专利名称：研究dna与蛋白质相互作用的方法
技术领域：
本发明涉及DNA与蛋白质的相互作用，具体地说是一种研究DNA与蛋白质相互作用的方法，属于分子生物学方法学领域。
背景技术：
在细胞的生命活动过程中，DNA的复制与重组、RNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等等，都是涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。因此， 长期以来人们就一直关注DNA结合蛋白的研究。蛋白质与DNA的相互作用也是分子生物学研究的中心问题之一。核酸-蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用，二者的协作是各种生命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来，是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容。常规的研究DNA与蛋白质相互作用的方法主要包括凝胶阻滞试验 (gelretardation assay)、DNaseI 足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)、甲基化干扰试验、酵母单杂交技术和噬菌体展示技术等等。凝胶阻滞试验(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术之一。在凝胶实验中，传统的方法是用放射性同位素或其他生物素标记待检测的DNA片段(又称探针DNA probe)然后与细胞蛋白质提取物一道温育，于是便形成了 DNA蛋白质复合物。将其移入非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，控制蛋白质与探针保持结合状态，电泳分离，最后借助放射性自显影技术(或其它适当技术)显现DNA条带位置。然而， 此方法制胶过程繁琐，电泳时间长。DNaseI 足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)是一种测定DNA结合蛋白在DNA 上的准确结合位点的技术。该方法需对DNA进行单链标记，操作复杂，需要专门的检测手段。甲基化干扰试验根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。其操作结束后也需要做凝胶阻滞试验，因而操作比较繁琐。酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究，但其基本操作需要三个方面的过程，涉及分子生物学的大量方法，需要酵母菌作为载体。噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择相结合的技术，核酸适体技术首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有IO14 IO15个单链寡核苷酸序列的随机文库，体内足迹试验原理与甲基化试验基本相同，其实质是体外甲基化试验的变种，免疫沉淀技术操作步骤更加繁琐，因此，以上常用的研究DNA与蛋白质相互作用的方法都有一定的局限性，不能全面反映DNA与蛋白质相互作用的真实情况。
发明内容
为了解决上述问题，本发明设计了一种研究DNA与蛋白质相互作用的方法，该方
3法是基于毛细管电泳的原理来进行的，具有筛分介质浓度调节简便、荧光标记方法简单、分离效果好、电泳过程试剂消耗量小、电泳时间短(30min内完成)、检测效率高、分离效果好等优点，具有一定的实际应用价值。本发明的技术方案为，研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括以下步骤(1)毛细管柱的修饰，取适当长度的石英毛细管，用NaOH清洗，再分别用水、甲醇、空气冲洗；然后用 MAPS-甲醇冲洗毛细管，20 28V反应8 IMi后，用甲醇、水、空气各冲洗毛细管，再用丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管，20 28V反应3 证后，用水冲洗，即可使用；以上反应均在 20 下进行；O)DNA和蛋白质的共同孵育及标记，取DNA Marker (pUC19 DNA/Msp I DNA Marker)和宽分子量蛋白 Marker (Protein Molecular Weight Marker D532S)，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育结束后加核酸染料STOR Green I标记，取标记混合物进行CE-LIF检测；以上反应在25 35°C进行；(3)毛细管电泳检测，冲洗毛细管，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质溶液，进行毛细管电泳，CE-LIF检测，IOs负极电动进样，数据处理软件采集数据；CE-LIF检测在15°C进行；a)选择聚氧化乙烯浓度，重量体积比浓度w/v分别为0.05%、0. 1%、0. 5%、 1. 5%,2. 5%,3. 0%六个浓度梯度；b)选择温度，温度选择为15°C和20°C两个温度梯度；c)选择电压，选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压梯度；d)选择 pH 值，选择为 6. 0,7. 0,7. 5,8. 3,9. 0 和 10. 0 六个 pH 值梯度；(4)确定分离条件通过优化得到CE用于DNA-蛋白Marker相互作用的研究时的分离条件ΡΕ0的浓度为0. 1%、电泳温度为15°C、分离电压为15kV和缓冲液pH值9.0。本发明的研究研究DNA与蛋白质相互作用的方法是用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光检测(NGS-CE-LIF)DNA-蛋白质相互作用，以核酸染料STOR GreenI为荧光标记物，氩离子激光器(λ ex = 488nm, λ em = 520nm)检测，研究DNA-蛋白质的相互作用。运用CE-LIF分别检测DNA Marker、蛋白Marker和DNA-蛋白质共孵育后产物，毛细管电泳图分别见图1、图2和图3。本发明的优点在于1、筛分介质浓度调节简便，可选择筛分介质聚环氧化乙烷(PEO)重量体积比浓度 w/v为0. 05% 3. 0%六个浓度梯度；2、荧光标记方法简单，直接将核酸染料与DNA共同孵育进行标记，孵育温度为 25 35 ；3、电泳过程试剂消耗量小，可nL级进样；4、电泳时间短，可在30min内完成；5、分离效果好，所有被分离物均可得到基线分离；6、检测效率高，具有一定的实际应用价值。
图1为本发明实施例的CE-LIF检测DNA Marker电泳图。图2为本发明实施例的CE-LIF检测蛋白Marker电泳图。图3为本发明实施例的CE-LIF检测DNA和蛋白质共同作用的电泳图。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括以下步骤1.毛细管柱的修饰为减小电泳过程中电渗流(EOF)对分离的影响，对毛细管内壁进行修饰，取适当长度的石英毛细管(约3 4次使用)，用0. 2mol/L氢氧化钠(NaOH)清洗lh，再分别用水、 甲醇、空气各冲洗15min ；然后用MAPS-甲醇1 1 (ν/ν)冲洗毛细管lh，室温反应过夜；第二天先分别用甲醇、水、空气各冲洗毛细管15min，再用3. 4% (w/v)丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管Ih，室温反应4h后，用水冲洗20min，即可使用。所用到的试剂及仪器主要有NaOH，甲醇，、-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷 (MAPS) (A Johson Matthey公司)，丙烯酰胺，石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。以上反应均在室温下进行。2. DNA和蛋白质的共同孵育及标记取10 μ L pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) DNA Marker 禾口 1 μ L Protein Molecularffeight Marker (Broad) D532S，加入 14 μ L IXTBE 30°C共同孵育 4h，孵育结束后加入5 μ L IOXSYBR Green I标记30min，取标记混合物进行CE检测。所用到的试剂及仪器主要有DNAMarker (pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) DNAMarker(26bp ；34bp ；34bp ；67bp ；110，lllbp ；147bp ； 190bp ；242bp ；331bp ；404bp ； 489bp ;501bp))(上海生物工程技术有限公司)；宽分子量蛋白Marker (ftOtein Molecular Weight Marker D532S(6.5 200KDa，6· 5、14. 3、20· 1、29、44· 287、66·409、97·2、116、 200KDa)) (TaKaRa) ； 1 X TBE (三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，硼酸 (Boric acid)(北京鼎国生物技术有限责任公司)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(北京鼎国生物技术有限责任公司))；核酸染料STOR Green 1(厦门百维信公司)。PHS-3C型酸度计 (上海雷磁仪器厂)；AE240型电子天平(MettlerJ^i)；磁力搅拌器(深圳天南海北实业有限公司)。反应在30°C进行。3.毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)检测涂层毛细管柱长37cmX 75 μ m，有效长度27cm，使用前以水和1ΧΤΒΕ(ρΗ9. 0)分别冲洗5min，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide), PE0)溶液，以IXTBE (pH9.0)做缓冲液进行毛细管电泳，CE-LIF检测(λ ex = 488nm, λ em = 520nm)，10s负极电动进样，P/ACESystem station数据处理软件采集数据。所用到的试剂及仪器主要有P/ACE System 5000型毛细管电泳仪、P/ACESystem 5000 station 数据处理软件、P/ACE Systemlaser module 488nm 激光发射器(美国 Beckman)；聚氧化乙烯(ΡΕ0, Mr = 300000) (A Johson Matthey 公司)
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CE-LIF 检测在 15 °C 进行。3. IPEO浓度将PEO固体溶于TBE中，配制成浓度从0. 05 % 3. 0 % (w/v)的筛分介质，经0. 22 μ m的水性滤膜过滤和超声脱气后备用。在分离电压15kV、温度15°C、pH值为 9. 0 时，考察不同浓度 ΡΕ0(0· 05%,0. 1%,0. 5%U. 5%,2. 5%,3. 0% )对 DNA-Protein Marker的分离效果。选择0. 为PEO最佳分离浓度。3. 2温度实验中当温度选择为15°C和20°C，研究二者的相互作用本质，但温度继续升高时，电泳峰数目减少，分离时间缩短。且温度过高会导致较大电流波动，最终确定分离温度15V (仪器控制最低值)为实验的适宜温度。选择15°C为最佳分离温度。3. 3电压电压主要影响分离的效率及效果，实验选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压进行。综合考虑迁移时间以及分离效果，选择15kV为最佳分离电压。3. 4pH值缓冲液的pH值是CE分离成败的主要因素，在研究DNA-蛋白质相互作用的实际应用过程中，对影响分离效果的PH值进行了优化选择。pH选择为6. 0,7. 0,7. 5、
8.3、9. 0和10. 0时，分别进行DNA-蛋白质相互作用混合物的分离，当pH选择为9. 0时样品得到基线分离，故选择分离条件较好的缓冲液的PH值为9. 0。3. 5最佳分离条件通过优化得到CE用于DNA-Protein Marker相互作用的研究时的最佳分离条件ΡΕ0的浓度为0. 1%、电泳温度为15°C、分离电压为15kV和缓冲液pH值
9.0。运用CE-LIF分别检测DNA Marker、蛋白Marker和DNA-蛋白质共孵育后产物，毛细管电泳图分别见图1、图2和图3。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)毛细管柱的修饰取适当长度的石英毛细管，用氢氧化钠(NaOH)清洗，再分别用水、甲醇、空气冲洗；然后用Y -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS) -甲醇冲洗毛细管，20 反应8 1 后，用甲醇、水、空气各冲洗毛细管，再用丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管，20 反应 3 釙后，用水冲洗，即可使用；以上反应均在20 下进行； O)DNA和蛋白质的共同孵育及标记取DNA Marker和宽分子量蛋白Marker，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育结束后加核酸染料标记，然后取标记混合物进行CE-LIF检测；以上反应在25 35°C进行；(3)毛细管电泳检测冲洗毛细管，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质聚环氧化乙烷(PEO)溶液，进行毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)检测，IOs负极电动进样，数据处理软件采集数据；a)选择聚氧化乙烯浓度，重量体积比浓度w/v分别为0.05%,0. 1%,0.5%U.5%, 2.5%、3.0%六个浓度梯度；b)选择温度，温度选择为15°C和20°C两个温度梯度；c)选择电压，选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压梯度；d)选择pH值，选择为6.0,7. 0,7. 5,8. 3,9. 0和10. 0六个pH值梯度；(4)确定分离条件通过优化得到CE用于DNA-ProteinMarker相互作用的研究时的分离条件=PEO的浓度为0. 1 %、电泳温度为15°C、分离电压为15kV和缓冲液pH值9. 0。
2.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的DNA Marker为pUC19DNA/Msp I DNA Marker ；所述的宽分子量蛋白Marker为 Protein Molecular Weight Marker D532S。
3.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤 (2)中的核酸染料为STOR Green I，且在加入三羟甲基氨基甲烷后共同孵育。
4.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(2)中取DNAMarker和宽分子量蛋白Marker，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育温度为 25 ;35°C。
5.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的采用毛细管电泳激光诱导荧光方法检测DNA与蛋白质共同孵育产物。
全文摘要
本发明公开了研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括毛细管柱的修饰、DNA和蛋白质的共同孵育及标记以及运用毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)检测，最终确定分离条件；本发明的优点在于具有筛分介质浓度调节简便、荧光标记方法简单、分离效果好、电泳过程试剂消耗量小、电泳时间短，可在30min内完成、检测效率高、分离效果好等优点，具有一定的实际应用价值。
文档编号G01N27/447GK102175747SQ20101061093
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者孙坤, 张爱梅, 王荣, 谢华, 贾正平 申请人:王荣