专利名称：一种检测多种植物病毒的蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，属于检验检疫领域。
背景技术：
番茄斑萎病毒(iTomato spotted wilt vi rus , TSffV) 是布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovi rus )的典型成员，也是寄主范围最广、最具 经济重要性的病毒之一。TSWV在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州等多个国家和地区广泛 分布，温带、亚热带和热带地区均有发生，能侵染包括烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊 花、凤仙花等80科900多种植物，且发现的寄主种类还在不断增加。该病毒传播方式主要 是蓟马以持久性方式传播。病毒粒子球形，直径约70 90 nm，表面包裹一层约5 nm厚 的双层脂质包膜。病毒基因组为3分体单链RNA基因组，编码4种结构蛋白。TSWV为我 国进境植物检疫的危险性有害生物，寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种苗携 带该病毒的风险性很大，伴随着我国进出境贸易的高速增长，传入我国并危害流行的可能 性极大。但研究表明TSWV在植物提取液中非常不稳定，即使提纯病毒其免疫原性也很弱， 因而多抗血清的滴度较低，常规的血清学方法由于其灵敏度低和特异性差，大大限制了对 该病毒的检测。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)属于烟草脆裂病毒属 (Tobravirus)。TRV 通过生于土壤的线虫(Trchodorus and Paratrichodours)传播。线虫 往往会在排水不良的地方发现，在这种地方TRV持续存在，并通过当地的线虫传播到敏感 植物种类上。许多种类的杂草是病毒主要的所在地，马铃薯以及其它一些农作物是次要场 所。TRV分布广泛，可以侵染大量的植物种类，在马铃薯、烟草、观赏植物的块茎上会引起重 要的经济损失。该病毒目前是我国的检疫生物之一。烟草脆裂病毒是一类应用比较广泛而 且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造 后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，也可以鉴定宿主植物生长点 的基因，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。黄瓜绿斑驳病毒属在欧洲、印度、韩国和日本葫芦科植物上发现的一种RNA病毒， 病毒粒子细管状，长度约300 X 18 nm.病毒易通过汁液传播，但病毒的寄主范围较窄。黄瓜 绿斑驳花叶病毒病以种传和接触性传播为主要途径。另外，嫁接、田间作业也容易造成接触 侵染。可以随种子或流水远距离传播，随农事操作在田间传播，病毒在种子或土壤内都可存 活1年以上，生物学介体未知。香石竹斑驳病毒属番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，香石竹斑驳病毒属(Ca rmovirus)的典型成员，病毒粒子呈正二十面体，直径观 33 nm。Ca rMV基因组为单组 分单链正义RNA，含4 003 η t，包括4个0RF，其中0RF2和0RF3与ORFl具有共同的起 始位点，分别为一次通读区和双重通读区，0RF4编码38 kD的外壳蛋白。CarMV靠汁液 摩擦传播，能侵染香石竹、中国石竹、甜石竹、苋色藜、菠菜、千日红等多种植物。引起香石 竹品种退化，长势衰弱，植株畸形，花叶，花枝变小，花碎色，叶茎和花出现枯斑，因而使产量和品质下降，降低了观赏价值和经济价值。CarMV在我国上海、北京、昆明等香石竹产地 广泛流行，发病严重，因而迫切需要建立实用的检测方法，为该病毒病的诊断和防治、脱毒 种苗的生产提供技术支撑。百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV) 是香石竹潜隐病毒属( Carlavirus)成员，病毒粒子为略弯曲的线状，无包膜，长610 700nm，直径12 15nm， 螺旋对称结构。病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长8394nt，含有6个0RF，其中0RF5 编码32kD外壳蛋白，基因组RNA 3'端有一个Poly(A) [1 3 ]。LSV的寄主范围很窄， 主要侵染百合科植物，单独侵染百合寄主时表现为隐症，与其它病毒复合侵染时则可引起 严重的田间症状，直接影响了百合的花和球茎质量，给花卉生产带来重大经济损失。目前，检测植物病毒的方法主要采用进口抗血清检测试剂盒进行酶联免疫吸附测 定(ELISA)以及用电镜直接观察组织中的病毒粒子，对检测设备和操作技能的要求较高，检 测成本高，无法用于田间快速检测。
发明内容本实用新型要解决的技术问题是提供一种成本低、使用简便、能够检测多种植物 病毒的蛋白芯片。为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，由固设于一背板上的至少两个不同种类的病 毒检测单元并列构成，每一个病毒检测单元的结构是在PVC载体上依次设有样品垫、胶体 金结合物垫、硝酸纤维膜和吸收垫；硝酸纤维素膜的一端通过胶体金结合物垫与样品垫相 搭接，硝酸纤维素膜的另一端与吸收垫相搭接；硝酸纤维素膜上设有植物病毒检测带T和 质控带C。所述胶体金结合物垫为由干燥的红色胶体金标记多克隆抗体的胶体金结合物垫。所述样品垫为玻璃纤维材质。所述吸收垫为棉浆板。所述质控带为羊抗兔IgG抗体。所述植物病毒选自番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、黄瓜绿斑驳病毒、香石竹斑驳病 毒和百合无症病毒中的至少两种病毒。所述蛋白芯片的外部还设有塑料罩，塑料罩上对应于蛋白芯片的样品垫和硝酸纤 维素膜的位置分别设有点样孔和检测窗。该塑料罩上还在相应位置标记有所检测病毒的名 称。本实用新型收集了 5种在日常检疫中要求检疫频率较高的病毒，即烟草脆裂病 毒、百合无症病毒、香石竹斑驳病毒、黄瓜绿斑驳病毒和番茄斑萎病毒，制备了 5种病毒的 多克隆抗体。利用制备的抗体研制了用于5种病毒检测的蛋白芯片，该芯片可以在20分钟 内检测到病毒的存在，并且具有较好的检测灵敏度，可以满足日常检疫对快速、灵敏、高效 的要求，芯片的检测结果稳定可靠，可用于各种食品安全监测机构、出入境检验检疫局及农 业系统对植物病毒的筛查。本实用新型的优点是蛋白芯片的使用方法简便，成本低廉，能够实现田间快速检 测，结果准确，为多种植物病毒病的诊断提供了有力的技术支持。[0019]以下通过实施例详细说明本实用新型的技术方案，并不以此限定本实用新型的实 施范围。
图1为本实用新型五联植物病毒检测蛋白芯片的整体结构示意图。图2为本实用新型五联植物病毒检测蛋白芯片的一个检测单元结构示意图。图3为本实用新型五联植物病毒检测蛋白芯片结合塑料卡套后的俯视示意图。
具体实施方式
实施例1 五种植物病毒多克隆抗体的制备一.材料1.供试毒株烟草脆裂病毒PPK20株系的基因组RNAl和RNA2。百合无症病毒采集于浙江丽水百合栽培基地自然感病的东方百合。香石竹斑驳病毒由浙江大学生物技术研究所植物病毒实验室鉴定保存。番茄斑萎病毒OIGPTsl和FopaTsl分离物分别来自日本绿辣椒和红辣椒。黄瓜绿斑驳病毒来自辽宁盖州市的西瓜病叶。2.实验动物实验用家兔为雄性新西兰大白兔。二.方法1.抗原的制备(1)烟草脆裂病毒抗原的制备以实验室保存TRV PPK20株系的基因组RNA1和RNA2的菌液相同体积混合 共浸润本氏烟，10-14d后收集病叶，并参照Hsu等(Hsu H T，Kim J Y，Lawson R H. Purification of lily symptomless virus and detection of the virus in lilies. Plant Disease, 1995，79: 912-916.，百合无症病毒的纯化及在百合中的病毒检测，植物 病害，1995，79 :912-916)的提纯方法略作修改，病毒即离心时在离心管底部加20%的蔗糖 溶液垫，病毒提纯液经洲磷钨酸(pH6. 7)负染色后置日本JEOL公司的JEM-1200EX透射电 镜下观察粒子形态。(2)番茄斑萎病毒抗原的制备基因克隆和原核表达载体的构建根据GenBank 中的 TSWVN 基因序列(GenBank Aeeession No. nl3926. 1)设计引 物，克隆TSWV N基因。通过RT-PCR方法扩增得到TSWV N基因，将割胶回收的PCR产物 及pET-3h分别用BamHI和B10I进行双酶切，酶切产物用V-GENE割胶回收试剂盒从琼脂 糖凝胶中回收目的DNA片段，用连接酶将回收的TSWV N基因亚克隆连接到原核表达质粒ρ ET-32a ( + )的多克隆位点上，构建成重组质粒ρ ET-3h-N。将重组质粒转入大肠杆菌 DH5a细胞中。诱导表达将含重组质粒的表达菌菌斑接种于含氨节青霉素抗生素(50 “留ml)的液体LB，37°C培养过夜，将过夜培养菌液以1:100转接于含氨节青霉素抗生素的新鲜液体LB中， 37°C继续培养至OD66tl=O. 6左右时加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，在37°C诱导培养4h。 取1000 μ L菌液离心收集菌体，加入hSDS样品缓冲液100 μ L悬浮并于沸水中煮5min， 12000rpm离心后取上清进行SDS — PAGE分析。表达产物在变性条件下的纯化将大量诱导后QOOmL)的菌液放冰上lOmin，60009离心IOmin后彻底去上清；沉 淀用5mL缓冲液B悬浮后于室温振摇60min至细菌充分裂解，12000r/min离心IOmin ；取上 清，加入2mLNi，+-N认agarose混勻后于室温振摇60min ；将混合液装入纯化柱，置于室温 下缓慢流下，弃流出液；用8 — IOmL缓冲液C洗柱3 — 4次；用4mL缓冲液D洗柱4次； 用4X0. 5mL缓冲液E洗脱蛋白，获得所需蛋白提纯液。纯化的6xHis融合蛋白经PBS透析 去除尿素，即为制备单克隆和多克隆抗体所需的抗原。(3)黄瓜绿斑驳病毒、百合无症病毒、香石竹斑驳病毒抗原的制备将黄瓜绿斑驳病毒、百合无症病毒和香石竹斑驳病毒用摩擦接种的方法分别接种 西葫芦、中国石竹和苋色藜，15天后收集叶片，按孔宝华等的方法提取植物病毒，即为制备 单克隆和多克隆抗体所需的抗原。病毒提纯液经洲磷钨酸(PH 6.7)染色后置日本JEOL 公司的JEM 21200EX电镜下观察粒子形态。2.制备多克隆抗体将纯化的抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，在雄性新西兰大白兔背部脊 柱两侧4点以及腹股沟和腋窝两侧进行多点皮下注射免疫，注射剂量一次为Iml左右。18 天后进行二次免疫，皮下注射前先与弗氏不完全佐剂充分乳化。以后每隔18天进行加强 免疫，加强免疫不加佐剂，并采用大腿肌注的方式进行。每次免疫后7天取少量血清，用间 接EL ISA测定抗体的效价，当效价达到1 32以上时，大量采血。将所血在室温下放置 1小时，4°C凝结过夜，收集血清即为病毒的多克隆抗体。抗血清于-80 °C冰箱中保存备 用。取血并分离血清即为病毒的多克隆抗体。抗血清于-80 °C冰箱中保存备用。实施例2.制备植物病毒检测蛋白芯片一.材料试剂各抗体原料(实施例1制备)，氯金酸，柠檬酸三钠，饱和硫酸铵，纯水。仪器台式高速冷冻离心机，划膜喷金仪HM3030 (Goldbio上海金标生物科技有 限公司)，斩切机ZQ2000 (Goldbio上海金标生物科技有限公司)，冷冻干燥机。二.方法1.胶体金及金标抗体制备(1)胶体金颗粒的制备运用柠檬酸三钠还原法，取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超 纯水成终浓度0. 01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1. 6ml 一次性迅速加入 煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后 继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。(2)胶体金标记抗体确定标记的原核表达蛋白最适稳定量和最适标记pH，进行 标记。得到的免疫胶体金复合物经超速离心法纯化，弃上清，用保存液悬起较疏松的红色沉 积物即为初步纯化的免疫胶体金复合物。以保存液作对照测530nm处OD值，4°C避光保存。2.条件优化[0057](1)免疫胶体金复合物稀释度的确定纯化的胶体金标记蛋白作不同程度稀释后， 均勻等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。组装试纸条，在其他条件不变的情况 下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记蛋白的稀释度，为工作浓 度。( 2 )金标垫的制备保存液稀释胶体金标记蛋白复合物原液至工作浓度，按比例均 勻浸于玻璃纤维素膜，-20°C冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。(3)样品垫的处理选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单 独或以适当比例组合后均勻浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。(4)蛋白在硝酸纤维素膜上的包被用0. 01mol/L的PB缓冲液(pH 7. 2)以各抗 体原料包被浓度，经Goldbio型HM3030点样仪线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测 试反应区，定义为检测带(T)，距离检测带5mm远的质控带(C)用点样仪线形包被羊抗兔 IgG(2mg/ml)。37°C干燥 2h，4°C密封保存。3.蛋白芯片的组装和分切根据功能不同可将试纸条分为四个部分上段(A区)为手持部位(吸水滤纸吸收 检测样品中多余液体)，中段(B区)为实验反应区(硝酸纤维素膜包括判读结果的检测带T 和指示试纸条质量的质控带C)，下段(D区)为样品区(玻璃纤维素膜接触待检测样品)，在 中下段之间(C区)放置浸有胶体金标记蛋白复合物的金标垫；而整个试纸条贴附于白色塑 料背板。利用抗体、硝酸纤维膜(N C膜)、结合垫、样品垫、背衬、塑料卡等材料加工组装成 试纸条和测试卡。三.蛋白芯片的检测(1)灵敏度检测5min时，判读检测带强度均在色卡号3左右。(2)交叉反应性检测均无交叉反应。(3)重复性和稳定性重复性CV < 5%，稳定性37°C—周无明显变化。实施例3. —种五联植物病毒检测蛋白芯片如图1所示，五联植物病毒检测蛋白芯片具有如下结构由固设于同一塑料背板 1上的5种不同的病毒(番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、黄瓜绿斑驳病毒、香石竹斑驳病毒和 百合无症病毒)检测单元2并列构成。如图2所示，每一个病毒检测单元的结构是在PVC载体21上依次设有样品垫M、 胶体金结合物垫23、硝酸纤维膜22和吸收垫25 ；硝酸纤维素膜22的一端通过胶体金结合 物垫23与样品垫M相搭接，硝酸纤维素膜22的另一端与吸收垫25相搭接；硝酸纤维素膜 22上设有植物病毒检测带T 221和质控带C 222。胶体金结合物垫23为由干燥的红色胶体金标记多克隆抗体的胶体金结合物垫； 样品垫M为玻璃纤维材质；吸收垫25为棉浆板；质控带C 222为羊抗兔IgG抗体。 如图3所示，所述蛋白芯片的外部还设有塑料罩3，塑料罩上对应于蛋白芯片的样 品垫和硝酸纤维素膜的位置分别设有点样孔31和检测窗32。该塑料罩上还在相应位置标 记有所检测病毒的名称。
权利要求1.一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于由固设于一背板上的至少两个不同 种类的病毒检测单元并列构成，每一个病毒检测单元的结构是在PVC载体上依次设有样 品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维膜和吸收垫；硝酸纤维素膜的一端通过胶体金结合物垫与 样品垫相搭接，硝酸纤维素膜的另一端与吸收垫相搭接；硝酸纤维素膜上设有植物病毒检 测带T和质控带C。
2.根据权利要求1所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于所述胶体 金结合物垫为由干燥的红色胶体金标记多克隆抗体的胶体金结合物垫。
3.根据权利要求1所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于所述样品 垫为玻璃纤维材质。
4.根据权利要求1所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于所述吸收 垫为棉浆板。
5.根据权利要求1所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于所述质控 带为羊抗兔IgG抗体。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在 于所述植物病毒选自番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、黄瓜绿斑驳病毒、香石竹斑驳病毒和 百合无症病毒中的至少两种病毒。
7.根据权利要求6所述的一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，其特征在于所述蛋白 芯片的外部还设有塑料罩，塑料罩上对应于蛋白芯片的样品垫和硝酸纤维素膜的位置分别 设有点样孔和检测窗。
专利摘要本实用新型公开了一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，属于检验检疫领域。一种检测多种植物病毒的蛋白芯片，由固设于一背板上的至少两个不同种类的病毒检测单元并列构成，每一个病毒检测单元的结构是在PVC载体上依次设有样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维膜和吸收垫；硝酸纤维素膜的一端通过胶体金结合物垫与样品垫相搭接，硝酸纤维素膜的另一端与吸收垫相搭接；硝酸纤维素膜上设有植物病毒检测带T和质控带C。本实用新型的优点是蛋白芯片的使用方法简便，成本低廉，能够实现田间快速检测，结果准确，为多种植物病毒病的诊断提供了有力的技术支持。
文档编号G01N33/569GK201867414SQ20102064325
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者吴建祥, 周雪平, 汪万春, 马新颖, 高文娜 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局