专利名称：一种测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法
技术领域：
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法。
背景技术：
麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一种新型的抗代谢类免疫抑制剂，在体内能迅速代谢为MPA，临床广泛应用于器官移植后的抗排斥治疗。MMF是麦考酚酸(mycophenolic acid，MPA)的2-乙基酯前体药物，可显著提高MPA的体内生物利用度。据报道，MPA的蛋白结合率为97％-99％，药动学个体差异大，且药物动力学和抗免疫抑制效果和药物不良反应有相关关系，因此开展MPA治疗药物监测有一定的临床意义。
目前国内外测定MPA血药浓度的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(EMIT)。EMIT法所使用的抗体与MPA代谢物有交叉反应，因此特异性不高，测定结果往往偏高。HPLC法测定MPA总浓度采用的方法有HPLC-紫外检测法和HPLC-荧光检测法，MPA游离浓度的测定采用HPLC-质谱检测法和HPLC-紫外检测法等，上述方法存在种种弊端如操作繁琐费时，效率低，测定周期长，所需仪器设备或试剂价格昂贵，分析成本高，不适合MPA的常规治疗药物浓度监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、灵敏测定人血浆中麦考酚酸(MPA)的总浓度和游离浓度的方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便，快速，灵敏度高，血浆用量少，成本低等优点，适合MPA的常规治疗药物浓度监测。
本发明方法将待测样品经过预处理后，利用MPA在碱性条件下，其酚羟基失去质子表现出较强的荧光吸收的特性，采用乙腈0.04mol·L-1甘氨酸缓冲液pH 9.2(20∶80，V/V)为流动相，荧光检测。本方法可使MPA的检测灵敏度明显提高，可对MPA的游离浓度进行测定。
本方法可用于血浆、血清中MPA的总浓度和游离浓度的定量测定。其中，MPA总浓度的测定定量分取血浆或血清样品，加入定量的蛋白沉淀剂混匀，离心，取上清液直接进样。经碱性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测。
MPA游离浓度的测定定量分取血浆或血清样品，用超滤法分离出超滤液，取超滤液直接进样。经碱性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测。
上述测定MPA总浓度和游离浓度的方法中，采用通用型的液相色谱柱，其填料为辛烷基键合相硅胶；高效液相系统采用通用型的荧光检测器以及高压泵；流动相采用碱性流动相，等度洗脱；所述的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或两者混合物。
本发明方法快速准确，灵敏度高，操作简便，成本低，适合临床常规监测。具有如下优点(1)时间短，测定MPA总浓度和游离浓度的整个色谱分析过程分别为6min和4min；(2)操作简便，采用蛋白沉淀法进行样品预处理，操作简便，成本低；(3)灵敏度高，采用碱性流动相明显提高了MPA的灵敏度，总和游离MPA的最低检出量分别为80pg和50pg；(4)总和游离MPA的线性范围分别为0.05～40mg·L-1和5～1000μg·L-1，线性相关系数良好，方法回收率大于91％，RSD小于10％。
图1是麦考酚酸色谱图，其中，A空白血浆，B空白血浆+标准品，C血浆供试品，1麦考酚酸，2萘普生(I.S.)。
图2是游离MPA HPLC色谱图，其中，A’空白血浆超滤液，B’9g·L-1氯化钠液(pH 7.4)+标准品，C’血浆供试品。
具体实施例方式
实施例1MPA总浓度的测定色谱条件HPLC系统LC-10AD泵、RF-10AXL荧光检测器、SIL-10A自动进样器、Class-LC10色谱工作站(Version 1.63)；色谱柱Kromasil C8(150mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相乙腈0.04mol·L-1甘氨酸缓冲液，pH 9.2(20∶80，V/V)；流速1.0mL·min-1；荧光激发波长342nm，发射波长425nm；进样量20μL。
血浆样品预处理精密吸取100μL血浆置1.5mL eppendorf管中，加100μg·mL-1萘普生甲醇工作液300μL，涡旋振荡提取30s，离心(10000×g，4℃)10min，取上清液20μL进样。内标法以峰面积定量。
色谱图空白血浆、加样血浆的荧光色谱图见图1。结果表明，内标萘普生和MPA的典型色谱保留时间分别为3.11min和4.89min。血浆内源性杂质对样品的测定无干扰，两者峰形良好，分离完全。整个色谱分析过程时间为6min。
线性试验分别精密吸取1000，100，10mg·L-1MPA标准工作液和甲醇200μL，用空白血浆稀释定容至5mL，配制成含MPA0.05，0.2，1.0，10，25，40mg·L-1的系列血样，各取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作。以MPA与内标峰面积比(A)和MPA的浓度(C)作加权(1/C)线性回归，得标准曲线回归方程为A＝0.1307C-2.848×10-3r＝0.9999，线性范围为0.05～40mg·L-1。MPA的最低检测限(LOD，信噪比＞3)为8μg·L-1。
准确度和精密度分别精密吸取1000mg·L-1，5mg·L-1MPA标准工作液和甲醇200μL，用空白血浆稀释定容至5mL，配制成含MPA 0.05，0.1，15，30mg·L-1的系列血样，各取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)×100％即为回收率。表1是血浆中麦考酚酸总浓度的日内、日间精密度和方法回收率。
实施例2MPA游离药物浓度的测定色谱条件HPLC系统LC-10AD泵、RF-10AXL荧光检测器、SIL-10A自动进样器、Class-LC10色谱工作站(Version 1.63)；色谱柱Kromasil C8(150mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相乙腈0.04mol·L-1甘氨酸缓冲液，pH 9.2(20∶80，V/V)；流速1.0mL·min-1；荧光激发波长342nm，发射波长425nm；进样量20μL。
血浆样品预处理精密吸取血浆500μL，置于带盖的超滤管中，固定角度离心(12,000×g，25℃)40min，得到超滤液约200μL，取20μL直接进样。
色谱图上述色谱条件下测得的空白血浆、标准品和患者血样的荧光色谱图见图2。MPA的典型色谱保留时间约为3.11min。血浆内源性杂质对样品的测定无干扰，峰形对称，分离完全。整个色谱分析过程时间为4min。另外，环孢素A，雷帕霉素，甲基强的松龙，强的松，安洛地平等常用合并用药对MPA的测定没有干扰。
线性范围据文献报道，由于标准曲线的配制需要大量的血浆超滤液，9g·L-1氯化钠液(pH 7.4)可替代血浆超滤液进行配制。因此于9g·L-1氯化钠液(pH 7.4)中加入不同量的MPA标准工作液，使其浓度分别为5，10，100，400，700，1000μg·L-1标准样品，直接进样进行测定。以MPA峰面积(A)和其浓度(C)作加权(1/C)线性回归，得标准曲线回归方程为A＝7568.5 C-1053.5，相关系数r＝0.9991。方法的线性范围为5～1000μg·L-1。血浆中MPA的最低定量浓度为5μg·L-1准确度和精密度于9g·L-1氯化钠液(pH 7.4)中加入不同量的MPA标准工作液，使其浓度分别为5，8，500，800μg·L-1的系列质控样品，直接进样进行测定。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)×100％即为回收率。表2血浆中麦考酚酸游离浓度的批内、批间精密度和方法回收率。
表1日内精密度(n＝6) 日间精密度(n＝6)理论浓度方法回收率实测值RSD 实测值 RSDmg·L-1％mg·L-1％ mg·L-1％0.050.054±0.002 3.48 0.055±0.0024.16 110.940.1 0.102±0.066 6.60 0.998±0.0111.12 99.7815 14.67±0.27 3.14 14.76±0.71 4.82 98.4230 32.01±0.48 1.51 31.71±1.13 3.56 105.71表2日内精密度(n＝6) 日间精密度(n＝6)理论浓度方法回收率实测值RSD 实测值 RSDmg·L-1％mg·L-1％ mg·L-1％5 4.772±0.237 4.98 4.911±0.4078.28 98.238 7.465±0.475 6.37 7.571±0.4455.87 94.64400 388.9±5.616 1.44 367.8±23.086.28 91.96800 871.8±18.59 2.13 823.1±54.766.65 102.9
权利要求
1.一种测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，经碱性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测，包括以下步骤1)样品预处理测定总浓度取待测样品，加入甲醇、乙腈或两者混合物，进行蛋白沉淀；测定游离浓度取待测样品，置于超滤管，固定角度离心；2)样品分离与分析采用通用型的液相色谱柱，其填料为辛烷基键合相硅胶，高效液相系统采用通用型的荧光检测器以及高压泵，流动相采用碱性流动相，等度洗脱，采用荧光检测器测定MPA的峰面积，用标准曲线方程换算成MPA的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法，其特征是所述的步骤1)，其中超滤管为带盖超滤管，固定角度离心为(12,000×g，25℃)40min。
3.根据权利要求1所述的测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法，其特征是所述的步骤2)，其中色谱条件是，色谱柱采用Kromasil C8(150mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相采用乙腈0.04mol·L-1甘氨酸缓冲液，pH9.2(20∶80，V/V)；流速1.0mL·min-1。
全文摘要
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中麦考酚酸总浓度和游离浓度的方法。本发明方法对待测样品经预处理后，利用MPA在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，经碱性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测。该法使MPA的灵敏度提高两个数量级，可对游离MPA的浓度进行测定。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于MPA临床常规血药浓度的监测。
文档编号G01N30/00GK1621835SQ20041009313
公开日2005年6月1日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者郁韵秋, 焦正, 沈杰 申请人:复旦大学, 复旦大学附属华山医院