专利名称：人体血浆中洛伐他汀酸及HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法
技术领域：
本发明涉及一种人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法，特别涉及一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。
背景技术：
HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶，抑制HMG-CoA还原酶可以限制胆固醇的合成，达到调节血脂的目的。目前HMG-CoA还原酶抑制剂主要有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等。文献报道的技术方法均为针对单个他汀的定量分析方法，由于他汀类的血浆代谢产物他汀酸类亦具有一定的HMG-CoA还原酶抑制活性，所以定量分析血浆中他汀类药物的含量并不能真实的反应此他汀对HMG-CoA还原酶的抑制活性。本方法通过HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析，可以从总体上评价洛伐他汀对 HMG-CoA还原酶的抑制活性，而不单是洛伐他汀本身，尚包含其他洛伐他汀代谢物等活性成分对HMG-CoA还原酶的抑制作用。目前尚未见定量分析HMG-CoA还原酶抑制剂的方法学报道。
发明内容
本发明目的在于公开一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。本发明目的是通过如下方案实现的本发明定量分析方法具体包括如下步骤A.试剂溶液的配制(1) 200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7. 4，PBS)的配制称取10. 6g K3PO4 · 3H20于烧杯中，加180mL水溶解，用H3PO4调节pH至7. 4，再加入纯水至200mL，摇勻；(2) 200mM EDTA (乙二胺四乙酸)(在 200mM ρΗ7· 4 的 PBS 中)的配制向 200mL ρΗ7· 4,200mM 的 PBS 中加入 162mg K2EDTA · 2H20(乙二胺四乙酸二钾)， 摇勻；(3) IOmM DTT (二硫苏糖醇)(在 2mM EDTA 和 200mM PBS (PH7. 4)中)的配制取 15. 4mg DTT至IOmL容量瓶中，以2mM EDTA定容至刻度；(4) 12mM NADPH(还原型辅酶II)的配制取20mg NADPH · Na4至5mL塑料管中，加入2mL纯水，溶解混勻，于-20°C保存，备用；(5)0. 4mM HMG-CoA 的配制将IOmg HMG-CoA加至25mL容量瓶中，纯水稀释至刻度并混合均勻，每3mLHMG_CoA分装至一只5mL PP试管中，于_20°C冷冻保存；(6) 3. 3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM NADPH中)的配制以IOmM DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至％ig/mL，将该溶液以5 1的比例与12mM NADPH混合；(7) 5N HCl 的配制将5mL HCl倒至玻璃容器中，以7mL水溶解，摇勻；(8)0. IN HCl 的配制取9. OmL HCl至IOOOmL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇勻；(9) 15%甲醇的配制加入75mL甲醇至425mL水中，摇勻；(10)0. 2%氨水的配制取8. OmL 25%氨水至IOOOmL容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇勻；(11) IOmM 甲酸铵(pH = 8. 0)的配制在IOOOmL烧瓶中，将630g甲酸铵用800mL水溶解，以0. 2%氨水调至pH 8.0，转移至IOOOmL容量瓶中并用纯水定容至刻度，摇勻；(12)流动相的配制700mL IOmM, pH = 8. 0的甲酸铵与300mL乙腈混合均勻；(13)稀释液0. 甲酸甲醇溶液的配制移取IOOyL甲酸至IOOmL甲醇中，摇勻；(14)0. 5%甲酸甲醇溶液的配制移取500 μ L甲酸至IOOmL甲醇中，摇勻；(15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS，lmg/mL)精密称取IOmg羟基洛伐他汀酸钠至 IOmL容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20°C下冷冻保存；羟基洛伐他汀酸标准储备液1 (LSS1，10 μ g/mL)的配制取100 μ L LSS至IOmL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20°C下冷冻保存；(16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制以表1的方法配制标准加样溶液，于_20°C下冷冻保存；表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制
权利要求
1. 一种人体血浆中洛伐他汀酸及HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤 A.试剂溶液的配制(1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4，PBS)的配制称取10. 6g K3PO4 · 3H20于烧杯中，加180mL水溶解，用H3PO4调节pH至7. 4，再加入纯水至200mL，摇勻；(2)200mM EDTA (乙二胺四乙酸)(在200mM pH7. 4的PBS中)的配制向 200mL pH7. 4，200mM 的 PBS 中加入 162mg K2EDTA ·2Η20 (乙二胺四乙酸二钾)，摇勻；(3)IOmM DTT ( 二硫苏糖醇)(在 2mM EDTA 和 200mM PBS (PH7. 4)中)的配制取 15. 4mg DTT至IOmL容量瓶中，以2mM EDTA定容至刻度；(4)12mM NADPH(还原型辅酶II)的配制取20mg NADPH · Na4至5mL塑料管中，加入2mL纯水，溶解混勻，于_20°C保存，备用；(5)0.4mM HMG-CoA 的配制将IOmg HMG-CoA加至25mL容量瓶中，纯水稀释至刻度并混合均勻，每3mLHMG_CoA分装至一只5mL PP试管中，于_20°C冷冻保存；(6)3. :3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM NADPH中)的配制以IOmM DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至％ig/mL，将该溶液以5 1的比例与 12mM NADPH 混合；(7)5N HCl的配制将5mL HCl倒至玻璃容器中，以7mL水溶解，摇勻；(8)0.IN HCl 的配制取9. OmL HCl至IOOOmL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇勻；(9)15%甲醇的配制加入75mL甲醇至425mL水中，摇勻；(10)0.2%氨水的配制取8. OmL 25%氨水至IOOOmL容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇勻；(11)IOmM甲酸铵(pH = 8. 0)的配制在IOOOmL烧瓶中，将630g甲酸铵用800mL水溶解，以0. 2%氨水调至pH 8.0，转移至 IOOOmL容量瓶中并用纯水定容至刻度，摇勻；(12)流动相的配制700mL IOmM, pH = 8. 0的甲酸铵与300mL乙腈混合均勻；(13)稀释液0.甲酸甲醇溶液的配制移取IOOyL甲酸至IOOmL甲醇中，摇勻；(14)0.5%甲酸甲醇溶液的配制移取500 μ L甲酸至IOOmL甲醇中，摇勻；(15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS，lmg/mL)精密称取IOmg羟基洛伐他汀酸钠至IOmL 容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20°C下冷冻保存；羟基洛伐他汀酸标准储备液1 (LSS1，10 μ g/mL)的配制取100 μ L LSS至IOmL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20°C下冷冻保存；(16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制以表1的方法配制标准加样溶液，于_20°C下冷冻保存； 表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制
全文摘要
本发明公开了一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。经过方法适用性实验验证，用本方法在测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性可满足方法学要求，可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。
文档编号G01N30/88GK102384955SQ20101027053
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者段震文, 郭树仁 申请人:北京北大维信生物科技有限公司