专利名称：基于siet的植物耐盐性快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物无损检测技术领域，尤其涉及一种基于SIET的植物耐盐性快速 检测方法。
背景技术：
盐害是影响农业生产及盐碱地区生态恢复的不利因素之一，全世界约20%耕地盐 渍化。我国有2. OX 107hm2盐荒地和6. 67X 106hm2盐渍化土壤，约可占耕地面积的25%。 对现有植物种质资源进行耐盐性评价，筛选耐盐植物对充分利用有农用潜力的大面积盐碱 土，恢复盐碱地区生态系统具有重要意义。一般情况下，植物的耐盐性与其对不同离子的吸收、运输、分配的调控能力有直接 关系，且认为植物的发芽期和苗期对盐分最为敏感。在盐胁迫条件下维持体内较低的Na+/K+ 对维持正常生长具有重要意义，因此植物对K+离子的保有能力成为耐盐植物的重要特征。非损伤性扫描离子选择电极技术(Scanning Ion-selective ElectrodeTechnique, SIET)是利用离子和分子选择性微电极结合计算机控制的自动定位 测量系统构成的扫描离子技术，可以以非损伤的方式测量到进出生物材料的离子以及分子 的运动速率、方向及浓度等信息。这种技术已经逐渐被应用到基础生物学、生理学、医学、农 林学以及药物机理等领域。澳大利亚塔桑马尼亚大学的Shabala小组利用与之相近的非 损伤性离子流检狈Ij技术(Non-invasive Microelectrode Ion FluxMeasuring Technique， MIFE)在大麦的抗盐研究上做了许多工作，证明盐胁迫下大麦幼苗根系的K+离子流速与其 耐盐性指标产量相关性可达到0. 85 (请参见Crop Science，2008，48 1382-1388.)。Cuin 在小麦上的研究表明，SOmMNaCl胁迫1小时后的K+离子流速与各项生理指标之间也存在极 大的相关性(请参见 Journal of ExperimentalBotany, 2008, 59 (10) :2697_2706)。目前对植物种质的耐盐性评价已有一些报道，所用材料有水稻，番茄，甘薯等。 评价所用的方法主要包括盐/碱胁迫下发芽指标法、形态伤害评价法和生长量比较法 等，或者利用具有盐浓度的组织培养来筛选耐盐的植株和突变体。尹伟伦在申请号为 200310113317.8的中国专利申请中根据植物细胞膜损伤程度，提出了对植物耐盐能力定 量评价的方法。朱为民在申请号为200610118700.6的中国专利申请中通过对一定盐浓 度下幼苗盐害调查和盐胁迫指数的计算，进行番茄品种耐盐筛选。刘庆昌等在申请号为 200710062936. 7的中国专利申请中也利用盐胁迫下的组培方法筛选甘薯耐盐突变体。孙振 元在申请号为200910300988. 2的中国专利申请中则根据克隆植物的特性，提出了基于生 理整合能力的克隆植物耐盐性评价方法。然而以上方法中，生理指标的评价需进行破坏性取样试验，从而进行判断其盐害 程度，例如植物细胞膜损伤程度。针对目前耐盐品种及材料稀少(例如转耐盐基因的材 料)，或经破坏性取样后无法跟踪检测同一样本的问题，做到无损检测对于节省种质资源， 提高检测精确度非常必要。而利用组培条件下盐胁迫筛选的方法则存在消耗周期较长、过 程复杂的问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的检测方法破坏性取样和检测周期 长的缺陷。( 二 )技术方案针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于SIET的植物耐盐性快速检测方法， 包括以下步骤Si，选取萌发期或苗期的植物根系的样品作为检测对象，将样品置于培养液中利 用非损伤性扫描离子选择电极技术SIET对该样品进行检测，得到样品的K+离子的流向和 流速；S2，一定时间之后，在培养液中加入盐溶液，待培养液中NaCl达到一定终浓度后， 继续检测得到所述K+离子的流向和流速，根据所检测到的流向和流速判断植物在盐胁迫条 件下对所述K+离子的保有能力，进而作为评价植物的耐盐性的依据。其中，在步骤Sl或S2中，检测得到所述K+离子的流向和流速的方法具体为利用 SIET检测样品上两点之间的电压差，将该电压差换算成该两点之间的离子浓度差，然后将 该离子浓度差换算成该两点之间的流向和流速。其中，所述培养液的成分包括0. 5mM KCl和0. ImM CaCl2。其中，在所述SIET中所用的微电极为K+离子选择性玻璃微电极。其中，所检测的指标为瞬时NaCl诱导下的根系K+离子流，NaCl所达到的一定终浓 度为 50-150mM。其中，所述的一定时间为10分钟。其中，利用所述K+选择性微电极校正后得到的斜率将该电压差换算成该两点之间 的离子浓度差。其中，利用Fick第一扩散定律公式Jtl = -D dc/dx将该离子浓度差换算成该两点 之间的流向和流速。其中，所述SIET为非损伤微测系统中的SIET。其中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；所述单子叶植物包括小麦、玉米和 水稻，所述双子叶植物包括番茄和大豆。(三)有益效果本发明的技术方案基于非损伤性扫描离子选择电极技术进行萌发期或苗期植物 根系的K+离子的流向和流速数据检测，以盐胁迫下植物根系对K+的保有能力作为耐盐性评 价的依据，并选择瞬时盐胁迫范围为50-150mMNaCl，实现了对植物耐盐性的快速(从种子 萌发到检测，只需要3-6天)无损检测，在节省品种和材料的同时，还可以实现检测之后的 植物重复利用，消除了因个体差异造成的误差，提高了检测的准确性。
图1本发明实施例的方法流程图；图2示出了利用本发明实施例的方法所做的试验中，在SOmMNaCl诱导下洲元9369和长武134根系K+离子的流速变化；图3示出了利用本发明实施例的方法所做的试验中，SOmMNaCl胁迫对洲元9369和 长武134根系K+离子平均流速的影响。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明的实施例中，利用非损伤性扫描离子选择电极技术检测不同小麦品种的耐 盐性。其流程图如图1所示。1.实验方法材料为小麦，品种为普通高产冬小麦(Triticum aestivum L.)洲元9369 (由莱州 市金海种业提供，简称9369)；以及耐旱品种冬小麦(Triticum aestivum L.)长武134 (由 中科院水利部水土保持研究所提供，简称134)。将冬小麦长武134和洲元9369用3%次氯酸钠消毒15分钟，分别浸种催芽24小 时后，挑选萌发一致的种子，置于铺有单层滤纸的发芽盒中生长，滤纸及培养液每天更换， 培养液为(0. 5mM KCl,0. ImM CaCl2)。在培养箱中培养6天后，用于根系K+离子流检测。K+离子流检测利用非损伤微测系统(BI0-001B，Younger USA Sci. & Tech. Corp.， USA)中的非损伤性扫描离子选择电极技术进行。以扫描离子选择性微电极技术动态的检 测，获取进出样品的K+离子浓度(毫摩尔mM级)、流速及流向(三维运动方向)的信息。K+ 离子选择性微电极前端灌充180 μ m K+离子的液态交换剂(LIX)液柱，后端灌充有15_20mm 左右的电解液柱(IOOmM KC1)，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解 液接触。参比电极为固体电极。幼苗在测量前转移到测试盒中平衡lh，测试液成分为0. 5mMKCl,0. ImM CaCl2，测 量位点为距离根尖IOmm左右的根系成熟区。在距离根表面10 μ m处垂直测量两点之间的 电压差，电极两点移动距离30 μ m。稳定测量IOmin后，加入等体积由测试液配制的160mM 浓度的NaCl溶液，使其终浓度达到80mM后，继续检测60min内K+离子的运动状况。溶液中 K+离子扩散平衡时间约为l-2min，所以这段时间内的数据丢弃。每个处理检测三株苗。利 用K+离子选择性微电极校正后得到的斜率(Nernst slope)将两点之间的电压差换算成两 点之间的离子浓度差。在净离子流的计算过程中，基本上认为根系K+离子流符合圆柱扩散 几何模型。离子浓度差到流速和流向的换算使用Fick第一扩散定律公式Jtl =-D dc/dx 完成。2.实验结果由图2可知，在正常生长条件下，小麦洲元9369根系成熟区K+流速为负值，表明根 系附近K+内流，震荡幅度较大，平均流速为-802pmol. cm-2· s-1 (图3)。长武134根系K+流 速震荡幅度较小(图2)，表明进出根系的K+离子流速较小，平均流速仅为-117pmol. cm—2.
图3)。测试液中加入80mM NaCl后，两个品种小麦的根部K+流速为正值，表明根系表面 K+离子流向转为外排。洲元9369根部K+离子外排流速较大，且稳定维持在3000-4000pmol. cm"2, s—1，平均流速为3533pmol. cm—2, s—1。在NaCl瞬时诱导下，长武134根系K+流向也表现 为外排，同时流速增加，最高流速可达1890pmol. cm_2. s、但随后的3_4分钟内，其流速迅速下降到 600-900pmol. cnT2. (图 2)，平均流速为 776pmol. cnT2. s、仅为洲元 9369 的 1/5。 这表明在NaCl胁迫下，长武134根系的K+外排流速较洲元9369小，其根系对K+保有能力 更强，其耐盐性更强。其中，图3中的“CK”是指无NaCl对照测试液，该无阴影的方框表示 利用含OmM的NaCl浓度的测试液所得到的试验结果。由以上实施例可以看出，本发明的技术方案基于非损伤性扫描离子选择电极技术 进行萌发期或苗期植物根系的K+离子的流向和流速数据检测，以盐胁迫下植物根系对K+的 保有能力作为耐盐性评价的依据，并选择瞬时盐胁迫范围为50-150mMNaCl，实现了对植物 耐盐性的快速(从种子萌发到检测，只需要3-6天)无损检测，在节省品种和材料的同时， 还可以实现检测之后的植物重复利用，消除了因个体差异造成的误差，提高了检测的准确 性。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有 等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
权利要求
一种基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤S1，选取萌发期或苗期的植物根系的样品作为检测对象，将样品置于培养液中利用非损伤性扫描离子选择电极技术SIET对该样品进行检测，得到样品的K+离子的流向和流速；S2，一定时间之后，在培养液中加入盐溶液，待培养液中NaCl达到一定终浓度后，继续检测得到所述K+离子的流向和流速，根据所检测到的流向和流速判断植物在盐胁迫条件下对所述K+离子的保有能力，进而作为评价植物的耐盐性的依据。
2.如权利要求1所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，所检测的 指标为瞬时NaCl诱导下的根系K+离子流，NaCl所达到的一定终浓度为50_150mM。
3.如权利要求1所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，在步骤Sl 或S2中，检测得到所述K+离子的流向和流速的方法具体为利用SIET检测样品上两点之 间的电压差，将该电压差换算成该两点之间的离子浓度差，然后将该离子浓度差换算成该 两点之间的流向和流速。
4.如权利要求1所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，所述培养 液的成分包括0. 5mM KCl和0. ImM CaCl2。
5.如权利要求4所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，在所述 SIET中所用的微电极为K+离子选择性玻璃微电极。
6.如权利要求1所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，所述的一 定时间为10分钟。
7.如权利要求1所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在于，所述SIET 为非损伤微测系统中的SIET。
8.如权利要求1 7之任一项所述的基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，其特征在 于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；所述单子叶植物包括小麦、玉米和水稻，所述 双子叶植物包括番茄和大豆。
全文摘要
本发明涉及一种基于SIET的植物耐盐性快速检测方法，包括步骤选取萌发期或苗期的植物根系的样品作为检测对象，将样品置于培养液中利用非损伤性扫描离子选择电极技术SIET对该样品进行检测，得到样品的K+离子的流向和流速；一定时间之后，在培养液中加入盐溶液，待盐溶液中氯化钠的达到一定终浓度后，继续检测所述K+离子的流向和流速，根据所检测到的流向和流速判断植物在盐胁迫条件下对所述K+离子的保有能力，进而作为评价植物的耐盐性的依据。本发明实现了对植物耐盐性的快速无损检测，在节省品种和材料的同时，还可以实现检测之后的植物重复利用，且消除了因个体差异造成的误差，提高了检测的准确性。
文档编号G01N27/26GK101881747SQ20101020647
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者侯瑞锋, 王成, 王晓冬, 王纪华, 马智宏 申请人:北京农业智能装备技术研究中心