4] 优选地，单分子荧光成像单元4可以采用EMCXD相机。
[0045] 优选地，单分子荧光发射光谱测量单元5可以采用光谱分析仪。
[0046] 优选地，每一荧光关联光谱测量单元6均包括一单光子探测器以和一数据采集卡， 单光子探测器将探测接收的荧光信号转换为电信号经数据采集卡发送到一计算机进行关 联性分析获得关联函数数据，进而获得待测样品的扩散系数及平均浓度信息。
[0047]优选地，该系统还包括一高精度位移平台，使用时可以将转矩流变仪放置在显微 镜物镜31的上方，从而实现各个器件的精确联动，高精度位移平台是可以采用现有技术的 位移平台，在此不再赘述。
[0048] (2)获取剪切场下单个聚合物分子的荧光发射光谱信息
[0049] 按照如下步骤获取剪切场下单个聚合物分子的荧光发射光谱信息：
[0050] 1、样品的制备
[0051 ] 1)末端修饰DNA溶液的制备
[0052] 将浓度为215.3nM 5'端修饰NH2-(CH2)6-的人体单链DNA i-motif片段溶解在350μ L ρΗ=8.3的0.1Μ的Na2C03-NaHC03缓冲溶液中制得待标记的单链DNA溶液；
[0053] 2)标记
[0054] 将50yL的Oregon Green 514染料（820.56纳摩尔）的DMS0溶液加入步骤1)中配制 好的DNA溶液（DNA与染料的摩尔比为1:5)中，均匀混合，室温下（25°C )，避光过夜反应 (12h)〇
[0055] 3)将步骤2)得到的染色反应的混合物通过以0.1M的Na2C03-NaHC0 3缓冲溶液为流 动相的聚丙烯酰胺凝胶色谱柱（Β?ο-Gel? P-6media; Bio-Rad，USA)分离除去大部分自由染 料，再通过超滤直至滤出液中未检测到荧光信号，获得样品。
[0056] 2、测试
[0057] 操作步骤如下：
[0058] 1)打开激发光源(473nm连续激光)并将扩束后的激发光束调节准直使之成为平行 光束；
[0059] 2)将转矩流变仪通过高精度位移台移动到显微镜物镜正上方；
[0060] 3)切换到水浸物镜，并在显微镜物镜上加入40yL超纯水，并向上调节使之达到合 适的聚焦位置；
[0061] 4)加样品(体积lmL)于载玻片正中心；
[0062] 5)打开转矩流变仪实施动态剪切；
[0063] 6)调节光谱仪狭缝宽度（ΙΟμπι)以及增益倍数(100倍)使得探测到的最佳的荧光发 射光谱；
[0064] 7)改变流变仪的剪切速率，得到荧光发射光谱随剪切速率的变化，如图4。
[0065] 8)固定剪切速率为1001/s，按照上述步骤1)-6)分别测定Oregon Green 514染料 (Free 0G514)和标记有Oregon Green 514染料的DNA分子(0G514-i_motif)在不同pH值下 的荧光发射光谱，由于所用染料为pH响应性染料，光谱强度均随pH值的变化而变化，如图5 所示，其中左图为Free 0G514的发射光谱，右图为0G514-i-motif的发射光谱，通过两者发 射光谱图中峰形的比较，可以看出，由于发射光谱与链周围的氢离子浓度有关，对于该体系 链周围的抗衡离子浓度要比本体溶液中高一个数量级左右。
【主权项】
1. 一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法，包括如下步骤： (1) 配制浓度为ΙΟηΜ以下的聚合物溶液，将荧光分子探针标记在聚合物分子上； (2) 在施加剪切场的同时，激光照射经标记的聚合物溶液，收集发射出的荧光信号，即 得单个聚合物分子的荧光发射光谱信息;所采用的测量系统包括： 一用于作为激发光照射待测样品的激发光源单元； 一用于对待测样品施加机械剪切同时测量其宏观流变学特性的剪切施加与流变测量 单元，所述剪切施加与流变测量单元底部设置一激发光光学窗口；以及 一光学显微单元，所述光学显微单元用于将所述激发光源单元出射的激发光经所述激 发光光学窗口引入到位于剪切场下的待测样品，使得待测样品受激发产生荧光信号，并将 产生的荧光信号收集发射到一单分子荧光发射光谱测量单元;所述单分子荧光发射光谱测 量单元用于获取荧光信号，得到单个聚合物分子的荧光发射光谱信息。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述测量系统中，所述剪切施加与流变测 量单元采用转矩流变仪，所述转矩流变仪下基板设置所述激发光光学窗口。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述测量系统中，所述激发光源单元采 用连续激光或飞秒脉冲激光;所述激发光源单元包括一个以上不同波长的激光器、若干反 射镜、若干光阑、第一扩束镜和第二扩束镜，所述第二扩束镜的入射端设置一中性密度滤波 片，所述激光器发出的光分别经若干所述反射镜和所述光阑并依次经所述第一扩束镜和第 二扩束镜进行两级扩束将激发光束直径扩大以确保其尺寸大于所述光学显微单元的显微 镜物镜进光孔。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:所述测量系统中，所述光学显 微单元米用倒置焚光显微镜结构，包括一显微镜物镜、一二向色镜、一反射镜、一发射光高 通滤波片、一激发光带通滤波片、一狭缝和一聚焦透镜，所述激发光经所述显微物镜发射到 位于所述剪切施加与流变测量单元内部的待测样品，经待测样品激发的荧光经所述显微物 镜收集后发射到所述二向色镜，经所述二向色镜出射的荧光信号经所述滤波片发射到所述 反射镜，经所述反射镜反射的荧光经所述聚焦透镜和狭缝发射到所述单分子荧光发射光谱 测量单元;另外，所述激发光源单元的出射端设置所述激发光带通滤波片。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:所述聚合物为DNA，具体为人体 单链DNA i-motif片段，序列为5 ' -CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3 ' ；所述荧光分子探针为荧光 染料，具体为Oregon Green 514 〇6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法在所述标记之前还包括在DNA分 子的5 '端修饰的NH2- (CH2) 6-步骤。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述标记中，所述DNA与所述荧光染料 的摩尔比为1: (3~7)。8. 根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于:DNA溶液的溶剂为pH为8.2~ 8.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。9. 根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述标记在避光的条件下进 行，温度为20~30 °C，时间为8~14h。
【专利摘要】本发明公开了一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法。该方法包括如下步骤：(1)配制浓度为10nM以下的聚合物溶液，将荧光分子探针标记在聚合物分子上；(2)在施加剪切场的同时，激光照射经标记的聚合物溶液，收集分析发射出的荧光信号，即得所述单个聚合物分子的荧光发射光谱信息；所采用的测量系统包括一激发光源单元、一剪切施加与流变测量单元、一光学显微单元和一单分子荧光发射光谱测量单元，其中，剪切施加与流变测量单元底部设置一激发光光学窗口。本发明方法将宏观的剪切施加与流变测量和单分子荧光发射光谱测量相结合，获取剪切场下被测量体系的单分子荧光发射光谱，其探测空间为10-15L级别，具有单分子级别的灵敏度。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105675560
【申请号】CN201610031002
【发明人】郑锴锴, 杨京法, 赵江
【申请人】中国科学院化学研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月18日