专利名称：一种定量检测生鲜牛乳中β-内酰胺酶残留含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测生鲜牛乳中β -内酰胺酶残留含量的测定方法。
背景技术：
β -内酰胺酶是一种近年来才开始引起大家关注的食品添加剂，主要添加在牛奶中以生产无抗奶(指用不含抗生素的原料生产出来的牛奶)。内酰胺酶作为牛奶中抗生素分解剂(解抗剂)，最初是科研人员作为一项科研成果推出的。这种做法可有效分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。但是应用β-内酰胺酶分解牛奶中抗生素的风险在于 (1)人体大量摄入β-内酰胺酶可能会导致人体产生细菌耐药性，因此行政主管部门已经明令禁止在生鲜乳中添加；( 在分解β -内酰胺药物后，可能引进其他有害物质(青霉素噻唑酸等)；C3)解抗剂的添加纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。正因为如此，卫生部于2009年2月正式公布了《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》，其中明确认定内酰胺酶是属于违法添加的非食用物质，其作用就是掩蔽抗生素。虽然卫生部已经明文规定β -内酰胺酶属于不安全食品添加剂，但是，由于细菌耐药产生的内源性β -内酰胺酶有300多种，且内源性、外源性β -内酰胺酶的区别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的生鲜牛乳中内酰胺酶的检测方法无论是仪器分析、色谱法、配体-受体法还是微生物法，都存在一个不确定因素，即测出的 β-内酰胺酶无法判定是人为添加(外源性)的或是耐药细菌产生(内源性)的。也就是说，乳制品中检出的内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。在尚未制定内酰胺酶残留限量标准的前提下，获得完整的定量检测数据将是监督部门制定限量标准的重要依据。因此内酰胺酶定量检测方法的研究应运而生。生鲜牛乳中的β -内酰胺酶残留检测从方法学上可以分为以下两种1)通过测定未分解的酶促反应底物(青霉素)的含量来间接推算体系中内酰胺酶的浓度。该方法以生物测定法(杯碟法)及配体-受体检测法为代表，其特点是原理明确、特异性强。2)通过测定底物青霉素分解产物的方法，青霉素经过内酰胺酶的分解之后生成稳定的中间产物-青霉噻唑酸，通过测定体系中青霉噻唑酸的含量将能够计算出β -内酰胺酶的含量。 该方法以碘量法、产色头孢菌素法为代表。但是，上述两类检测方法都存在一定的缺陷。无论上述哪一种方法都还不能做到定量化，而测定未分解的酶促反应底物的方法又存在时间长、成本高的缺陷。同时，内酰胺酶作为一类小分子的蛋白09kDa 39kDa)混在大量的蛋白、氨基酸乳浊液(牛奶)中， 如果缺乏有效的检测手段则很难将其特异性分离。因此，找到一种既能精确定量又能快速、 高效检测出内酰胺酶残留的方法势在必行
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种定量检测生鲜牛乳中β -内酰胺酶残留含量的测定方法。本发明借鉴经典的碘量法，利用其快速高效重复性好的特点，克服其原先只能采用比色法作为定性分析的技术瓶颈，采用可见光比色法，借助分光光度计、酶标仪等简单仪器，即能快速定量检测β -内酰胺酶的残留量。本发明的定量检测生鲜牛乳中β -内酰胺酶残留含量的测定方法，利用β -内酰胺酶可分解牛奶样品中β-内酰胺类抗生素的原理，通过测定与β-内酰胺酶反应后分解出的青霉素噻唑酸的含量来检测牛奶中残留β-内酰胺酶的含量。首先，本发明的测定方法是根据青霉素G经内酰胺酶作用而产生的裂解酸与碘结合，可使蓝色的碘淀粉复合物褪色的原理而设计的。反应式如下青霉素G+β -内酰胺酶一青霉素噻唑酸青霉素噻唑酸+碘-淀粉(蓝色)一褪至白色碘量法定量分析原理是基于水解ImoL青霉素大约相当于SmoL碘，以青霉素作底物时Perret碘法应用最广。作为一种特殊的指示剂，本发明采用可溶性淀粉与游离碘生成深蓝色络和物的专属反应来指示滴定终点。当I2溶液的浓度为5X10-6mol/L时即能看到蓝色，极其灵敏。一直以来碘量法定量受到实验条件限制(反应温度要求精确、反应时间控制严格)，仅仅是作为定性方法作为确证方法的前期筛选。随着比色法的相关设备开发越来越成熟(温度控制酶标仪、生化仪及其它相关仪器设备已经广泛应用)，碘量法应用于微量物质的定量测定也有不少应用。本发明的定量测定方法将碘量法、比色法结合利用，采用淀粉和青霉素噻唑酸 (ΒΡΑ，β -内酰胺酶分解底物产生)竞争结合碘造成其颜色深浅不同的原理，产生颜色的深浅与被分解物的浓度成反比，再用分光光度装置显示颜色深浅的程度。吸光度值与标准曲线对比后，实现精确定量。本发明定量检测方法具体步骤如下1)试样制备取经检测不含β -内酰胺酶的生鲜牛乳样品，恢复至室温，充分混勻后备用。2)打开水浴锅，调节温度备用。3)用稀释液将浓缩标准品稀释至10U/mL、8U/mL、6U/mL、4U/mL、2U/mL、0U/mL浓度的β-内酰胺酶标准品。4)取待测样品加入样品管中，同时各取稀释液、β内酰胺酶标准品分别加入样品管中。5)将上述各管混勻后孵育。6)向孵育后的样品管中加入样品处理液，充分混勻后离心。7)取清液加入96孔板中，并加入等体积混合的试剂A和试剂B。8)读取吸光度。9)结果判读，用578nm下的吸光度OD值，并使用标准曲线计算。①计算Δ OD值，即以OU/mL的β内酰胺酶所得吸光度ODtl值为基准，用其它浓度的β内酰胺酶标准品溶液所得ODi值减去OU/mL的β内酰胺酶所得吸光度ODtl值。AOD = ODi-OD0
②以AOD值为纵坐标，以β-内酰胺酶浓度为横坐标，做标准曲线，图1即为 β-内酰胺酶的标准曲线。③根据每个样品的AOD值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。10)准确度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，使其不得超过算术平均值的20%。上述方法中，所述稀释液是ρΗ为6. 5的磷酸缓冲液，浓缩标准品是浓度为200U的内酰胺酶溶液，。上述方法中，所述试剂A为碘溶液，所述试剂B为淀粉溶液。上述方法中，所述样品处理液为ρΗ4. 8的醋酸缓冲液。上述方法中，所述样品管中事先含定量的(IOOyg)青霉素G标准品，购自中国药品生物制品检定所。根据上述方法，本发明对生鲜牛乳中β -内酰胺酶检测灵敏度达到0. 5U/mL，定量线性范围为OU/mL 10U/mL。
图1为β -内酰胺酶的标准曲线，其中R为相关系数。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明的试剂和材料除非另有规定，均为分析纯试剂；实验用水应符合GB/T6682 中三级水要求或相当纯度的水。实施例1β-内酰胺酶的测定1)试样制备取经检测不含β -内酰胺酶的生鲜牛乳样品，恢复至室温，充分混勻后备用。2)分析步骤①打开水浴锅，调节温度到37°C备用。②用稀释液将200U浓缩β内酰胺酶标准品稀释至1 OU/mL、8U/mL、6U/mL、4U/mL、 2U/mL、OU/mL浓度的β内酰胺酶标准品。③取800 μ L待测样品加入样品管中，同时各取800 μ L稀释液、β内酰胺酶标准品分别加入样品管中。④将上述各管混勻后37°C孵育30min。⑤向孵育后的样品管中加入800 μ L样品处理液，充分混勻后以4000rpm离心 5min。⑥取清液200 μ L加入96孔板中，并加入50 μ L (等体积混合的试剂A和试剂B)。⑦578nm下读取吸光度。
3)结果判读①计算AOD值，即以OU/mL的β内酰胺酶所得吸光度ODtl值为基准，用其它浓度的β内酰胺酶标准品溶液所得ODi值减去OU/mL的β内酰胺酶所得吸光度ODtl值。AOD = ODi-OD0②以Δ OD值为纵坐标，以β -内酰胺酶浓度为横坐标，做标准曲线，图1为β -内酰胺酶的标准曲线，其中R为相关系数。③根据每个样品的AOD值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。实施例2β -内酰胺酶参照物质活力的测定本发明标定β -内酰胺酶活力浓度的方法是参考《中国药典》(2005版二部)定义的β -内酰胺酶活力测定方法37°C、60分钟内β -内酰胺酶转化底物(青霉素)成为青霉噻唑酸，青霉噻唑酸竞争与淀粉竞争结合12。淀粉作为专属指示剂；硫代硫酸钠溶液为标准溶液；精确测定β -内酰胺酶的活性浓度。本发明采用上述测定方法标定了 β -内酰胺酶的校准品(浓度为10000U/mL的β 内酰胺酶标准品)、浓缩标准品(浓度为200U/mL的β内酰胺酶标准品)、质控品(浓度为 5U/mL的β -内酰胺酶标准品)。实施例3β -内酰胺酶的定量方法1)比色法测定β -内酰胺酶的波长UV-2300紫外可见分光光度计全波长扫描显示碘-淀粉溶液最大吸收峰为 578nm，碘溶液最大吸收峰为351nm。2)酶反应动力学定量方法本发明采用终点法定量测定内酰胺酶即酶作用一段时间后，测定单位时间内产物生成量，计算酶促反应的平均速度。3)酶动力学法定量β -内酰胺酶酶活力的理论依据酶活性(U/mL)=平均吸光度值/时间X因子(F)F因子=总体积X 1000/样品量XtXeXs其中t =测试时间(min)，e =摩尔消光系数，s =流通池光程(cm)C 测=Δ A/minX F其中ΔΑ/min指平均每分钟吸光度的变化值，F同上。实施例4碘量法-比色法定量检测β -内酰胺酶的方法学验证1)标准曲线按实施例1的操作方法，重复三次测定标准曲线，结果如表1和表2所示。表 1
次数标准品1标准品2标准品3标准品4标准品5标准品612. 2241. 9011. 3531. 2230. 8560. 31权利要求
1.一种定量检测生鲜牛乳中β-内酰胺酶残留含量的测定方法，其特征在于，利用 β-内酰胺酶能够分解牛奶样品中β-内酰胺类抗生素的原理，通过测定与β-内酰胺酶反应后分解出的青霉素噻唑酸的含量来检测牛奶中残留的β -内酰胺酶；具体包括以下步骤1)试样制备取经检测不含β-内酰胺酶的生鲜牛乳样品，恢复至室温，充分混勻后备用；2)打开水浴锅，调节温度备用；3)用稀释液将浓缩标准品稀释成不同浓度的标准品；4)取待测样品加入样品管中，同时各取稀释液、标准品分别加入样品管中；5)将上述各管混勻后孵育；6)向孵育后的样品管中加入样品处理液，充分混勻后离心；7)取清液加入96孔板中，并加入等体积混合的试剂A和试剂B；8)读取吸光度；9)结果判读。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液是PH为6.5的磷酸缓冲液，所述浓缩标准品是浓度为200U的β -内酰胺酶溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品是浓度分别为10U/mL、8U/mL、 6U/mL、4U/mL、2U/mL、0U/mL 的 β -内酰胺酶标准品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂A为碘溶液，所述试剂B为淀粉溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品处理液为ρΗ4.8的醋酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品管中已放有100μ g青霉素G标准品。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测生鲜牛乳中β-内酰胺酶残留含量的测定方法，利用β-内酰胺酶能够分解牛奶样品中β-内酰胺类抗生素的原理，通过测定与β-内酰胺酶反应后分解出的青霉素噻唑酸的含量来检测牛奶中残留的β-内酰胺酶。根据本发明的测定方法，对生鲜牛乳中β-内酰胺酶检测灵敏度达到0.5U/mL，定量线性范围为0U/mL～10U/mL。
文档编号G01N21/31GK102212607SQ20101013907
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者张琪, 李康, 梁俊, 肖理文, 胡佳骏, 郭晓梅 申请人:上海优你生物科技股份有限公司