提供一种禽流感假病毒制备系统，该系统包括包装质粒和含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因分别处于独立的质粒中。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因处于同一质粒中。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因分别由pGEMT_NA和pGEMT_H质粒提供。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因处于同一真核细胞表达载体中。在一个具体实施方式中，所述真核细胞表达载体选自pBudCE4.1、pcDNA3.1和pCMV/R。在一个具体实施方式中，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+Env_Vpr_；pHR’CMV-Luc和pCMVRΔ8.2。在一个具体实施方式中，所述系统还包括一说明书，用于指导实施本申请所述的制备禽流感假病毒的方法。根据本申请，H5m亚型禽流感假病毒不具有复制能力，也不会引起H5m亚型禽流感病毒导致的特异性细胞病变，因此可以最大程度降低H5m亚型禽流感病毒研究过程中的各种风险。而且，由于假病毒的亲噬性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟病毒感染的早期过程，而且假病毒内携带有报告基因，可以非常方便地快速地进行各种检测和分析，因此假病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的关系，克隆细胞表面受体，更重要的是可以用于测定感染者体内的中和抗体的效价，寻找H5m亚型禽流感病毒表面中和抗体结合的表位，评价疫苗免疫的效果，是研究烈性传染病病毒安全有效的重要途径。此外，利用这一模型研究H5m亚型禽流感病毒侵染宿主细胞的全过程和阻断这一过程的途径从而为大规模的体外药物筛选，疫苗效果评价的初筛提供了简单安全的方法。此外，当将NA和HA基因连在同一个质粒中然后再与包装质粒共转染时，可为本申请的方法提供了便利性，在转染制备假病毒的时候仅需要包装质粒和该载体即可。而且，用一个载体尽量最大程度的保证了HA和NA蛋白翻译效率的一致，有利于假病毒的成功包装，根据发明人的实验结果显示，连入一个载体的感染效果比用独立的载体转染效果好。此外，从大规模运用的角度来看，连入一个载体将制备质粒的成本就省去了一半，节约了成本。图1显示HA和NAPCR产物电泳图。其中，l:100bpMarker；2:HAPCR产物；3:空白；4:NAPCR产物；5:lkbMarker。图2显示重组质粒的酶切鉴定。其中，1=Marker；2:1#克隆BamHI和XhoI酶切鉴定；3:3#克隆BamHI和XhoI酶切鉴定；41#克隆EcoRI和XhoI酶切鉴定；5:3#克隆EcoRI和XhoI酶切鉴定。图3显示联合疫苗免疫血清中和试验结果。图4显示HAl三株单抗中和活性检测结果。具体实施例方式因此，本申请第一方面提供一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因。在具体实施例中，所述包装质粒该质粒表达报告基因。在一个具体实施例中，所述报告基因编码荧光素酶。本申请第二方面提供一种禽流感假病毒的制备方法，该方法包括使用含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒和包装质粒共转染宿主细胞，并从培养基上清中收集禽流感假病毒。本申请第三方面提供一种禽流感假病毒的用途，用于测定感染者体内的中和抗体的效价或寻找禽流感病毒表面中和抗体结合的表位。本申请第四方面提供一种禽流感假病毒的用途，用于体外药物筛选或疫苗效果评价。本申请第五方面提供一种禽流感假病毒制备系统，该系统包括包装质粒和含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒。在具体的实施方式中，本申请的禽流感假病毒制备系统可包括(1)包装质粒；和(2)同时含高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒；或者包括(1)包装质粒；(2)各自含有HA基因和NA基因的质粒；和(3)用于连入HA基因和NA基因的空载体。本申请的禽流感假病毒制备系统还可含有其它相关的试剂，例如引物、酶、转化试剂等。本申请第六方面提供一种培养物，该培养物含有本申请的禽流感假病毒和宿主细胞。该培养物还可含有适于该宿主细胞生长的培养基。本文中，高致病力禽流感病毒包括各种Hl亚型、H5亚型和H7亚型，包括但不限于H5N1亚型等。因此，本发明的禽流感假病毒可包含H5亚型或H7亚型的HA基因和NA基因，例如含有H5m亚型的HA基因和NA基因。高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因是现有技术已知的，其核苷酸序列可从Genebank中获得，也可从市场上可购得的包含HA基因或NA基因的质粒获得，这类质粒包括但不限于pGEMT-HA质粒和pGEMT-NA质粒。用于本申请的HA基因和NA基因包括其变异体，只要该变异体仍然能够保留野生型HA基因和NA基因的功能即可。例如，本申请包括与H5m亚型的HA基因和NA基因具有一定序列相同性、且具备H5W亚型的HA基因和NA基因的生物学活性的变异体。所述相同性至少为，例如80%,85%,90%,95%,97%,99%以上。通常，“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到相同性百分数。在同源性和相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、Μ.0.(AtlasofProteinSequenceandStructure^M.0.Dayhoff编辑，5Suppl.,3353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,DC),它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(AdvancesinApp1.Math.，2=482-489,1981)。可从WisconsinSequenceAnalysisPackage(第8版，从GeneticsComputerGroup,Madison,WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述WisconsinSequenceAnalysisPackage所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gappenalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。本发明建立同源性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由JohnF.Collins禾口ShaneS.Sturrok开发、由IntelliGenetics,Inc.(MountainView,CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分=12，间隔延伸罚分=1，间隔=6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列同源性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP基因编码=标准；过滤=无；链=两；截留=60；期望值=10；矩阵=BL0SUM62；描述=50个序列；排序=HIGHSCORE；数据库=无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。或者，在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化的片段的大小，从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNACloning，同上；NucleicAcidHybridization，同上。可采用常规的方法获得用于本申请的HA基因和NA基因。然后将其分别克隆入相同的质粒中。例如，在本申请的一个实施例中，分别从pGEMT-NA质粒和pGEMT-HA质粒获得NA基因和HA基因，然后先将NA基因克隆到pBudCE4.1载体中，获得pBudCE4.I-NA质粒，然后再将HA基因克隆到pBudCE4.I-NA质粒中，从而获得同时含有HA基因和NA基因的质粒。用于连入NA基因和HA基因的载体包括各种真核细胞表达载体，包括但不限于pBudCE4.1(美国hvitrogen公司产品)、pcDNA3.1(美国hvitrogen公司产品)、pCMV/R(美国Promega公司产品)。可将本发明构建的载体按常规方法转化大肠杆菌DH5α，从而进行质粒的扩增和纯化，并对质粒测序。DNA测序结果可用DNASTAR软件分析，与genebank中hfluenzaAvirus(A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1))序列比对，用以判断载体构建是否正确。由此构建得到的表达质粒可与包装质粒共转染宿主细胞。包装质粒较佳含有报告基因，例如荧光素酶基因。常用的包装质粒例如是pNL4-3LuC+EnV-Vpr-。还可以使用pHR’CMV-Luc和pCMVRA8.2(两个质粒一起使用，构建方法参考文献Naldinietal.，1996；Zuffereyetal.1997；Naldini,L.,Blomer,U.,Gallay,P.,Ory,D.,Mulligan,R.,Gage,F.H.,Verma,I.Μ.,Trono,D.,1996.Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272,263-267；Zufferey,R.,Nagy,D.,Mandel,R.J.,Naldini,L.,Trono,D.,1997.Multiplyattenuatedlentiviralvectorachievesefficientgenedeliveryinvivo.Nat.Biotechnol.15,871-875)。宿主细胞通常选自HEK293T细胞，还可以使用Q93FT细胞是一种在细胞基础上经过改进的细胞系，具有很高的生长倍增速率)。用于本申请的转染方法是常规的，例如可参见《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)。可在适于该宿主细胞生长的条件下培育该转染的宿主细胞，并可采用常规的方法收集宿主细胞培养物上清中的假病毒，例如，采用常规的离心方法即可。所获得的假病毒可采用常规的方法验证，例如，通过检测该假病毒所携带的报告蛋白如荧光素酶来验证。还可通过感染实验和抗体中和实验来验证假病毒的感染力和中和抗体活性。在一具体实施例中，采用本申请的制备方法制备得到了H5W亚型禽流感假病毒ABRC(pseudo-typeH5N1avianinfluenzavirus-ABRC)，该假病毒已于2009年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，430072)，保藏编号是CCTCCNO:V200917。因此，本申请的禽流感假病毒的制备方法可包括(1)提供高致病力禽流感病毒HA基因和NA基因；(2)将所述HA基因和NA基因共连接入真核细胞表达载体中；(3)将步骤(所得包含HA基因和NA基因的真核细胞表达载体与包装质粒共转染宿主细胞；和(4)培养转染的宿主细胞，和从细胞上清中回收假病毒。可从含有致病力禽流感病毒HA基因和NA基因的质粒中分别提供所述HA基因和NA基因，然后将其共连接入真核细胞表达载体中。本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(FundamentalVirology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(HandbookofExperimentalImmunology)，第I-IV卷(D.Μ·Weir和C.C.Blackwell编，BlackwellScientificPublications)；Τ.Ε.Creighton,〈〈蛋白质结构禾口分子特性》(Proteins!StructuresandMolecularproperties)(W.H.FreemanandCompany,1993)；A.L.Lehninger,〈〈生物化学〉〉(Biochemistry)(WorthPublishers,Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloning:aLaboratoryManual)，第二版，1989；《酶学方法》(MethodsinEngymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)。实施例1:H5m亚型高致病性禽流感病毒HA和NA蛋白基因的克隆1.1通过PCR方法扩增出NA的DNA序列克隆NA基因的PCR引物设计，根据已测序的pGEMT-NA基因[InfluenzaAvirus(A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1))]序列，按照引物设计原则，使用Primerpremierf.O软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。序列分别为Sp5，-CCCAAGCTTATGAATCCAAATCAGAAG-3’(SEQIDNO1)As5’-GCTCTAGACTACTTGTCAATGGTGAATGG-3’(SEQIDNO2)引物序列中的X下划线分别表示限制性内切酶HindIII和)(baI位点。1.2将PCR产物连接至IjpBudCE4.1载体(购自Invitrogen公司)用限制性内切酶HindIII和)(baI酶切后插入到经过同样酶切的pBudCE4.1载体，位于CMV启动子后，获得pBudCE4.1-NA。1.3通过PCR方法扩增出HA的DNA序列克隆HA基因的PCR引物设计，根据已测序的pGEMT-HA[InfluenzaAvirus(A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1))]序列，按照引物设计原则，使用Primerpremier5.O软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。序列分别为Sp5，-ATAAGAATGCGGCCGCATGGAGAAAATAGT-3‘(SEQIDNO3)As5，-CCGCTCGAGAGAAATGCAAATTCTG-3’(SEQIDNO4)引物序列中的X下划线分别表示限制性内切酶NotI和)(h0I位点。1.4将PCR产物连接到pBudCE4.1载体用限制性内切酶NotI和BioI酶切后插入到经过同样酶切的pBudCE4.I-NA载体，位于EF-Iα启动子后，获得pBudCE4.l-NA-HA。1.5将前述构建的载体常规方法转化大肠杆菌DH5α，从而进行质粒的扩增和纯化并将质粒送测序公司测序。1.6DNA测序结果用DNASTAR软件分析，与genebank中hfluenzaAvirus(A/Chicken/Henan/12/2004(H5N1))序列(HA的GenBank登录号为AY950233.1，NA的GenBank登录号为AY950248.1)比对，判断载体构建正确。实验结果见图1和2，通过PCR产物图和质粒酶切验证结果图，判定假病毒质粒构建成功，HA和NA蛋白的基因成功克隆克隆至载体pBudCE4.1上。实施例2:H5m亚型禽流感假病毒的制备，采用脂质体转染方法(购自hvitorgenlipofectamine2000)2·1将需要转染的质粒pNL4-3Luc+Envlpr-("ConservedaminoacidsW423andN424inreceptor-bindingdomainofSARS-CoVarepotentialtargetsfortherapeuticmonoclonalantibody，，，ChaoBian等，Virology383(2009)39-46；"Analysisofhemagglutinin—mediatedentrytropismofH5N1avianinfluenza",YingGuo等，VirologyJournal2009,639；VprIsRequiredforEfficientReplicationofHumanImmunodeficiencyVirusType-IinMononuclearPhagocytes,Connor等，Vigology206,935-944(1995)),pBudCE4.l-NA-HA、绿色荧光蛋白表达质粒pGFP("HemagglutininpseudotypedlentiviralparticlesCharacterizationofanewmethodforavianH5N1influenzasero-diagnosis，，，IsabelleNefkens等，JournalofClinicalVirology39(2007)27-33)、水泡性口炎病毒G蛋白表达质粒pVSVG^nfectiousifepatitisCVirusPseudo-particlesContainingFunctionalE1-E2EnvelopeProteinComplexes，，BirkeBartosch等，JournalofExperimentalMedicine197(2003)633-642)采用试剂盒大量抽取和纯化(QIAGENplasmidmidipurificationkit)，制备转染质粒。2.2取质粒①pGFP,②pBudCE4.l-NA-HA,pNL4_3，③pVSVG、pNL4_3和④空pBudCE4.1、pNL4-3采用脂质体转染的方法按下文第2.3部分所示的量分别转染细胞，以pGFP为转染阳性对照，以空载体为假病毒阴性对照，以VSVG作为假病毒的阳性对照(VSVG对任何细胞都有很强的感染力)。2.3转染量①转pGFPIOug;脂质体25ul②转pNL4-3Luc+Envlpr-5ug，pBudCE4.I-NA-HA5g；脂质体25ul③转pNL4-3Luc+Envlpr-5ug，pVSVG5ug；脂质体25ul④转pNL4-3Luc+Envlpr-5ug，空pBudCE4.15ug；脂质体25ul2.4假病毒的收获和简单纯化按上述比例转染HEK293T细胞，转染48小时后3000转5分钟简单离心，收集假病毒上清，冻存于-70°C或马上进行MDCK细胞感染性测定。转染48小时后观察在荧光显微镜下观察转pGEP的孔，80%的细胞表达绿色荧光蛋白(GEP)，表明转染效率较高。实施例3:H5N1禽流感假病毒感染性的测定(以M孔板为例)实验方法1、感染前一天在M孔板内铺板，使每孔MDCK细胞数为5X104。2、24h后，吸取原有的培液，每孔加入100μ1假病毒上清(即实施例2制备的三种假病毒上清)和900μIMDCK细胞培养液的混合物感染MDCK细胞。3、感染24h后，补加Iml新鲜MDCK细胞培养液。4、感染48h后，弃上清，按100μ1/孔加入裂解液(Promega产品)，常温下裂解。5、将上裂解的细胞上清转移至1.5mlEP管中，12000转离心10分钟，然后取10μ细胞裂解上清，10μ1荧光素酶AssayReagent(购自promega公司，货号E1500)，迅速混合后用荧光检测仪检测荧光强度，重复两次记录实验结果。实验结果见下表1:表1假病毒感染后荧光素酶表达值荧光素酶值1荧光素酶值2荧光素酶平均值荧光素酶标准差VSVG263577234334248955.520677.923602H5N1154901511715303.5263.75082938阴性对照336927493059438.40620434空白对照15926321173.539105243结果分析空白对照为细胞上清，阴性对照为空pBudCE4.1载体包装出来的病毒，从上述实验结果可以分析出，相比阳性对照VSVG，虽然感染力不及VSVG但是制备的H5W假病毒具有一定的感染能力，在体外可以模拟病毒侵染细胞的过程。采用分开转染HA和NA表达质粒的方法，在其他条件都一样的情况下，两次实验所得的荧光素酶荧光值分别是1042和1192。该H5m假病毒命名为H5m亚型禽流感假病毒ABRC(pseudo-typeH5N1avianinfluenzavirus_ABRC)，该假病毒已于2009年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，43007，保藏编号是CCTCCNO:V200917。实验例4:H5N1禽流感假病毒检测联合疫苗免疫后血清内中和抗体活性用H5mDNA联合疫苗免疫小鼠。该疫苗为编码A/Chickn/Hnan/12/2004(Η5Ν1)病毒HA基因DNA疫苗，HA的基因利用NotI和BiolI双酶切位点连接到pBudCE4.1的EF-Ia启动子后面，构成P-HA；采用德国QIAGEN公司的中抽-大抽试剂盒获得大量P-HA做为DNA疫苗；于小鼠周龄雌性Balb/C小鼠)两后腿肱四头肌进行肌肉注射，50yg/100ylPBS/只小鼠，注射后，马上使用5mm距离的电极，在针孔两侧插入注射区域的肌肉进行电击，电击仪器为ElctroSquarPoratorT30M；BTX,SanDigo，CA。每隔三周免疫一次，共免疫三次，第三次免疫后7天取小鼠血清用于本实施例的检测，该血清命名为HA3#。检测步骤如下①MDCK细胞铺板(24孔板)，5XIO4个/孔②24h后，将IOOul的假病毒+900ul稀释好的疫苗免疫血清(用培液倍比稀释，稀释度1100、500、1000、2000、4000、8000)，置培养箱内37工1小时，然后将原有MDCK细胞培液吸走，加入含有假病毒和稀释抗体的培液。系统对照VSVG+900ul培液阳性对照H5m假病毒+900ul培液阴性对照H5m假病毒+900ul培液+无关血清转染空载体的假病毒+900ul培液空白对照直接加培液③4后，补加Iml新鲜培液，培液中按比例加入抗体(稀释度1100，500、1000、2000、4000、8000)④7后，测荧光素酶荧光值，检测方法同实施例3。实验结果如下表2所示。表2假病毒检测联合疫苗免疫的小鼠血清内中和抗体活性荧光素酶{I[1荧光素酶{I12荧光素酶平均值荧光素酶标准差VSVG263577234334248955.520677.923602H5N1154901511715303.5263.75082938阴性对照336927493059438.40620434空白对照15926321173.539105243无关血清11978118781192870.710678119HA3#1800056475589561841.012193309HA3#14000457541474361302.64170235HA3#12000361731713394315.36962441HA3#1100013241454138991.923881554HA3#15001965195319598.4852813742HA3#1100385730353446581.24177414实验结果分析从上述实验结果分析，疫苗免疫后的血清具有一定的中和抗体活性，随着抗体稀释比例的不断下降，病毒的感染力也不断下降，说明该血清具有一定的阻断病毒侵染细胞的能力。相比而言，无关血清并不能阻断假病毒的侵染。实验例5:H5N1禽流感假病毒检测单克隆抗体的中和活性检测用原核表达的HAl蛋白免疫，并通过原核表达的HAl蛋白筛选的三株单克隆抗体的中和活性，用以判定原核表达的蛋白是否可以筛选出具有中和活性的抗体，三株单抗为自己实验室制备，分别命名为98#，157#，145#(或者使用货号为ABIN235650或者ABIN235652的抗体，见www.antibodies-online,com)。实验方法①MDCK细胞铺板(24孔板)，5XIO4个/孔②24h后，将IOOul的假病毒+900ul稀释好的疫苗免疫血清(用培液倍比稀释，稀释度1500，1000，2000)，置培养箱内37°C1小时，然后将原有MDCK细胞培液吸走，加入含有假病毒和稀释抗体的培液。2000)标准差系统对照VSVG+900ul培液阳性对照H5m假病毒+900ul培液阴性对照H5m假病毒+900ul培液+无关血清转染空载体的假病毒+900ul培液空白对照直接加培液③4后，补加Iml新鲜培液，培液中按比例加入抗体(稀释度1④7后，测荧光素酶荧光值，检测方法同实施例3。结果显示在下表3中。表3假病毒检测联合三株单抗的中和抗体活性荧光素酶值1荧光素酶值2500，1000，荧光素酶平均值荧光素酶空白19.798989873阴性2029.396462H5N1188319.50639阳性22543.978398对对眧眧22083019237002062265血清944001200022868612103251968041077163212745阳性血清13145.918069598#184867.66298598#1129066.0794598#127874.149314157#121213.203436157#1336862.84213157#161005.637547145#192630.988335145#173295.153404145#1144378.4768无关1626.3455967无关36164.976324无关500100020005001000200050010002000血清1血清1血清1100033241896501685896850840702574101369310187501131068891936104922450013634061000900510200012642732879210165228684238902606725741490089932475100006899559112534061361106951655156368631016.5956511.5777159.58705506875741251891975612.51065568943763.511513151362256926082.51413979.5211716.96268实验结果分析与阳性血清相比(该血清内含有中和抗体)，三株单克隆抗体均不能很好阻断假病毒的侵染，说明由于原核表达的蛋白因为蛋白翻译效果的差异，不能很好的诱导中和抗体的产生。实验结论通过实验3，4，5，说明H5W亚型禽流感假病毒能够作为行之有效的检测手段，用于禽流感中和抗体的研究。上述实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。本发明的保护范围将由本申请的权利要求书所限定。权利要求1.一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因。2.如权利要求1所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述包装质粒表达荧光素酶作为报告基因。3.如权利要求1或2所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+EnvTpr"；pHR'CMV-Luc和pCMVRA8.2。4.如权利要求1-3中任一项所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、H5亚型和H7亚型的HA基因和NA基因。5.如权利要求1-4中任一项所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCCNO:V200917的禽流感假病毒。6.一种制备禽流感假病毒的方法，其特征在于，该方法包括使用含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒和包装质粒共转染宿主细胞，培育该宿主细胞，和从培养基上清中收集禽流感假病毒。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包装质粒选自pNL4-3LuC+EnV-Vpr-；pHR'CMV-Luc禾口pCMVRA8.2。8.禽流感假病毒的用途，其特征在于，用于测定感染者体内的中和抗体的效价或寻找禽流感病毒表面中和抗体结合的表位，或者用于体外药物筛选或疫苗效果评价。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCCNOV200917的禽流感假病毒。10.一种禽流感假病毒制备系统，其特征在于，该系统包括包装质粒和含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒。全文摘要本申请涉及H5N1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途。具体而言，本申请涉及含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的禽流感假病毒、其制备方法及其用途；以及用于制备该假病毒的系统。文档编号G01N33/577GK102191223SQ20101011810公开日2011年9月21日申请日期2010年3月5日优先权日2010年3月5日发明者孙兵,徐莹申请人:中国科学院上海生命科学研究院