专利名称：傅立叶变换红外光谱技术对13种致病菌的分类鉴定的制作方法
技术领域：
本发明属于对13种常见致病菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT IR)技术对腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus, B.cereus)、大肠埃希氏 0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7,E.coli 0157:H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis)、大肠杆菌(Escherichia coli,Ecoli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii, E.sakazakii)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei, S.sonnei)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)、弗劳地朽1 樣酸杆菌(Citrobacter freundii, C.freunddi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium, S.typhimurium)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes, E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, Ε.cloacae)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, S.enteritidis)进行快速分类鉴定。
背景技术：
致病菌特别是食源性致病菌是引起人类疾病的重要原因，是食品安全的主要问题。由致病菌导致的恶性事件时有发生。近年来人们的食品安全意识不断增强，多种致病菌已成为食品质量监控中的必检项目。特别在进出口贸易中，致病菌的检测项目尤其是检测周期也成为各国设置贸易壁垒的重要手段。因此，建立这些致病菌快速有效的分类、鉴定及检测技术对于保障食品安全、促进贸易发展具有重要的现实意义。FT-1R技术以未损伤细胞的FT-1R光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞所有组成成分的化学键的振动情况，因此可以区分生化信息上的差别。FT-1R提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定量信息，反应微生物的信息相比更全面。其优点在于分辨率高、鉴定时间短、成本低。但光谱技术在微生物分类鉴定中的应用尚不够系统和成熟，尚不够规范，有待对其进行统一并形成标准方法。目前国内外还没有对上述13种致病菌的规范、统一的FT-1R分类鉴定方法公开，也没有关于13种致病菌FT-1T光谱信息共享数据库的公开，该发明可弥补上述缺陷，建立13种致病菌的规范、统一的FT-1R分类鉴定方法。
发明内容
本发明属于对13种致病菌的分类鉴定，具体地说是应用FT-1R技术，结合化学计量学运算，实现对 B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freunddi> S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis的分类鉴定。包括建立13种标准菌株光谱信息数据库,规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法等。本发明所采用的技术方案为:应用FT-1R技术，建立B.cereus, E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes>
C.freunddi> S.typhimur ium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 等 13 种标准菌株的光谱信息数据库，同时规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法。采用相同细菌培养、样品制备及光谱采集方法，获得可疑待测菌的光谱数据，与13种标准菌株的光谱信息数据库合并，并进行分级聚类分析(hierarchical clusteranalysis, HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据获得可疑待测菌的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。本发明涉及的13种致病菌的FT-1R分类鉴定方法，依次包括下列步骤(1)-(2):(I)建立13种致病菌的红外光谱信息数据库①细菌的培养:用无菌接种环挑取标准菌株B.cereusATCC12826、E.coli0157:H7ATCC43895、S.aureus ATCC12600.S.epidermidis ATCC12228、E.coli ATCC10536、
E.sakazakii ATCC51329、S.sonnei ATCC25931、L.monocytogenes ATCC19114、C.freunddiATCC10787、S.typhimuriumATCC14028, E.aerogenes ATCC49701、E.cloacae ATCC13047、
S.enteritidis CICC21482—环，接种于盛有15mL营养肉汤的大试管中，36°C ±1°C静置培养 18-24h ；
②硒化锌(ZnSe)窗片的制作:吸取肉汤培养物ImL于1.5mL离心管中，5000g离心5min,吸弃上清,加入ImL无菌生理盐水悬浮洗漆,5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆，5000g离心5min,超纯水重复洗漆两次。最后用50yL超纯水悬浮混勻。用微量移液器吸取菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；③读取细菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱:光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为 波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率4CHT1，64次光谱累计求平均。每种菌至少做10次试验，每次做3个重复并取平均，获得10个有效光谱数据；④光谱预处理:对13种致病菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、二阶导数(平滑点数17点)、矢量归一化、导数谱-excel数据转换，即建立了 13种致病菌的红外光谱信息数据库；⑤聚类方法的建立:对13种致病菌的977.9-1895.3cm^波数范围光谱数据进行HCA，获得实现13种致病菌分类鉴定的方法参数:HCA:皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)。(2)对目标菌的分类鉴定采用上述细菌培养、硒化锌(ZnSe)窗片制作、光谱采集及光谱预处理方法，获得可疑待测目标菌的红外光谱数据。将其与13种标准菌株的光谱信息数据库合并，按照上述方法对合并后的数据重新进行分级聚类分析(HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据待测菌在数据库中的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freunddi> S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 分别聚类到数据库中对应的 B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes> C.freunddi>S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 聚类群中。
图1:应用HCA对13种致病菌标准菌株的分类图；图2:实施例中应用HCA对供试样品中13种致病菌和I种非可疑菌的分类鉴定图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例供试样品制备:将解冻后的冷冻鲐鲅鱼分为13份，每份500g，分别剪碎均质后，向其中分别添加 5X102CFU/mLB.cereus ATCC12826、E.coli 0157:H7ATCC43895、S.aureus ATCC12600、S.epidermidisATCC 12228、E.coli ATCC10536、E.sakazakiiATCC51329、S.sonnei ATCC2593U L.monocytogenes ATCC19114、C.freunddi ATCC10787、S.typhimurium ATCC14028、E.aerogenes ATCC49701、E.cloacae ATCC13047、
S.enteritidis CICC21482标准菌株溶液各10mL，搅拌混匀，冷冻备用。按下述方法检测供试样品:包括纯净水，0.9%生理盐水，无水乙醇，营养肉汤，13种菌增菌用培养基及选择性培养基平板(参考相应菌的检测标准)等；按照以下程序进行检测:(I)细菌培养将冷冻鲐鲅鱼供试样品解冻后，每份样品称取25g，共称取13份样品，根据相应菌的检测标准对其分别进行增菌和显色培养基选择培养后，用无菌接种环挑取可疑菌落一环，分别接种于盛有15mL营养肉汤的大试管中，36°C ±1°C静置培养18_24h，使OD6c 介于
0.3 0.4范围。同时从任一显色培养基上挑取非可疑菌落一环进行培养,培养方法相同；(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作吸取各肉汤培养物ImL于1.5mL离心管中，5000g离心5min,吸弃上清，分别加入ImL无菌生理盐水悬浮洗漆,5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆,5000g离心5min,超纯水重复洗漆两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混匀。用微量移液器吸取菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；(3)读取细菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱将载有样品的ZnSe窗片置于傅立叶变换红外光谱仪上进行光谱采集，光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为:波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率4(311^,64次光谱累计求平均。每种菌做3个重复并取平均；(4)光谱预处理对待测菌4000 eOOcnT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、二阶导数(平滑点数17点)、矢量归一化、导数谱-excel数据转换；(5)数据分析将待测菌 光谱数据与13种标准菌株的光谱信息数据库合并，对977.9-1895.3^1波数范围光谱数据进行HCA (皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)):B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freundd1、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 分别聚类到数据库中对应的 B.cereus、E.coli 0157:Η7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freundd1、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 聚类群中；非可疑菌单独聚类。分类鉴 定情况见图2。
权利要求
1.一种蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗劳地柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌及肠炎沙门氏菌等13种致病菌的分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立: 对腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus)ATCC12826、大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli0157:H7) ATCC43895、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC12600、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC12228、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC10536、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC51329、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)ATCC25931、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19114、弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC10787、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) ATCC49701、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)ATCC13047、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)CICC21482 等 13 种标准菌株4000 eOOcnT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、二阶导数(平滑点数17点)、矢量归一化、导数谱-excel数据转换，即建立了 13种致病菌的红外光谱信息数据库。
2.根据权利要求1所述的13种致病菌的傅立叶变换红外光谱鉴别方法，其特征是依次包括以下步骤: (1)细菌的培养: 用无菌接种环挑取细菌选择培养基上可疑B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freunddi>S.typhimurium>E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 一环，接种于盛有 15mL 营养肉汤的大试管中，36°C ±1°C静置培养18-24h。
(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作: 吸取肉汤培养物ImL于1.5mL离心管中，5000g离心5min,吸弃上清,加入ImL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min，再加入ImL超纯水悬浮洗涤，5000g离心5min，超纯水重复洗漆两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混勻。用微量移液器吸取菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑。
(3)读取细菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱: 将载有样品的ZnSe窗片置于傅立叶变换红外光谱仪上进行光谱采集，光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为:波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率4(311^,64次光谱累计求平均。
(4)光谱预处理: 根据权利要求1，对光谱进行处理，得到由光谱转换的excel数据。
(5)对数据进行分级聚类分析(hierarchicalcluster analysis, HCA): 对上述处理的菌977.9-1895.3cm^波数范围光谱数据进行HCA ； HCA:皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)；B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.col1、E.sakazaki1、S.sonne1、L.monocytogenes、C.freunddi> S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 分别聚类到数据库中对应的 B.cereus、E.coli 0157:H7、S.aureus、S.epidermidis、E.co l1、E.sakazaki1、S.sonne1、LmonocytogenesΛ C.freundd1、S.typhimurium、E.aerogenes、E.cloacae、S.enteritidis 聚类群中。
全文摘要
本发明属于对13种常见致病菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)技术结合化学计量学运算(分级聚类分析)对蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、大肠埃希氏O157:H7(E.coliO157:H7)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大肠杆菌(E.coli)、阪崎肠杆菌(E.sakazakii)、宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、弗劳地柠檬酸杆菌(C.freunddi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)等13种常见致病菌进行分类鉴定。方法包括13种致病菌FT-IR光谱信息数据库的建立、细菌的培养、硒化锌(ZnSe)窗片的制作、光谱采集及预处理，最后采用分级聚类分析进行结果判定。其优点在于分辨率高、快速、操作简单、成本低。
文档编号G01N21/35GK103217398SQ20131006389
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者杨丽君, 李兆杰, 宋晓华, 刘玉敏 申请人:威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心