专利名称：动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)的分析方法
技术领域：
本发明涉及动物血液复杂基质中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)的分析方法。 该方法利用同位素标记物作为内标物，采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)对动 物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。
背景技术：
吸烟与健康问题日益引起人们极大关注，烟叶和卷烟烟气中的一些有害成分， 特别是具有强致癌性的烟草特有N-亚硝胺(TSNAs),更加引起各国科学家们的极大 关注[刘万峰，王应元.烟草中烟草特有亚硝胺的研究进展.中国烟草科学，2002，
(2) 11-15]。研究TSNAs在动物体内的代谢产物和代谢过程，开展TSNAs的代谢历 程研究，可为TSNAs的毒性抑制研究提供依据，为缓解吸烟与健康矛盾提供技术支持。烟草中主要存在四种形式的N-亚硝胺挥发性N-亚硝胺、非挥发性N-亚硝 胺、烟草特有N-亚硝胺和亚硝化的氨基酸。卷烟烟气中已发现的亚硝胺达35种，而烟草 特有N-亚硝胺的研究最早开始于20世纪60年代初期且最受关注，这是因为部分TSNAs 具有致癌活性，它们对吸烟者和被动吸烟者的健康可能有不利影响。目前已经鉴定出8 种TSNAs，其中N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、N，-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝 基假木贼碱(NAB)和4-(N-甲基亚硝基)-l-(3-吡啶基)-l-丁酮(NNK)在烟草中的 含量比其它几种TSNAs要高；现已证明NNN和NNK是TSNAs中致癌性最强者，NNK 及其主要代谢物4- (N-甲基-N-亚硝基氨基)-1_(3-吡啶基)-丁醇(NNAL)是目前 为止烟气中发现的唯一胰腺癌致癌物。对TSNAs的检测通常使用薄层色谱法、极谱法、紫外-可见分光光度 法、液相色谱法和气相一热能分析检测法等[J.D. Adams, K.D. Brunnemann, D. Hoffmann. Chemical studies on tobacco smoke. LXXV. Rapid method for the analysis of tobacco-specific 7V-nitrosamines by gas-liquid chromatography with a thermal energy analyzer. J. Chromatogr. 1983, 256:347.]。近年来液相色谱一质谱联用(HPLOMSn)方法[D. Kavvdias, G. Scherer, J. Shepperd, F. Cheung, G. Errington, Μ. McEwan. Dermination of tobacco-specific N-nitrosamines in urine of smokers and nonsmokers. The CORESTA Congress, Shanghai, China, 2008]开始应用于烟草和烟气中TSNAs及其代谢物的分离分析。由于复 杂生物基质样品中TSNAs及其代谢物含量水平仅为ng级、甚至更低，因此应用液相色谱 串联质谱法(HPLC-MSn)进行测定具有很大的优势。但是HPLC-MS方法也存在一定 缺陷，如在定量分析过程中由于内标物与待测物不一致，导致在样品前处理时待测物与 内标物存在歧视现象，使得测定结果存在偏差，而选用同位素标记物作为内标物可以有 效消除这种歧视现象，提高定量分析的准确度。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题，而专门开发的一种动物血液 复杂基质中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)的分析方法，本方法针对上述不足之处，同时还 可以大幅度减少样品收集后进行繁琐地固相萃取纯化、溶剂浓缩等过程，可以直接并准确 的测定动物血液复杂基质中TSNAs的含量，该方法操作简单，灵敏度高，结果可靠。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的动物血液样品中痕量烟草特有 N-亚硝胺的分析方法，将动物血液样品放入加有乙二胺四乙酸二钾(EDTA_k2)饱和 水溶液的离心管内，IOOOOrpm离心，取上层血浆加入NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、 NAB_d4、NNAL_d3混合内标溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用 LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。该方法具体包括以下步骤
a、动物血液样品收集；
b、混合内标溶液配制以同位素标记物NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、 NNAL-d3作为内标物，配制浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。具体配制方式如下 准确称取 NNN_d4、NNK-d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL_d3 各 10 mg,分别置于 5 个 IOOOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，得浓度为10 pg/mL的NNN_d4、 NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL_d3的内标储备溶液，各移取5 mL内标储备溶液置 于一支IOOOmL容量瓶中，用50/50 (体积比)乙腈/水溶液稀释至刻度，摇勻，配制得 浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。c、 混合标准溶液配制分别称取NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL,配 制具有浓度梯度的NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液，并各加入Iml 浓度为50ng/ml的混合内标溶液。具有浓度梯度的NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL 系列混合标准溶液具体配制方式如下准确称取NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL各 10 mg,分别置于5个IOOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，得浓度为100 pg/mL 的 NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL 的标准储备溶液。移取 10 mL 的 NNN、 NNK、NAT、NAB、NNAL标准储备溶液，均置于同一支100 mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，摇勻，得一级混合标准溶液；移取ImL—级混合标准溶液，置于另一 IOOmL 容量瓶中，用50/50 (体积比)乙腈/水溶液稀释至刻度，摇勻，得二级混合标准溶液； 取0.01、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0 和 25.0 mL二级混合标准溶液，分别置于 100 mL容量瓶中，各加入ImL 二级混合内标溶液，用50/50 (体积比)乙腈/水溶液稀释 至刻度，摇勻，得到浓度均为 0.125、0.250、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0 和 25.0 ng/mL 的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液。d、 标准曲线绘制将 TSNAs 系列(NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL)
标准溶液按由低到高浓度顺序进行HPLC-MS/MS分析，并以各TSNAs与其内标的峰面 积比(Y)对其相应的浓度(X，ng/mL)进行线性回归分析，得到各TSNAs的工作曲 线回归方程和相关系数；
e、样品前处理将动物血液样品放入加有O.lmL乙二胺四乙酸二钾
(EDTA-k2)饱和水溶液的1.5 mL离心管内，IOOOOrpm离心，取上层血浆0.5 mL加 入 0.5 mL 浓度为 50ng/ml 的混合内标(NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL-d3)溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，进行HPLOMS/MS分析； f、数据处理和分析，对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示
TSNAs在动物体内的代谢规律。本发明依据的测试原理在于将动物血液样品直接进行处理，然后加入同位 素标记物内标溶液，进行HPLC-MS/MS分析，测定动物血液复杂基质样品中烟草特有 N-亚硝胺(TSNAs)及其代谢物的含量，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。这一实验设计能准确测定动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺 (TSNAs)及其代谢物的含量，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的
特点，开创了一种新的用于动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)及其 代谢物测定的方法。
图1为实施例1中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。图2为实施例1的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。图3为实施例1的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。图4为实施例1的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。图5为实施例1的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。图6为实施例2中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。图7为实施例2的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。图8为实施例2的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。
图9为实施例2的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。图10为实施例2的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。图11为实施例3中的动物血液中NNN的浓度随时间变化趋势图。图12为实施例3的动物血液中NNK的浓度随时间变化趋势图。图13为实施例3的动物血液中NAT的浓度随时间变化趋势图。图14为实施例3的动物血液中NAB的浓度随时间变化趋势图。图15为实施例3的动物血液中NNAL的浓度随时间变化趋势图。
具体实施例方式本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。实施例1
购买5只雄性日本大耳朵白兔，要求体重3-4千克，健康无病，灌胃给药前禁食12 小时，一次给药量NNK 1.5 mg，NNN 1.02 mg，NAT 1.05 mg，NAB 1.26 mg。给药后 开始计时，采用耳缘静脉的采血方式，每10 min采血样lmL，连续采血10次，血液样品 放入加有0.1 mL乙二胺四乙酸二钾(EDTA_k2)饱和水溶液的1.5 mL离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆0.5mL加入0.5mL Ing/mL的内标乙腈溶液，静置30 min后，过 滤，LC-MS/MS分析检测。色谱条件色谱柱Agilent Extend-C 18 柱(100X4.6mm i.d., 1.8 μ m，美国)。 柱温50 °C ；流动相A:水(含0.1%甲酸铵，质量分数)，B:乙腈(含 0.1%甲酸，体积分数)；流速0.2mL/min;梯度洗脱条件见表1 ；进样量10 μ ；柱 平衡时间为6min。
权利要求
1.一种动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于将动物血 液样品放入加有乙二胺四乙酸二钾(EDTA_k2)饱和水溶液的离心管内，IOOOOrpm离 心，取上层血浆加入NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL_d3混合内标溶 液，静置30min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有 N-亚硝胺的含量。
2.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特 征在于该方法具体包括以下步骤动物血液样品收集；混合内标溶液配制以同位素标记物NNN_d4、NNK-d4、NAT_d4、NAB_d4、 NNAL-d3作为内标物，配制浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液；混合标准溶液配制分别称取NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL,配制具有浓度梯 度的NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液，并各加入Iml浓度为50ng/ ml的混合内标溶液；标准曲线绘制将TSNAs系列(NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL)标准溶液按 由低到高浓度顺序进行HPLC-MS/MS分析，并以各TSNAs与其内标的峰面积比(Y) 对其相应的浓度(X，ng/mL)进行线性回归分析，得到各TSNAs的工作曲线回归方程 和相关系数；样品前处理将动物血液样品放入加有0.1 mL乙二胺四乙酸二钾(EDTA_k2)饱和 水溶液的1.5 mL离心管内，IOOOOrpm离心，取上层血浆0.5 mL加入0.5 mL浓度为50ng/ ml 的混合内标(NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL_d3)溶液，静置 30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，进行HPLC-MS/MS分析；数据处理和分析，对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在 动物体内的代谢规律。
3.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法， 其特征在于混合内标溶液配制方式如下准确称取NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、 NAB_d4、NNAL-d3各10 mg,分别置于5个1000 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻 度，摇勻，得浓度为 10 |_ig/mL 的 NNN_d4、NNK_d4、NAT_d4、NAB_d4、NNAL_d3 的 内标储备溶液，各移取5 mL内标储备溶液置于一支IOOOmL容量瓶中，用50/50 (体积 比)乙腈/水溶液稀释至刻度，摇勻，配制得浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。
4.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特 征在于具有浓度梯度的NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液配制方式 如下准确称取NNN，NNK, NAT、NAB、NNAL各10 mg，分别置于5个IOOmL容 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，得浓度为100 pg/mL的NNN、NNK, NAT、 NAB、NNAL的标准储备溶液；移取10 mL的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL标准 储备溶液，均置于同一支IOOmL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，得一级混合标准 溶液；移取1 mL —级混合标准溶液，置于另一 100 mL容量瓶中，用50/50 (体积比) 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇勻，得二级混合标准溶液；取0.01、0.10、0.50、1.00、 2.00、5.00、10.0和25.0 mL 二级混合标准溶液，分别置于100 mL容量瓶中，各加入1 mL 二级混合内标溶液，用50/50 (体积比)乙腈/水溶液稀释至刻度，摇勻，得到浓度均为 0.125、0.250、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0 和 25.0 ng/mL 的 NNN、NNK、NAT、 NAB、NNAL系列混合标准溶液。
全文摘要
一种动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于将动物血液样品放入加有EDTA-k2饱和水溶液的离心管内，10000rpm离心，取上层血浆加入NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3混合内标溶液，静置30min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。本发明的优点在于能准确测定动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)及其代谢物的含量，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于动物血液复杂基质样品中烟草特有N-亚硝胺(TSNAs)及其代谢物测定的方法。
文档编号G01N30/84GK102012409SQ20101053136
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者刘惠民, 卢斌斌, 宗永立, 张建勋, 张晓兵, 王兆宇, 王昇 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院