专利名称：用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法
技术领域：
本发明涉及光谱测试，特别涉及一种用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法。
背景技术：
随着“温室效应”的加剧，全球气温出现逐年上升的趋势，导致极端气候的频繁发 生，如局部地区的异常干旱、高温等使植物的生长乃至生存面临着严峻的挑战。高温已经逐 渐成为限制植物生长、发育、分布和生产力的一个主要环境因子。所以，研究高温下植物的 生理生态特性；分析植物体内一系列指标在高温下的变化过程；探寻与植物耐热性密切相 关的生理生化参数；建立植物耐热性的鉴定方法；提出简便可靠的耐热性鉴定指标等与高 温胁迫下植物抗逆性潜能及生态适应机制有关的议题已经成为当前植物生理生态学研究 的热点。高温胁迫对植物的影响及检测方法主要体现在如下几个方面(1)高温对植物外 部形态和生长发育的影响这种影响往往比较直观，易引起人们的重视。高温使幼苗徒长， 植株长势变弱，花期缩短，花器发育不良，中、短花柱花比例增加，花粉生存力下降，授粉受 精不正常，产生落花、落果，果实木栓化加重或形成畸形果。因此，外部形态在高温胁迫条件 下的反常变化或经济性状的变化常常作为鉴定植物耐热性的一项指标。基于植物的外观形 态及生长发育受高温胁迫后的影响程度来判断高温损伤的方法需要进行大量的重复性实 验，培养大量的生物样本，耗费很长的培养时间，而且由于植物科属及品种多样，不同的植 物品种的热胁迫反应不同，因此这样的方法在实际应用上无法得到推广。( 高温对植物 内部结构的影响细胞膜系统是热损伤和抗热的中心，细胞膜的热稳定性反映了植物的耐 热能力。高温胁迫对植物细胞膜的影响，主要表现在膜结构、膜脂成分、结合在膜上的酶的 稳定性等几个方面。细胞质膜热稳定性是反映植物抗热性的一个重要指标。目前，用得较 为普遍的鉴定方法为电导法。一种方法是将处理温度或时间和细胞伤害率用Logistic方 程进行拟合，求出该方程出现拐点时的时间值或温度值，并以此作为植物叶片组织的高温 半致死时间或温度的估计值，从而反应植物材料的田间抗热性。另一种方法是测定电导百 分率，以此反映品种抗热性。基于细胞膜的热稳定性来鉴定植物耐热性的方法是一种目前 使用较多的方法之一，但是依然存在田间试验周期长、样本多、工作量大、电导法步骤繁琐 等困难。( 高温对植物光合作用的影响在众多被高温抑制的细胞机能中，光合作用被认 为是对高温胁迫最为敏感的生理过程。高温不仅会抑制光合作用，破坏光合机构，还会伤害 光系统I和光系统II的活性，使光合作用速率下降。检测高温逆境下光合作用的变化可以 早期地诊断高温对植物的伤害。高温胁迫从两个方面降低植物的光合能力，一是气孔性限 制，另一个是非气孔性限制。但无论是哪一种限制因素，最终都使得植物的光合功能减弱， 净光合速率降低。大量的研究证实，净光合速率的降低程度是检测植物高温伤害的一种方 法。虽然关于高温对光合作用的抑制机理一直以来都是颇有争议的一个问题，但大家公认 光系统II是光合作用对高温最为敏感的部位，因而近几年来，主要进行光系统II光合性 能研究的叶绿素荧光分析法逐渐成为植物逆境生理检测的主要手段。目前，对净光合速率的检测通常采用基于红外线气体分析法的仪器设备，但红外线气体分析法存在检测误差较 大，需要多次反复实验，检测时间较长等缺点。而叶绿素荧光分析法虽然简单易行、获得结 果迅速、对植物无破坏，但在实际应用中也存在着参数混杂、参数波动性大、信号微弱等问 题。除了上述几种主要的检测方法外，在对植物的热胁迫分析中，还有一些诸如酶活性、脯 氨酸、蛋白质、叶绿素含量等生理生化的分析方法。但这些方法也都需要繁琐的制样和复杂 的操作。可见，现有的进行植物温度胁迫生理检测及抗逆性鉴定的方法都有着各自不同的 缺点，因此在实际应用中存在一些问题，不利于在农业生产中的推广和普及。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种操作简单、适用范 围广泛、测量时间短、可推广性好，可以对多种作物的耐热性进行快速有效鉴定的方法。本发明的技术解决方案是这样实现的一种用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法，包括选择生长状态相似的作物 和/或该作物的不同生长部位的若干组叶片作为样品，一般为5 10组，每组选择5 8 片相似的叶片和将所述作物样品进行高温胁迫处理的步骤，其特征在于还包括下述步骤1. 1在室温下测量作物叶片的延迟荧光发射光谱，包括1. 1. 1将作物叶片置于室温下具有磷光或延迟荧光检测功能的荧光光谱仪的样品 室中暗适应30min ；1. 1.2光谱的激发光源选择波长为蓝光470 500nm与红光650 680nm范围，强 度为 0 2500 μ mol · m2 · ；1. 1. 3激发光源均勻辐照叶片的时间为0 Imin ；1. 1. 4停止激发到采集叶片延迟荧光光谱的间隔时间为0. 01 Is ；1. 1. 5延迟荧光光谱采集的接收波长范围为185 900nm，放大增益为IXlO8 ；1. 2对延迟荧光发射光谱进行分析，采用商用化ORIGIN软件对所述光谱仪输出的 数据进行分析，寻找发射光谱特征峰685nm和730nm附近的最高峰值，分别记录为F685与 F730,由此计算得到F730/F685 ；1. 3根据测量得到的F730/F685值绘制该作物的延迟荧光光谱峰值比F730/F685 温度响应曲线；1. 4将不同作物F730/F685温度响应曲线的温度拐点记录为该作物的最高耐受温 度Tm ；1. 5比较不同作物Tm的高低，判断耐热性大小；1.6对于具有相同Tm的作物，记录Tm处的F730/F685为VTm，下一高温值处的F730/ F685为νΤω+Δ ，比较VTm与νΤω+Δ 的差异，即知具有相同最高耐受温度作物的耐热性大小。与现有技术相比较，本发明具有如下的优点及效果(1)由于植物的光合作用被认为是对温度胁迫最敏感的生理过程，因此通过光合 作用或光合器官活性的检测是判定植物胁迫生理的一个有效方法。在植物体内的两大光合 作用系统(光系统I与光系统II)遭受不同的温度胁迫时会产生相应的变化，引起发射光 谱发生改变，尤其是延迟荧光光谱中来自于光系统II的685nm谱峰与光系统PSI与光系 统PSII共同作用产生的730nm谱峰的峰值强度发生了明显的变化，从而导致特征峰值比F730/F685随着温度胁迫的影响升高或降低。所以本发明方法通过测量作物延迟荧光发射 光谱，计算特征峰值比F730/F685，绘制F730/F685温度响应曲线至出现温度拐点，通过温 度拐点出现的位置及与邻近温度值的关系，可以对作物耐热性的大小进行直接鉴定，具有 简单、直观、有效的特点。(2)本发明方法是从检测植物受激后发出延迟荧光的光谱变化尤其是特征峰值比 变化的角度进行光合功能强弱的分析，是对植物体内光合能力大小的一种判断，这就避免 了传统方法易受外界环境干扰，参数波动性大等缺点。另一方面，对植物进行的光诱导是由 暗室内的激发光源产生，激发光源的强度可以调节，激发波长可以选择，且是在停止激发后 才进行延迟荧光光谱信息的采集。因此，本发明方法具有不受外界环境干扰、稳定、可控性 好、高信噪比、快速的优点。(3)本发明用延迟荧光光谱检测植物温度胁迫生理及抗逆性鉴定的方法操作过程 简单、容易实现、参数直观。
本发明有附图4幅，其中图1为本发明方法鉴定作物耐热性的流程图；图2为利用本发明方法实现大豆与玉米两种作物耐热性的鉴定结果曲线图；图3为利用本发明检测三种玉米样品在不同温度下F730/F685值的统计表；图4为利用本发明方法实现三种不同耐热型玉米作物耐热性的鉴定结果曲线图。
具体实施例方式如图1所示的一种用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法，包括对需要鉴 定的作物进行选取或培养，旨在对作物进行相似生长状态的耐热性评价，以保证鉴定结果 的合理性和对不同作物进行指定温度值T的胁迫处理，温度间隔为At ；其特征在于将处 理后的作物叶片置于具有磷光或延迟荧光光谱检测功能的光谱仪中进行延迟荧光发射光 谱采集；对延迟荧光发射光谱数据用商用化ORIGIN软件进行特征峰值F685与F730的提 取；计算特征峰值比F730/F685 ；根据不同温度值下的F730/F685用ORIGIN软件绘制得 到F730/F685温度响应曲线；如果测量得到的温度响应曲线未见温度拐点，则对样品进行 T+At的高温胁迫处理，直至响应曲线出现温度拐点；将温度拐点记为该作物的最高耐受 温度Tm。比较不同作物的Tm值的高低，对耐热性进行鉴定；如果温度拐点相同，记温度拐 点处的F730/F685为VTm，温度拐点的下一高温值处的F730/F685为Vm+,t，计算VTm_Vm+,t的 值；比较不同作物νΤω-νω+Δ 值的大小，对耐热性进行鉴定。本发明的提出，是基于大量科学研究和试验成果形成的。发明者的研究发现植物 叶片的延迟荧光发射光谱能有效地反映出高温逆境对作物的光合功能的损伤程度以及抗 逆性的大小。在不同的高温下，延迟荧光发射光谱发生明显改变，尤其是685nm与730nm附 近的特征峰的最高峰值。延迟荧光光谱特征峰值比F730/F685随胁迫情况的变化显著，且 与净光合速率及叶绿素荧光参数Fv/Fm有很好的正相关性。植物的净光合速率和叶绿素荧 光参数Fv/Fm与生长发育的环境有直接关系，是温度胁迫下植物生理检测的有效表征。每 个作物都有自己独特的F730/F685温度响应曲线，随着温度的升高，作物的F730/F685值基本上均一致下降，但当超过某一特定温度值，F730/F685出现反转上升，从而在F730/F685 温度响应曲线上出现了温度拐点。联合在鉴定植物热胁迫生理中常用的叶绿素荧光法五个 参数的分析发现，温度拐点的出现标示着光系统II活性的完全丧失，也即意味着作物体内 光合功能的最高耐热温度。最高耐热温度的大小可用来直观判断作物抵御高温能力的大 小。当不同的作物有相同的最高耐受温度时，其最高耐受温度与相邻温度处F730/F685值 的变化是有差异的，通过比较最高耐受温度与相邻温度处的F730/F685值，可判断同最高 耐受温度作物的耐热性高低。由于室温下延迟荧光发射光谱的685nm附近特征峰被公认为来自于光系统II，而 730nm附近的特征峰被认为是光系统I与II共同贡献的结果，因此特征峰值比F730/F685 是植物叶片两大光系统光合效能的直观体现。它取决于植物的类型、生长发育状况、体内与 体外环境状况。在一致的测量条件(如激发波长、激发时间、激发光强度、测量时间长度、暗 室内温度等)下，通过检测同品种、同生长发育状况的作物叶片在不同高温胁迫下的延迟 荧光发射光谱，计算其特征峰值比F730/F685，绘制F730/F685值的温度响应曲线，找到温 度拐点，得到作物的最高耐热温度，可以简单直观地判断作物的耐热性大小，而对于具有相 同温度拐点的作物，联合分析最高耐热温度与相邻温度处F730/F685值的差异，可以准确 而有效地进行作物耐热性大小的鉴定。实施例1实验室条件下选择由于抗高温能力强而归为高耐热型的运系98-2玉米品种(苗 期)与适中耐热型科丰1号大豆品种(苗期)作为实验样品，选取8组不同生长部位，每组 5片相似生长状态的叶片为样品。将活体作物置于设置好胁迫温度的植物培养箱中高温适 应2小时，植物培养箱保持自然光照，湿度保持在75%，温度范围T为25 57°C，温度间隔 Δ t为2. 5°C。高温处理后将叶片置于具有磷光检测功能的商用化荧光-磷光光谱仪LS55 的暗室内暗适应10分钟(暗室内温度为室温25°C )，用波长为660nm的激发光源对叶片进 行光激发0. 5s,延迟0. 2s,接收延迟荧光光谱信号。将延迟荧光发射光谱数据传给PC机， 用商用化软件ORIGIN进行发射光谱分析，寻找发射光谱的685nm和730nm附近的两个特征 峰值F685与F730，并计算F730/F685。分析数据时，计算玉米或大豆样品8组各5片叶片 的延迟荧光发射光谱F730/F685的平均值和标准差，以平均值作为F730/F685的数据点，而 标准差作为数据的偏差，根据不同高温下检测及分析得到的F730/F685比值绘制为该作物 的延迟荧光发射光谱F730/F685温度响应曲线，如图2所示。由于大豆科丰1号样品的最 适宜生长温度为25 32°C，对该大豆样品的F730/F685比值的温度响应曲线进行分析发 现，在25 45°C范围内，F730/F685比值基本呈缓慢下降趋势，在30°C时值最大。这是由 于当样品处于最适宜生长温度时，光系统I与II的光合活性都达到最佳，因此，F730/F685 比值最大。适度的高温胁迫下(35 45°C )，F730/F685比值下降缓慢，说明此时光合器官 的损伤较轻，光系统I与II都只是受到了轻度的损伤。因此，对F730/F685比值的影响较 小；当胁迫温度达到52. 5°C时，F730/F685比值急剧下降，说明此温度下样品两个光系统的 活性受到了高温损伤，由于730nm峰值带同时来源于两个光系统，所以相较于685nm峰值 带，730nm处峰值的降低显著，因此F730/F685比值下降速度较快；当胁迫温度超过52. 5°C 时，F730/F685比值不是继续降低，而是略微上升，也即出现了温度响应曲线的温度拐点，通 过对作物叶片的光合能力以及叶绿素荧光5个胁迫参数的分析发现，温度响应曲线这个温度拐点的出现是由于光系统II已完全失去光合活性。52. 5°C是大豆科丰1号样品的最高 耐受温度。而对于玉米运系98-2样品，其最适宜生长温度为^ 40°C。通过图2可见，在 30°C，样品发射光谱的F730/F685比值基本为温度响应曲线中的最大值。这同样说明在样 品的最适宜生长温度下，两个光系统的光合活性最强，因此685nm与730nm峰值带的峰值均 达到最高。随着温度的升高，F730/F685比值减小，55°C是该玉米样品的温度拐点，说明当 达到55°C时，玉米运系98-2作物的光合活性丧失，也即该作物的最高耐受温度为55°C。由此可以判断25 32. 5°C是大豆科丰1号样品的适宜生长温度范围，最适宜温 度为30°C，在最适宜生长温度处延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值最高；随着高温胁迫 伤害的加剧，延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值显著下降，52. 5°C为该大豆样品的最高 耐受温度。28 40°C是玉米运系98-2样品的适宜生长温度范围，最适宜温度为32. 5°C，在 最适宜生长温度处延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值最高，随着高温胁迫伤害的加剧， 延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值显著下降，55°C为该玉米样品的最高耐受温度；玉米 运系98-2品种比大豆科丰1号品种耐热性强；F730/F685温度响应曲线能直观准确地反应 作物的高温逆境生理；F730/F685温度响应曲线的温度拐点能准确有效地判断作物的耐热 性大小。实施例2实验室条件下选择由于抗高温能力极强而归为高耐热型的Mg27玉米品种(苗期) 与、中等耐热型的S5-168玉米品种(苗期)、不耐热型晋单36号玉米品种(苗期)作为实验 样品，选取8组不同生长部位，每组5片相似生长状态的叶片为样品。将活体作物置于设置 好胁迫温度的植物培养箱中高温适应2小时，植物培养箱保持自然光照，湿度保持在75%， 温度范围T为25 57°C，温度间隔At为2. 5°C。高温处理后将叶片置于具有磷光检测功 能的商用化荧光-磷光光谱仪LS55的暗室内暗适应10分钟(暗室内温度为室温25°C)，用 波长为660nm的激发光源对叶片进行光激发0. 5s，延迟0. 2s，接收延迟荧光光谱信号。将 延迟荧光发射光谱数据传给PC机，用商用化软件ORIGIN进行发射光谱分析，寻找发射光谱 的685nm和730nm附近的两个特征峰值F685与F730，并计算F730/F685。分析数据时，计 算这三种不同耐热型的玉米品种8组各5片叶片的延迟荧光发射光谱F730/F685的平均值 和标准差，以平均值作为F730/F685的数据点，而标准差作为数据的偏差，三种玉米作物的 延迟荧光发射光谱F730/F685温度响应曲线及具体的F730/F685值如图3和图4所示。对于玉米品种而言，28 40°C基本都适合该作物的生长，但由图3和图4清晰可 见，晋单36玉米品种，最适宜生长温度为30°C，相应地延迟荧光光谱峰值比值F730/F685达 到最大，随着温度的升高，F730/F685持续降低，当50°C时出现温度拐点，说明当达到50°C 时，玉米晋单36号作物的光合活性丧失，也即该作物的最高耐受温度Tm为50°C。对于 S5-168玉米品种，最适宜生长温度为32. 5°C，相应地延迟荧光光谱峰值比值F730/F685达 到最大，随着温度的升高，F730/F685持续降低，当55°C时出现温度拐点，也即55°C为玉米 S5-168的最高耐受温度Tm。而Mg27玉米品种，最适宜生长温度为37. 5°C，相应地延迟荧光 光谱峰值比值F730/F685达到最大，随着温度的升高，F730/F685持续降低，当55°C时也出 现了温度拐点，也即55°C也为玉米Mg27品种的最高耐受温度Tm。可见，S5-168玉米品种 与Mg27玉米品种有相同的Tm。由图3可见，根据定义S5-168玉米品种的VTm为0. 60617， 温度拐点的下一高温值为57. 5°C, VTm+.t = 0. 69848，Um为0. 09231，而Mg27玉米品种的 VTm 为 0. 63191，VTm+.t = 0. 66523，VTm+.t-VTm 为 0. 03332。 由此可以判断28 40°C是玉米作物的适宜生长温度范围；晋单36号玉米品种 最适宜温度为30°C，Tm为50°C ;S5-168玉米品种最适宜温度为32. 5°C，Tm为55°C ；Mg27玉 米品种最适宜温度为37. 5°C，Tm为55°C ；比较最高耐受温度Tm，直观可见，晋单36号玉米 样品的耐热能力最差；对于有相同Tm的两种玉米品种，通过比较Tm处F730/F685的值VTm 与温度拐点的下一高温值Tm+Δ t处的VTm+,t的差异即VTm+,t-Vta，可知，S5-168玉米品种的 VTm+.t-VTm高于Mg27玉米品种，因此，Mg27玉米品种的耐热性要高于S5-168玉米品种。可 见，F730/F685温度响应曲线能直观准确地反应作物的高温逆境生理，F730/F685温度响应 曲线的温度拐点能准确有效地判断作物的耐热性大小。
权利要求
1. 一种用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法，包括选择生长状态相似的作物和 /或该作物不同生长部位的若干组叶片作为样品，一般为5 10组，每组选择5 8片相似 的叶片和将所述作物样品进行高温胁迫处理的步骤，其特征在于还包括下述步骤 1.1在室温下测量作物叶片的延迟荧光发射光谱，包括1. 1. 1将作物叶片置于室温下具有磷光或延迟荧光检测功能的荧光光谱仪的样品室中 暗适应30min ；1. 1. 2光谱的激发光源选择波长为蓝光470 500nm与红光650 680nm范围，强度为 0 2500 μ mo 1 · πΓ2 · ；1. 1. 3激发光源均勻辐照叶片的时间为0 Imin ； 1. 1. 4停止激发到采集叶片延迟荧光光谱的间隔时间为0. 01 Is ； 1. 1. 5延迟荧光光谱采集的接收波长范围为185 900nm，放大增益为1 X IO8 ； 1. 2对延迟荧光发射光谱进行分析，采用商用化ORIGIN软件对所述光谱仪输出的数据 进行分析，寻找发射光谱特征峰685nm和730nm附近的最高峰值，分别记录为F685与F730， 由此计算得到F730/F685 ；1. 3根据测量得到的F730/F685值绘制该作物的延迟荧光光谱峰值比F730/F685温度 响应曲线；1. 4将不同作物F730/F685温度响应曲线的温度拐点记录为该作物的最高耐受温度Tm ；1. 5比较不同作物Tm的高低，判断耐热性大小；1. 6对于具有相同Tm的作物，记录Tm处的F730/F685为VTm，下一高温值处的F730/ F685为νΤω+Δ ，比较VTm与νΤω+Δ 的差异，即知具有相同最高耐受温度作物的耐热性大小。
全文摘要
本发明公开了一种用延迟荧光发射光谱鉴定作物耐热性的方法，主要是通过检测作物叶片的延迟荧光发射光谱，分别寻找发射光谱两个特征峰即685nm与730nm附近的最高峰值，得到发射光谱的特征峰值比F730/F685，根据不同高温下作物叶片的F730/F685值，可绘制作物的延迟荧光光谱峰值比F730/F685温度响应曲线，根据温度响应曲线的温度拐点，即得到该作物的最高耐受温度。比较不同作物最高耐受温度，即可知作物的耐热性大小。对具有相同最高耐受温度的作物，通过比较最高耐受温度与相邻温度处F730/F685值的差异，即可鉴定作物的耐热性高低。本发明方法操作简单、适用范围广泛、测量时间短、可推广性好。
文档编号G01N21/64GK102141516SQ20101061220
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者李瑛 , 董丽丽, 许文海 申请人:大连海事大学