一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法，属于高 分子物理基础研究领域。
【背景技术】
[0002] 聚合物分子尤其是带电聚合物在其良溶剂中的构象信息一致是学术界关注却很 少为人理解的问题，该问题与聚合物链附近的微观环境是密不可分的如抗衡离子分布问 题，而测量单分子级别的荧光发射光谱是解决这一难题的有效方法，这将帮助我们更好的 理解聚合物溶液宏观性质的微观物理过程，也将帮助我们揭开一些生命过程的微观物理本 质。
[0003] 光谱大体可以分为吸收光谱和发射光谱。红外吸收光谱(IR)和紫外吸收光谱(UV) 是最为常见的两种吸收光谱，红外吸收光谱是分子中成键原子振动能级跃迀而产生的吸收 光谱，所有有机化合物在红外光谱区内都有吸收，因此，红外光谱广泛的应用于鉴别化合物 的特征键及其官能团，能提供大量的关于化合物的结构信息，Ken-ichi Ataka等用表面增 强红外吸收光谱研究了水分子在电极表面的再取向信息（Ken-ichi Ataka，Takao Yotsuyanagi，and Masatoshi Osawa.Potential-Dependent Reorientation of Water Molecules at an Electrode/Electrolyte Interface Studied by Surface-Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy，J.Phys·Chem.，1996，100:10664-10672);紫外光谱 由于其极高的灵敏度广泛的应用于微量杂质的检测以及化学结构的分析等，K.Keith Innes .等用紫外吸收光谱研究了乙炔分子的振动和转动信息(K.Keith Innes. Analysis of the Near Ultraviolet Absorption Spectrum of Acetylene，J.Chem.Phys.，1954， 22:863-876)。另外，对于荧光光谱最受人们关注的是其发射光谱，是由电子在两能级间不 发生自旋反转的辐射跃迀过程中所产生的，广泛的应用于荧光探针、物质的检测、发光器件 等，中国科学院化学研究所赵江等用荧光关联光谱研究了聚电解质稀溶液的链周围抗衡离 子的分布以及构象变化信息（Shuangjiang Luo，Xiubo Jiang，Lei Zou，Fei Wang，Jingfa Yang ,Yongming Chen and Jiang Zhao . Resolving the Difference in Electric Potential within a Charged Macromolecule，Macromolecules，2013,46,3132_3136;Fei Wang,Yi Shi，Shuangj iang Luo，Yongming Chen，and Jiang Zhao . Conformational Transition of Poly(N-isopropylacrylamide)Single Chains in Its Cononsolvency Process:A Study by Fluorescence Correlation Spectroscopy and Scaling Analysis ?Macromolecules,2012 ?45:9196-9204)〇
[0004] 然而，紫外吸收光谱以及红外吸收光谱由于浓度的限制，无法从单分子的角度去 研究聚合物溶液的微观物理信息，荧光关联光谱纵有单分子的分辨率与灵敏度，但是无法 得到光强的分布信息，无法直观的得到链周围微观物理环境的变化。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方 法，该方法既可以实施精确的动态剪切，而且具有单分子级别的分辨率和灵敏度。
[0006] 本发明提供的一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法，包括 如下步骤：
[0007] (1)配制浓度为1〇ηΜ以下的聚合物溶液，将荧光分子探针标记在聚合物分子上；
[0008] (2)在施加剪切场的同时，激光照射经标记的聚合物溶液，收集发射出的荧光信 号，即得单个聚合物分子的荧光发射光谱信息;所采用的测量系统包括:一用于作为激发光 照射待测样品的激发光源单元;一用于对待测样品施加机械剪切同时测量其宏观流变学特 性的剪切施加与流变测量单元，所述剪切施加与流变测量单元底部设置一激发光光学窗 口；以及一光学显微单元，所述光学显微单元用于将所述激发光源单元出射的激发光经所 述激发光光学窗口引入到位于剪切场下的待测样品，使得待测样品受激发产生荧光信号， 并将产生的荧光信号收集发射到一单分子荧光发射光谱测量单元;所述单分子荧光发射光 谱测量单元用于获取荧光信号，得到单个聚合物分子的荧光发射光谱信息（如荧光发射光 谱图、聚电解质链周围抗衡离子分布信息等）。
[0009] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述剪切施加与流变测量单元采用一转矩 流变仪，所述转矩流变仪下基板设置所述激发光光学窗口，所述激发光光学窗口具体可为 一石英载玻片，其厚度为〇. 13~0.17_，从而使光学窗口具有高透过率和短工作距离;在测 试过程中将待测的聚合物溶液滴加到该载玻片上测量，具体可滴加0.8~1.2mL(如lmL)，由 于聚合物溶液的浓度小于1〇ηΜ(如5nM)，微小的激发空间内平均存在单个或者少于单个荧 光分子，因此可得到单个聚合物分子的荧光发射光谱。
[0010] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述激发光源单元采用连续激光或飞秒脉 冲激光，所述连续激光或飞秒脉冲激光的波长需要与所激发的荧光分子(经标记的聚合物 分子)相匹配;所述激发光源单元包括一个以上不同波长的激光器、若干反射镜、若干光阑、 第一扩束镜、第二扩束镜，所述第二扩束镜的入射端设置一中性密度滤波片，所述激光器发 出的光分别经若干所述反射镜和所述光阑并依次经所述第一扩束镜和第二扩束镜进行两 级扩束将激发光束直径扩大以确保其尺寸大于所述光学显微单元的显微镜物镜进光孔，从 而获得充分利用物镜的数值孔径而产生最小的激发空间(达1(T 15L级别）。
[0011] 上述的测量方法中，所述光学显微单元采用倒置荧光显微镜结构，包括一显微镜 物镜、一二向色镜、一发射光高通滤波片、一激发光带通滤波片、一反射镜、一聚焦透镜和一 狭缝，所述激发光经所述显微物镜发射到位于所述剪切施加与流变测量单元内部的待测样 品，经待测样品激发的荧光经所述显微物镜收集后发射到所述二向色镜，经所述二向色镜 出射的荧光信号经所述发射光高通滤波片发射到所述反射镜，经所述反射镜反射的荧光经 所述聚焦透镜和狭缝发射到所述单分子荧光发射光谱测量单元;另外，所述激发光源单元 的出射端设置所述激发光带通滤波片。
[0012] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述单分子荧光发射光谱测量单元可以采 用光谱分析仪，具体可采用具有单分子分辨率以及灵敏度的荧光光谱仪。
[0013] 上述的测量方法中，所述测量系统还包括一高精度位移平台，使用时可以将转矩 流变仪放置在显微镜物镜的上方，从而实现各个器件的精确联动。
[0014] 上述的测量方法中，所述荧光分子探针以化学键合的方式标记到所述聚合物分子 上，如所述聚合物分子链的末端。
[0015]上述测量方法中，所述聚合物可为DNA，具体可为人体单链DNA i-motif片段，序列 为5 '-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3 '。<