br>[0016] 上述测量方法中，所述荧光分子探针可为荧光染料，具体可为Oregon Green 514， 其最大吸收波长为514nm，为pH响应性染料，随着pH的增加其发光能力会增加，结构式如式I 所示：
[0017]
[0018] 上述的测量方法中，所述方法在所述标记之前还包括在所述DNA分子的5'端修饰 的NH2-(CH2)6-步骤，使得荧光分子探针中的琥珀酰亚胺酯键与DNA分子末端修饰的氨基反 应从而使荧光分子探针结合在DNA分子上。
[0019] 上述的测量方法中，所述标记中，所述DNA与所述荧光染料的摩尔比为1: (3~7)， 具体可为1:5。
[0020] 上述的测量方法中，DNA溶液的溶剂可为pH为8.2~8.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶 液，以利于与荧光分子探针的键合。
[0021] 上述的测量方法中，所述标记在避光的条件下进行，温度可为20~30°C (如25°C)， 时间可为8~14h(如12h)。
[0022] 上述的测量方法中，所述方法在所述标记之后还包括除去聚合物溶液中未标记的 荧光分子探针的步骤。
[0023]本发明具有如下有益效果：
[0024]本发明方法将宏观的剪切施加与流变测量和单分子荧光发射光谱测量相结合，获 取剪切场下被测量体系的单分子荧光发射光谱，其探测空间为1(T15L级别，具有单分子级别 的灵敏度，测量样品的浓度可以达到nM水平，为进一步直观的得到聚合物分子链周围的微 观环境信息奠定基础。
【附图说明】
[0025]图1是本发明的测量原理示意图。
[0026] 图2是本发明开设光学窗口的流变仪下基板结构示意图。
[0027] 图3是本发明的激发光源单元结构示意图。
[0028] 图4为采用本发明测量方法得到的不同剪切速率下的聚合物分子的荧光发射光谱 图（沿箭头方向剪切速率依次为〇s-\ 100s-\500s-1和100s-4。
[0029] 图5为Oregon Green 514染料（Free 0G514)和标记有Oregon Green 514染料的 DNA分子(0G514-i-motif)在不同pH值下的荧光发射光谱图。
[0030] 图中，各标记如下：
[0031] 1激发光源单元、2剪切施加与流变测量单元、3光学显微单元、4单分子荧光成 像单元、5单分子荧光发射光谱测量单元、6荧光关联光谱测量单元、21光学窗口、10激 光器、11反射镜、12光阑、13第一扩束镜、14第二扩束镜、15中性密度滤波片、31显微 镜物镜、32二向色镜、33第一反射镜~第三反射镜、34发射光高通滤波片、35针孔、36 分束镜、37狭缝、38第一聚焦透镜~第四聚焦透镜、39激发光带通滤波片。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 5 '端修饰NH2-(CH2)6-的人体单链DNA i-motif片段，其序列为：5 '- CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3 '（序列1);Mw = 6200; HPLC纯化;购买于生工生物工程（上海)股 份有限公司。
[0035] Oregon Green 514染料作为焚光分子探针，购买于Invitrogen,USA;直接使用。
[0036] 实施例1、获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息
[0037] (1)本发明方法采用的获取剪切场下单个分子光谱及成像的测量系统
[0038] 如图1所示，本发明方法使用的获取剪切场下单个分子光谱及成像测量系统，包括 一激发光源单元1、一剪切施加与流变测量单元2、一光学显微单元3、一单分子荧光成像单 元4和/或一光谱测量单元，光谱测量单元可以采用一单分子荧光发射光谱测量单元5和/或 一荧光关联光谱测量单元6,其中，剪切施加与流变测量单元2底部设置一激发光光学窗口 21；
[0039]激发光源单元1发出的激光作为激发光照射聚合物溶液，染料分子以化学键合的 方式接到聚合物分子链的末端;剪切施加与流变测量单元2用于对待测样品施加机械剪切 同时准确测量其宏观流变学特性;光学显微单元3用于将激光光源单元1出射的激发光通过 光学窗口 21引入到位于剪流场下的聚合物溶液，使得经荧光分子探针标记的聚合物分子 (荧光分子)受激发产生荧光信号，并将产生的荧光信号收集分别发射到单分子荧光成像单 元4、单分子荧光发射光谱测量单元5和/或荧光关联光谱测量单元6;单分子荧光成像单元4 用于对扩散较慢体系(凝胶、高分子固体薄膜等）内的单个荧光分子进行实时荧光成像，获 得在扩散较慢的体系中的单分子实空间运动信息，即获取该荧光分子的扩散和取向信息； 单分子荧光发射光谱测量单元5用于对聚合物溶液中的单个荧光分子的发射光谱，并对其 进行强度分析通过光谱的变化得到染料分子附近的抗衡离子分布的信息；荧光关联光谱测 量单元6用于获取荧光信号，通过对其进行关联性分析得关联光谱，并对关联光谱进行关联 性拟合得到聚合物分子的扩散以及尺寸信息。
[0040] 优选地，如图2所示，剪切施加与流变测量单元2可以采用能够实施精确动态剪切 的转矩流变仪，转矩流变仪下基板设置有一高透过率且短工作距离的激发光光学窗口 21， 短工作距离是为了与高数值孔径的显微镜水浸物镜相匹配，其工作距离非常的短，最大 0.2mm〇
[0041] 优选地，激发光源单元1可以采用连续激光或飞秒脉冲激光，目的是激发更多种荧 光分子，所选择激光器的波长需要与所激发的荧光分子相匹配，本实施例中的激发光源单 元1包括三种不同波长的激光器1〇(以此为例，但是不限于此，可以根据实际使用进行选 择）、若干反射镜11、若干光阑12、第一扩束镜13和第二扩束镜14,第二扩束镜14的入射端可 以设置一用于调节激发光的功率的衰减片15,三个激光器10的波长分别为1060nm、532nm和 473nm，三个激光器10分别依次经若干反射镜11反射或透射以及光阑12并依次经第一扩束 镜13和第二扩束镜14进行两级扩束将激发光束直径扩大到2.0cm左右以确保其尺寸大于光 学显微单元的显微镜物镜进光孔，从而获得充分利用物镜的数值孔径而产生最小的激发空 间。
[0042]优选地，如图1所示，光学显微单元3可以采用倒置荧光显微镜，包括一显微镜物镜 31、一二向色镜32、第一~第二反射镜33、一发射光高通滤波片34、一针孔35、一分束镜36、 一狭缝37和第一~第三聚焦透镜38,激发光经显微物镜31发射到位于剪切施加与流变测量 单元3内部的待测样品，经待测样品激发的荧光经显微物镜35收集后发射到二向色镜32,经 二向色镜32出射的荧光信号经发射光高通滤波片34发射到第一反射镜33,经第一反射镜33 反射的荧光经第一聚焦透镜38和狭缝37发射到单分子荧光发射光谱测量单元5,经第一反 射镜33透射的荧光经第二聚焦透镜38发射到第二反射镜33,经第二反射镜33反射的光发送 到单分子荧光成像单元4,经第二反射镜33透射的光经针孔35发射到分束镜36,经分束镜36 出射的一部分光经第三聚焦透镜38发射到荧光关联光谱测量单元6;另外，激发光源单元1 的出射端设置激发光带通滤波片39。
[0043]优选地，为了有效消除探测器本身的after-pulsing产生的假信号，本发明还包括 第三反射镜33和第四聚焦透镜38,经分束镜36出射的另一部分光经第四反射镜33反射到第 四聚焦透镜38，经第四聚焦透镜38出射的光发射第二荧光关联光谱测量单元6。
[004