专利名称：氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及氨(氨离子)诊断/测定方法及其试剂盒。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3,用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8% 13% ’离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的pH发生变化进行测定，该方法的CV为 3. 5% 4. 8%，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅查出87105593. 7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种氨(氨离子)的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用间接酶循环扩增法(Indirect Enzymatic RecyclingMethod)、 Bl 比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与 Bl ( 禹)联法 (CoupleReaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定氨(氨离子)的方法。本发明氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶的系列催化反应完成氨+2水+6高铁细胞色素c亚硝酸还原酶亚硝酸+6亚铁细胞色素c亚硝酸+水+2氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶硝酸+2还原型铁氧还蛋白硝酸+还原型辅酶硝酸还原酶亚硝酸+水+辅酶本发明的方法利用亚硝酸还原酶(nitrite reductase ；EC 1. 7. 2. 2)酶(偶)联铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(ferredoxin-nitrate reductase ；EC 1. 7. 7. 2)、硝酸还原酶 (nitrate reductase ；EC 1. 7. 1. 1 ；EC 1. 7. 1. 2 ；EC 1. 7. 99. 4)酶促反应连续监测法。亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶作为作用酶，功能为将氨酶解产生亚硝酸，再成硝酸。 硝酸还原酶作为循环酶它的酶促作用使硝酸再次变回亚硝酸，使亚硝酸不断地被重复循环利用。硝酸还原酶又作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶 (在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算氨(氨离子)的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种氨(氨离子)的测定方法。该氨(氨离子)测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
氨的含量
ΔΑ (样品)-ΔΑ(空白)
氨(氨离子)含量=-χ标准浓度(μπιοΙ/L)
ΔΑ (标准)-ΔΑ(空白)式中Δ A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；Δ A(空白)表示步骤Ε)得到的空白样品的吸光度变化；Δ A (标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。根据本发明，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的PH基本保持稳定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果该pH高于9.0或pH低于6. 0，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。在本发明中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或 “PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本发明，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。在本发明中，所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。根据一种本发明的优选实施方式，本发明使用全自动生化分析仪测定氨(氨离子)时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为速率法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(氨离子)样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间4分钟。根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试剂由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白组成的试剂1 ；由所述的缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的试剂2 ；其中还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氧化型铁氧还蛋白在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白组成的试剂1 ；由所述的缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的试剂2 ；由所述的缓冲液、稳定剂与亚硝酸还原酶组成的试剂3 ；其中还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氧化型铁氧还蛋白在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。在本发明氨(氨离子)测定方法中使用的测定仪器可以是紫外/可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。本发明还涉及氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。该氨(氨离子)诊断/测定试剂盒由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂还原型辅酶ι高铁细胞色素C氧化型铁氧还蛋白组成如下的试剂2 缓冲液稳定剂铁氧还蛋白亚硝酸还原酶硝酸还原酶组成如下的试剂3 缓冲液稳定剂亚硝酸还原酶
0. 25mmol/L 5mmol/L 5mmol/L ；
1OOmmo1/L 500mmol/L 18000U/L 12000U/L ；
IOOmmo1/L 500mmol/L 16000U/L。根据另一种本发明的优选实施方式，在本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、 咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、丙二醇、甘油、双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。在本发明中，无论是单剂试剂、双剂试剂或三剂试剂，在本发明测定氨(氨离子) 的方法中，所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。使用本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒时，可以使用紫外/可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。在采用本发明方法测定氨(氨离子)时，根据实验要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精密度(CV)
权利要求
1.一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)浓度测定方法， 其测定的技术原理是根据下述亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶的系列催化反应完成氨+2水+6高铁细胞色素c亚硝酸还原酶亚硝酸+6亚铁细胞色素c 亚硝酸+水+2氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶硝酸+2还原型铁氧还蛋白硝酸+还原型辅酶硝酸还原酶亚硝酸+水+辅酶
2.一种氨(氨离子)的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1.1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0· 1-0. 35mmol/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量氨含量=式中ΔΑ(样品)表示步骤2. 3)得到的待测样品的吸光度变化； ΔΑ(空白)表示步骤2. 5)得到的空白溶液的吸光度变化； 八八(标准)表示步骤2. 4)标准样品的吸光度变化。
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待 ΔΑ (样品)-ΔΑ (空白)-χ标准浓度(μπιοΙ/L )ΔΑ(标准)-ΔΑ(空白)测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为速率法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1 分钟，检测时间4分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素C、氧化型铁氧还蛋白、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的；5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的；其中还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氧化型铁氧还蛋白在试剂1或试剂2中的位置是不限定的；5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素C与氧化型铁氧还蛋白组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的；试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与亚硝酸还原酶组成的；其中还原型辅酶、亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氧化型铁氧还蛋白在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
6.一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于6. 1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0.1-0. 35mmol/L亚硝酸还原酶1000-80000U/L铁氧还蛋白亚硝酸还原酶1000-80000U/L硝酸还原酶1000-80000U/L高铁细胞色素Cl-100mmol/L氧化型铁氧还蛋白l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L ；.6. 2根据权利要求6. 1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液稳定剂还原型辅酶高铁细胞色素C 氧化型铁氧还蛋白组成如下的试剂2 缓冲液稳定剂亚硝酸还原酶铁氧还蛋白亚硝酸还原酶硝酸还原酶.6. 3根据权利要求6. 1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液稳定剂还原型辅酶高铁细胞色素C 氧化型铁氧还蛋白组成如下的试剂2 缓冲液稳定剂铁氧还蛋白亚硝酸还原酶硝酸还原酶组成如下的试剂3 缓冲液稳定剂亚硝酸还原酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据亚硝酸还原酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、硝酸还原酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。
文档编号G01N33/52GK102539727SQ20101058428
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司