专利名称：组织分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织分析领域，特别涉及体外组织分析的方法，组织分析方法的应用和用于组织分析的试剂盒。
背景技术：
在进入昂贵并且潜在高危险的人体临床试验前，药物开发项目目前依赖于疾病的动物模型以评估新治疗药物的药效和毒性。这些动物系统的使用常常导致用于临床研发的候选组合物的不当选择，并导致花费多和相反的临床效果。哮喘病和慢性阻塞性肺病(COPD)是常见病。它们是危害健康的一个重大原因， 并对卫生经济造成沉重负担。这两种疾病的流行正在扩大，并且特别使人困扰是，与别的重大疾病(例如，心血管病)不同，COPD死亡率连续上升，预计到2020年将成为全球死亡的第三大原因。高达70%的具有这种情况的易患病病人的呼吸感染是由病毒引起，并存在引起严重的发病率和死亡率的潜在危险(Mallia，P. and S. L. Johnston. 2006.胸科 130:1203-1210)。哮喘和COPD感染的恶化使得呼吸道发炎增加，导致临床上会出现急性症状，如肺功能减退，呼吸困难，以及生命质量测评的下降。此外，对COPD病人而言，病毒感染容易引起二次细菌感染(Wilkinson, Τ. Μ. et al. 2006..胸科1 : 317-324)，这种现象可能由与被病毒损坏的上皮细胞结合的细菌数量增加引起(Hakansson，A. et al. 199.. 感染免疫学.62:2707-2714)。重大的研究尝试投入在模拟人体内炎症发生过程的COPD动物模型的建立中。这需要采用慢性刺激物如烟草香烟(Maeno T, et al. J免疫学2007; 178(12) 8090-8096)或者细菌副产物如LPS (Meng QR, et al. 呼吸毒理学2006; 18(8) 555-568)对呼吸道进行处理。几乎所有这些模型都专注于诱导肺气肿，但都只诱导出轻度的疾病(Churg A, Wright JL.微生物学文稿集2007; 14: 113-125)，这些模型均未表现出在更为严重人体疾病中见到的与吸烟有关的发病过程。吸烟诱导的慢性支气管炎或急性恶化的动物模型也还未建立。利用动物模型进行感染研究由于引起病理改变(Xatzipsalti M, Papadopoulos NG.微生物学文稿集2007; 14:33-41)和感染机制(例如鼻病毒的细胞结合所需要的 ICAM-I (Staunton DE, et al.细胞 1989; 56(5) 849-853)不存在于多数动物细胞中)中存在物种-特异性差异的事实而变得复杂化。尽管病毒诱导的哮喘恶化的人体模型已经被广泛利用(Papi A, et al.药理学及制药2007; 7(3) 259-265)， 除了在一项研究中利用感冒病毒以外(Mallia P, Johnston SL.胸科2006; 130(4) 1203-1210)，这种方法没有在COPD中广泛应用。研究者们对通常是年纪较大的并且具有心血管并发症风险的病人身上引发急性恶化担心其安全性和伦理学问题。因此，在体内模型中的应用很可能仍然是困难的，特别是用于利用新的抗病毒治疗方法的概念研究的证明。类似地，现有的哮喘恶化的动物模型几乎唯一地依赖于抗原攻击后的卵清蛋白的致敏作用，这种模型虽然在一定程度上模拟人体内过敏症的生理效应，但几乎肯定不遵循目前广泛认识的例如哮喘的疾病的复杂病理。
已通过利用支气管上皮细胞作简单的细胞培养进行了采用人体材料的研究。原代上皮细胞和气液界面(ALI)系统在哮喘病(Wark PA, J et al.实验医学学报2005; 201(6): 937-947)和COPD病中对病毒的反应提供了有价值的见解。然而，这些培养系统不能模拟上皮组织、免疫系统、病毒和呼吸道中环境刺激物之间相互作用的复杂性 (Wilkinson TM, et al.胸科 2006; 129(2) 317-324)。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种改进的模拟疾病的方法和/或开发用于特定疾病的药物或者治疗方法的方法。按照本发明第一方面，提供一种组织分析的方法，包括步骤 -提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；
-将组织样本中的细胞与试剂体外接触；
-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；
-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。按照本发明另一方面，提供一种模拟疾病状态的方法，包括步骤 -提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；
-将组织样本中的细胞与至少一种能引起疾病的试剂体外接触； -使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；
-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。按照本发明更进一步的一个方面，提供一种开发药物的方法，包括步骤
(a)-提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本； -将组织样本中的细胞与潜在的治疗试剂体外接触；
-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；
-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态；或者
(b)_提供取自于个体的包括至少两种不同类型细胞的组织样本，所述个体已经接受潜在治疗试剂的给药治疗；
-将组织样本中的细胞与试剂体外接触；
-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；
-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。在步骤(b)中，该方法用于确定潜在治疗试剂的疗效。另一种方案是，(b)中部分步骤是采用已知的治疗试剂而不是潜在的治疗试剂进行实施，同样这可以用于研究治疗试剂的疗效。优选地，检测手段(detection means)是用流式细胞术检测。优选地，该检测手段不通过免疫组织化学法检测。免疫组织化学技术只能用来区分在特定样本中两种不同细胞类型和/或状态。而且，采用流式细胞术比免疫组织化学法更迅速并可定量。
本发明方法具有可以帮助研究者检查并定量复杂的组织外植体内细胞变化的优点，并模拟药理学干预对疾病的影响，这种组织外植体是模拟体内条件。本方法同样有助于在疾病相关系统中使用来源于人的组织不会对个体产生风险的情况下，进行新治疗试剂的临床前测试。由该系统获得的实验结果也可能揭示新的疾病的机理，在临床试验前新化合物的潜在药效和毒性，或者加速并改善在药物开发进程中靶和化合物的选择。特别地，这种方法有助于在人体试验之前对治疗的“响应者”的鉴别，以及对具有风险或易患病的患者的鉴别，例如患有并存疾病的患者。该方法还可以实现对患有通常会将他们排除在临床试验外的相关既有疾病的个体进行试剂测试。该方法还可以作为从统计学上推动进一步临床研究的标志。组织样本包括结构组织，例如结缔组织、上皮组织、肌肉组织、或神经组织。已明确，术语结构组织是指包括非循环的体细胞的组织，即结构组织不包括红血球细胞。然而， 术语结构组织并不是用于排除存在于非循环组织中的白细胞。这种组织可包括非循环组织。优选的，该组织不是血液。该组织可包括下列组织类型中的一种或以上粘膜上皮组织、肿瘤组织、纤维组织、腺体组织、内皮组织、神经组织、肾脏组织、肝脏组织、肌肉组织、心脏组织、结缔组织、肺脏组织以及真皮组织。优选地，该组织是人体组织。优选地，该组织是人体肺脏组织的样本。组织样本包括至少四种不同类型的细胞，或者至少五种不同类型的细胞，或更多。优选地，组织样本是外植体组织。本方法中利用外植体组织(包括至少三种、四种、 五种或更多不同的细胞类型)的优点是更好地复制了组织中细胞的天然环境，其典型地包括不同细胞类型的混合(包括免疫细胞)。与利用更少数细胞类型的方法相比，例如采用细胞系单一培养的方法，本发明方法因此能提供一种更可靠和更准确的健康组织和疾病组织的反应模型。组织样本可取自健康个体或取自患有特定疾病的个体。这些样本可由活体组织检查的采集获得，或者从日常外科手术得到。组织样本可包括一种或以上真核细胞，原核细胞和病毒。组织样本包括一种或多种下列类型的细菌细胞，如胞外和胞内细菌；酵母/真核细胞；哺乳动物细胞，如上皮细胞， 内皮细胞，成纤维细胞，肌肉细胞，杯状细胞，脂肪细胞，感觉细胞，炎性细胞/免疫细胞，如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)，白细胞(白细胞)，如吞噬细胞(例如，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突细胞)，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，或其组合。本发明方法有助于实现在单个模型中的对许多不同细胞类型进行研究，因此，逼真复制了细胞所在的体内环境。细胞状态包括选自以下的组，已受感染细胞，如已被细菌或病毒感染的细胞；非感染细胞；被活化/受到刺激的细胞，例如，受到感染、过敏原/抗原、细胞信号或细胞活素的活化；被固定的细胞(例如，受到刺激/被活化)；活细胞；死细胞；濒死的细胞；分裂中的细胞；生长中的细胞；休眠细胞；以及存在特异抗原的细胞。例如，与未受感染细胞相比，受感染的细胞被认为具有不同的细胞状态，而与活细胞相比，死细胞被认为是处于不同的细胞状态。对不同细胞状态的检测提供的一个优点在于，可在复杂环境中对复杂疾病、药物相互作用、或感染的过程进行监测。
7
不同细胞状态和/或细胞类型可通过应用于本发明方法的三个或以上检测手段中的至少一种进行区分。检测手段(detection means)可被用于检测表明细胞类型或状态的特异性的细胞标志。例如，检测手段可与细胞内分子相互作用或结合，或与存在于细胞表面上的分子相互作用或结合，或与由细胞分泌的分子相互作用或结合。检测手段可与存在于细胞内或存在于细胞表面上的特征或小体相互作用或结合。例如，检测手段可与细胞内或细胞上的胞内微生物相结合，从而将处于受感染状态的细胞相对于不具有胞内微生物感染的非感染细胞区分开。蛋白质或分子的存在、缺乏、或大量可确定细胞状态。核酸序列的表达可确定细胞状态。细胞表面上存在的抗原可确定细胞状态。本发明方法可使用至少三、四、五、六、七、八、九、十或更多种不同检测手段。本发明方法至少可使用五种不同检测手段。使用至少三种或更多检测手段的优点在于，一些不同细胞类型和/或一些不同细胞状态可在同样的复杂环境中受监控。优选地，所使用的不同检测手段能够同时进行检测， 或实质上是同时进行检测的。优选地，流式细胞术(flow cytometry)用于检测不同的检测手段。通过应用具有不同波长的多激光的流式细胞计数器，能同时对多重检测手段进行分析。通过利用不同检测手段，例如可受相同或不同波长激发而发射出不同波长的光的不同的荧光基团，可同时获得多种参数。例如，在一种实施方式中，从多种荧光基团和三种激光中可产生并分析九种不同颜色。采用更多的检测手段(例如，荧光基团)和更多的检测方法 (例如，不同波长的激光)能对不同细胞状态和/或不同细胞类型作更多分析。检测手段可选自于抗体、探针，例如PNA探针、分子染色/染料，及配体或其组合。 检测手段包括活体染色/死体染色。检测手段可以是被标记的，例如是被荧光标记的。检测手段可包括经标记的抗体被安排结合到抗原决定簇上，该抗原决定簇是以特定细胞类型和/或细胞状态为特征性标志的。另一种方案是，或另外地，检测手段可包括经标记的PNA 探针，其包括被安排与存在于细胞上和/或细胞内的互补序列结合的序列，该互补序列是以特定细胞类型和/或细胞状态为特征性标志的。检测手段可包括抗体，优选地是单克隆抗体，荧光染料(例如，碘化丙啶、钙黄绿素乙酰甲酯、线粒体荧光探针)或其他类型的经荧光标记的探针(例如，PNA、DNA、蛋白质)。检测手段的靶目标可包括细胞表面标志、胞内蛋白、细胞骨架蛋白和/或病毒/细菌蛋白，和 /或核苷酸，或其组合。检测手段可包括抗细胞系(Lin-I)的混合物单克隆体，可选地是经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的。组织样本可通过酶消化法或物理分散法被分散/破碎。组织样本被消化后形成一种细胞悬浊液。组织样本可以利用胶原酶消化。组织样本可以利用胶原酶I消化，例如，来源于溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶。优选地，组织样本在分散前与试剂接触。优选地，在与试剂接触时，组织样本是完整的。利用胶原酶如胶原酶I的优点是其对胶原非常特异，因此，它不对检测手段如抗体造成干扰。组织样本所接触的试剂可包括引起疾病的试剂和/或潜在的治疗试剂。试剂可包括选自于病毒；噬菌体；细菌；真菌；朊病毒；药物；化学品；核酸，如RNA或DNA ；蛋白质；抗体；过敏原；氧化剂；激素；细胞信号分子；和毒素，如尼古丁 ；或其组合。该试剂可为前体分子，如前体药物。当试剂是引发疾病的试剂时，试剂可以是一种或以上的病毒；噬菌体；细菌；真菌；朊病毒；药物；化学物质；核酸，如RNA或DNA ；蛋白质；抗体；过敏原；氧化剂；激素；细胞信号分子；毒素，如尼古丁 ；或其组合。引起疾病的试剂可以是一种感染性的试剂或感染性试剂的一部分。当试剂是一种潜在的治疗试剂时，试剂可以是一种药物、前体药物、化学品、核酸、 蛋白质或抗体。本方法进一步包括将组织样本与抑制剂接触。抑制剂可以是治疗试剂的抑制剂， 或者，是引起疾病试剂的抑制剂。抑制剂可以包括任何一种选自于药物；抗病毒剂；抗生素；抗体；激素；核酸，如RNA或DNA ；蛋白质；噬菌体；细胞信号分子；和毒素；或其组合。抑制剂可为前体分子，如前体药物。试剂和/或抑制剂可以通过在载体内提供，如药物学有效的载体。本方法进一步包括对非活体并且非死体的样本中材料的检测和/或鉴别，所述材料如细胞碎片或聚集蛋白的凝块。该材料可以通过检测手段被检测和/或鉴别，优选地其利用活体/死体染色法被检测。对非活体并且非死体的材料的检测是有优越性的，其原因是组织消化释放出大片段结构蛋白，如弹性蛋白和胶原蛋白，这些蛋白的大片段是大到足以被流式细胞计数器错误地当作细胞进行记录。组织分析可用于以下一种或以上(i)分析试剂对组织的影响；(ii)当将组织与感染性试剂接触时，模拟组织中的发病过程；(iii )新的药物试剂的临床前毒性测试；(iv) 新的药物试剂的临床前药效测试；(V)对易受感染的个体的鉴别；(Vi)对易患疾病的个体的鉴别；以及(Vii)对疾病易感性的机制的鉴别。本发明方法可以被用来模拟人体肺的状况，如在体外模拟COPD和/或哮喘。本发明的方法可以用来研发治疗人体肺疾病的有效药物，如COPD和/或哮喘。结合使用临床相关的人体组织，相关刺激物例如呼吸病毒来模拟疾病，和对复合组织的单个组分的分析能力，是特别具有优越性的。利用人体支气管组织外植体在体外使用本发明方法，可以有利地实现对微生物诱导COPD和哮喘恶化的深入研究，并可以有助于开发利用现有技术尚无法研究的使用新治疗试剂的治疗方法。按照本发明的另一方面，还提供一种用于组织分析的试剂盒，该试剂盒包括用于区别组织样本中的不同细胞和/或细胞状态的多种检测手段。进一步地，试剂盒包括组织消化试剂，如胶原酶。进一步地，试剂盒包括实施本发明方法的使用说明。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法进行试剂对组织外植体影响的分析。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法在将组织样本与感染性试剂接触时对组织样本中发病过程的模拟。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法对一种或以上新药物试剂进行临床前的毒性和/或药效测试。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法对易受感染和/或易患疾病的个体进行鉴别。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法对疾病易感性的机制进行鉴别。按照本发明的另一方面，提供了利用本发明方法对特定治疗方法很有可能产生反应，或产生不良反应的个体进行鉴别。应当理解的是，适用于本发明一个方面或实施方式的可选择特征可以以任意方式组合使用，并可以以任意数量组合使用。而且，它们同样能与本发明的其他方面或其他实施方式以任意方式组合和任意数量组合使用。这包括但不限于从属权利要求，该从属权利要求是本申请权利要求中的衍生自任何被用当作是其他权利要求的从属权利要求的权利要求。
以下介绍本发明一种具体实施方式
，仅以实施例的形式结合以下附图进行介绍。图1所示为培养中的组织的流式细胞术分析结果；
图2所示为流式细胞术对由胶原酶分解活体材料得到的非活体/非死体材料进行检
测；
图3所示为由流式细胞术对培养细胞混合物中的结构细胞进行分类； 图4所示为由流式细胞术对胶原酶消化的肺组织的结构细胞的分析； 图5所示为由流式细胞术对胶原酶消化的肺组织的结构细胞进行分类； 图6所示为由流式细胞术对胶原酶消化的肺组织的炎性细胞的分析； 图7所示为流式细胞术和免疫组织化学对样本进行分析的比较； 图8所示为利用(A)氯化铵和奥司他韦；(B)新抗病毒成分(Rx)的基准模型； 图9所示为用于鉴别组织中不同细胞类型的流式细胞术中的设门策略(gating strategy)；
图10所示为免疫组织化学检测方法和流式细胞术对胶原酶消化的支气管肺组织样本中不同上皮细胞表型检测的比较；以及
图11所示为使用(A) X31和(B) Hmi流行株(A/新喀里多尼亚Λ0/99)随时间感染增加。(C)在健康志愿者被病毒感染后3天，鼻腔上皮组织中H3N2流行株的检测。
具体实施例方式材料
病毒储备液(储存于_80°C中) Virkon -来自飞世尔科技
支气管活体组织检查样本经可屈性纤维支气管镜检查取自于健康对照和患哮喘对象。外植体组织培养在新制备的AIM-V培养基中，补充加入青霉素50 IU/ml，链霉素 50 mg/ml,2mMl L-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，0. 5 μ g/ml两性霉素β和0. 004% (ν/ν)2_巯基乙醇(以上均来自hvitrogen)。组织在未进行添加的不含酚红的RPMI培养基(如Lonza公司基础RPMI方法)中消
10化，其中含有lmg/ml (w/v)来源于溶组织梭状芽孢杆菌(来自Sigma)的胶原酶I。将来自于经过消化的组织的细胞与抗体在FACS缓冲液(含0. 5% (w/v)牛血清蛋白(BSA)，2mM EDTA用Dulbecco，s磷酸缓冲液配制(DPBS-以上所有试剂均来自Sigma)，不含镁或钙)中进行孵育。利用Becton Dickson (BD)公司的细胞固定/细胞渗透的固定/渗透试剂盒 (Cytofix/Cytoperm Fixation/permeabilisation kit)，将来自于经消化的组织的细胞固定并渗透以进行胞内染色。利用FACS缓冲液将该试剂盒中的BD渗透/清洗(BD Perm/ Wash )稀释至1倍工作液。体外模拟呼吸道疾病中的药物干扰
支气管和薄壁组织的肺组织样本被获取和初步研究以确保外植体组织能够被培养且其细胞材料或细胞功能不会明显损失。活体/死体染料(购自Invitrogen)被用来评估存活细胞的数量。培养14天后，细胞数量没有明显的损失(图1)。并且，支气管样本的功能性纤毛在14天后仍然能够被观察到。因此，组织能在这些条件下进行培养长达两周而其功能或存活细胞没有明显损失。活体/死体染料，如来自于^wotrigen的，被用来鉴别和排除任何非活体以及非死亡的(图2)。这点是重要的，其原因是当胶原酶消化肺组织时也会释放出大片段的结构蛋白(例如，弹性蛋白和胶原蛋白)，这些大片段大到足以被流式细胞计数器误作为细胞进行记录。此外，当被流式细胞计数器所用的激光激发时，这些蛋白片段有自发荧光特性，并且也能非特异性地结合经荧光标记的抗体。这能从实质上将分析复杂化。因此，排除这些事件的能力会提高对肺组织分析的特异性。已经证明外植体中的细胞能通过利用活体/死体染色进行区别，用于区别外植体内不同结构和炎性细胞类型的经荧光标记的抗体可被获得并分析。为了证实并最优化抗体，为了能够利用不同抗体鉴别每一种细胞类型，来源于人体组织的培养细胞被用来利用不同的抗体对细胞表面标志的表达进行评估，而各个抗体经由彼此光谱不会重叠的荧光染料标记。所有流式细胞术的设门(gating)通过利用适当同型控制抗体进行设置。以下细胞类型已被研究，以下用于每种细胞类型的抗体已被滴定。为了证实本方法，利用细胞特异性抗体通过流式细胞术对五种细胞类型进行了分析。1.细胞类型通过支气管刷检获得的初代支气管上皮细胞(PBECs)-抗体=EpCAM PerCPCy5. 5 (CD326 - BD (Becton Dickinson 公司))。2.细胞类型通过支气管活体检测获得的已生长的初代人体肺成纤维细胞-抗体CD90 APC (BD)03.细胞类型来源于脐带的初代人体内皮细胞(HUVECs)-抗体⑶31 PE和⑶34 PECy7 (均为 BD)。4.细胞类型来源于经酶消化的支气管组织的初代人体呼吸道平滑肌--抗体 CD90 APC。5.细胞类型人体外周血液单核细胞(PBMCs)-抗体CD45 PE-AlexaFluor 610 -Invotrigen0一旦这些细胞类型被分别地区别，为了模拟肺组织，将这些细胞类型依据之前活体检测分析的比例混合在一起。为了进一步模拟碎片和死细胞，一定比例的每种类型细胞用过氧化氢杀死(60% PBECs, 20% PBMCs，10%成纤维细胞，10% HUVECS) 然后将细胞按类别再次培养以确保分析纯度(图3)。 已经证实了利用已知的细胞类型的混合物的方法后，该方法被用于肺组织外植体。 在将抗体用于肺组织之前，通过将如上所述的细胞混合物在胶原酶(lmg/ml) 37°C 并搅拌条件下孵育1.紐，确保了没有被抗体识别的抗原决定簇会受到胶原酶消化的负面影响。然后通过流式细胞术评估表面标记的表达情况。这里所描述的标记均未受到胶原酶处
理的影响。—旦确保了抗体的特异性及健壮性，整组抗体被应用于胶原酶分解的支气管组织 (图4)，并且细胞被分类。已观察到，在真实组织环境中抗体特异性仍然保留(图5)。此外， 已证实样本能被拆分，以致存在于CD45门通道中的白细胞同样被检出(图6)。所使用的抗体/标记是
1. CD3 PECy7用于鉴别T细胞。2. HLA-DR APCCy7用于鉴别巨噬细胞，树突细胞和T细胞活性。3. Lin-I FITC -对该标记呈阴性的细胞是树突细胞。4. CD25 PE用于检测T细胞活性。5.⑶8 APC用于鉴别⑶8+ T细胞和⑶4+ T细胞的阴性选择。一旦所有相关细胞类型在肺组织内被检出，组织随后受到感染性试剂的处理，以确定其是否能够通过前述流式细胞术的方法被检测到，以及更重要地以确定目前所用的用治疗试剂对组织的处理是否会影响所观察到的结果。实验室流感病毒株H3N2 X31被用于感染组织，并利用针对这种病毒的核蛋白(NP-I)培养的抗体来追踪被感染的细胞类型。在将肺组织与病毒接触之前，所使用的经荧光标记的NP-I抗体的数量通过用X31病毒感染PBEC 培养细胞并用流式细胞术量化感染量的方式被最优化。当NP-I在胞内表达时额外的并发症被引入，由此利用BD细胞固定/细胞渗透试剂盒将细胞固定并渗透，所以抗体可以检出病毒蛋白。同时经证实，无论是在培养初代细胞中或是在肺组织中，这一程序未对所选抗体造成干扰。为了确定这种病毒在肺组织中的最初的感染方式，被感染组织被包埋在乙二醇异丁烯酸(GMA)树脂中，并且利用未标记的NP-I抗体对组织进行免疫组织化学分析。使人惊奇的是，只有组织中的上皮细胞和巨噬细胞在经接触病毒后被感染，并且没有证据证明Mh 后感染扩散到其他细胞类型。随后，将免疫组织化学法的数据与使用流式细胞术所得的数据进行比较，发现两种技术在得到的数据上是相一致的(图7)，但更有利地是，流式细胞术的数据取得更快并且更容易定量。为了确保真实的感染被观察到而不是仅仅病毒颗粒与细胞的结合，一部分的X31 制剂经过UV灭活的并被用作为阴性对照。剂量反应和用病毒进行长达96小时的时间进程实验随后被实施，以最优化在支气管组织和薄壁组织中的检测系统。这些研究最初的结果是被感染细胞的百分数，但是额外的读数包括细胞培养上清液中病毒颗粒的释放量和受感染的上皮细胞上ULA-DR表达的上调已被最优化。为了确保这一系统同样适用于对病毒感染的非特异性抑制剂的药物测试，即氯化铵，和对神经氨酸酶抑制剂的药物测试，即奥司他韦，被使用。这一模型证明了两种化合物的药效(图8)。并且，这种方法已被证实有效用于流感病毒流行株H1N1和H3N3类型的检测 (图 11)。利用支气管组织以及薄壁组织来实施这一工作，证明了这一技术能被用于所有肺衍生材料。本方法提供了一种新的、快速的、且定量的方法，用于研究呼吸道疾病、呼吸道感染的机制和新治疗药物的药效。离体的肺组织的感染和分析方法方法
1.在室温下收集的组织样本，置于无菌的60ml瓶中。2.将组织样本转移到IOcm皮氏培养皿中，并切成2mm3小块。3.迅速将组织块转移到每孔加有DPBS的6孔板中。4.当组织样本完全切好时，通过完全除去DPBS并用基础RPMI替换对所有组织块进行清洗。重复这一步骤以除去血液。5.取Iml基础RPMI加入M孔板的每个孔中。6.用Iml移液管将组织样本块成对地转移到M孔板的每个孔中。7.完全除去RPMI，并用540 μ 1 AIM-V培养基替换。8.加入60 μ 1的IOx抑制剂储备液，并于37°C下孵育2h。9.除去培养基并用Iml基础RPMI清洗组织样本块。10.加入520 μ 1的AIM-V培养基和60 μ 1抑制剂。11.加入20μ 1的Χ31病毒或经UV灭活的Χ31。于37°C下进一步孵育2h。12.完全除去培养基并用Iml基础RPMI清洗组织样本块。重复一次。13.加入540 μ 1 AIM-V培养基和60ul抑制剂并进一步孵育20小时。14.如果培养更长时间，每隔M小时重复第12和13步。15.对培养基取样，取出200μ 1用于进行病毒排出检测。16.收集组织样本块，并转移到每5ml 1份的消化缓冲液中，置于内含磁珠的25ml
普通试管中。17. 37°C下震荡培养 90min。18.利用Iuer接口的2. 5ml注射器将混合物通过100 μ m的过滤器进行过滤，注入聚丙烯FACS试管中。19.在4°C下将细胞以400g转速离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重新悬浮在 100 μ 1含有2mg/ml来源于人体血清的IgG的FACS缓冲液中。20.按以下比例对每个样本进行表面标记的细胞染色 每份样本
10 μ 1 EpCAM PerCPCy5. 5 10 μ 1 CD45 PE AF610 为分析结构细胞加入 5 μ 1 HLADR APCCy7 5 μ 1 CD31 PE5 μ 1 CD34 PECy7
2. 5 μ 1 1:10 CD90 APC 稀释液
为分析炎性细胞加入
5 μ 1 HLADR APCCy7
5 μ 1 CD8 APC
5 μ 1 CD25 PE
2· 5 μ 1 CD3 PECy7
21.在冰上孵育30分钟，并加入2ml的FACS缓冲液。在室温下以400g转速离心5min。22.弃去上清液，将细胞重新悬浮在200 μ 1的固定/渗透液中。在黑暗环境中于冰上孵育20min。23.加入aiil的渗透清洗液并于室温下以400g转速离心5min。24.将细胞重新悬浮在100 μ 1的渗透清洗液中并加入1 μ 1的NP_1 AF488抗体。 在黑暗环境中于冰上孵育30min。25.加入2ml的渗透清洗液并于室温下以400g转速离心5min。26.弃去上清液，并将细胞重悬于500 μ 1的FACS缓冲液中。27.直到进行分析实验前，储存在4°C黑暗环境中。在应用于FACSAria之前，经 FACS过滤器进行过滤。28.利用未染色对照和同型对照管对FACSAria进行设门(图9)。29.对NP-1+ve细胞数量进行定量。总结
本文所介绍的方法提供了一种药物开发平台，用于抗炎症、抗细菌和抗病毒化合物的鉴别和测试，尤其是对于尚未获得批准在人体内使用的化合物，为阶段I试验提供概念数据证据。而且，本方法不限于呼吸道的流感或仅仅是病毒感染。只要特异性荧光标志检测方法存在(例如，抗体或PNA探针)，本模型能够被扩展到其它病毒以及细菌和其它组织。此外，本方法同样适用于揭示慢性疾病潜在的新机制，如呼吸疾病中的哮喘和COPD病，并可用于测试针对这些新靶向的治疗药物。本方法同样还适用于评估药物毒性，通过活体/死体染色法，半胱天冬酶的活性检测或通过检测组织培养基中的任一种。本方法不但可以用于药物测试，还可用于查明人体对病毒的易感性。肺上皮的病毒感染是混合型的，不像培养中上皮细胞的感染(图8)，并且可能不同细胞类型对感染有不同的易感性。通过使用经标记的抗体，对抗例如杯状细胞(MUC5AC)、纤毛上皮细胞(乙酰化的α-微管蛋白)和基底上皮细胞(CD151)，本方法可以被用来辨别某种特定的细胞类型是否是最初感染的主要靶目标(图10)。此外，不同品系流感病毒被认为与表达某种唾液酸同位素的细胞结合。本发明方法可以利用经荧光标记的对这些唾液酸有特异性结合性的凝集素，对他们的表达是否与对感染的敏感性有关进行研究。这种技术可以推广到其它微生物如能结合细胞表面标记⑶讨(ICAM-I)的鼻病毒。这广泛证实了此处描述的体外人体支气管组织外植体模型可用于实现对微生物诱导的COPD和哮喘病恶化过程的深入研究，并且有助于开发利用现有技术尚无法研究的使用新治疗试剂的治疗方法。存在于粘膜中的大部分细胞类型可以通过比传统方法更高的生产量实现分析，并且这项技术极大地改进了对支气管内细胞进程的定量分析的能力。并且，本方法能够实现与COPD和哮喘恶化有关的病毒诱导的呼吸道炎症的体外研究。由于所用组织已经是疾病特异性的，本方法对动物和体内系统均作出了改进。 目前为止，利用人体组织仅限于简单的细胞培养系统，其无法反映人体疾病的复杂性。本发明方法提供了有效的人体疾病模型，用以证实开发治疗药物的新方法中的宿主靶细胞，如抗病毒药物。
权利要求
1.一种组织分析的方法，包括步骤-提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；-将组织样本中的细胞与试剂体外接触；-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。
2.一种模拟疾病状态的方法，包括步骤-提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；-将组织样本中的细胞与至少一种引起疾病的试剂体外接触；-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。
3.按照本发明进一步的一个方面，提供一种开发药物的方法，包括步骤(a)-提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；-将组织样本中的细胞与潜在的治疗试剂体外接触；-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态；或者(b)_提供取自于个体的包括至少两种不同类型细胞的组织样本，所述个体已经接受潜在治疗试剂的给药治疗；-将组织样本中的细胞与试剂体外接触；-使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；-检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段是用流式细胞术进行检测。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本包括结构组织。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本包括非循环组织。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本包括以下组织类型中一种或以上 粘膜上皮组织、肿瘤组织、纤维组织、腺体组织、内皮组织、神经组织、肾脏组织、肝脏组织、 肌肉组织、心脏组织、结缔组织、肺脏组织和真皮组织。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本是外植体组织，或来源于外植体组织的培养物。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本包括以下类型中的一种或多种细胞细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中，哺乳动物细胞包括以下类型中的一种或多种上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、杯状细胞、脂肪细胞、感觉细胞、和炎性细胞/免疫细胞。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中，细胞状态包括任意选自于以下已受感染细胞非感染细胞；被活化/受到刺激的细胞；被固定的细胞；活细胞；死细胞；濒死的细胞；分裂中的细胞；生长中的细胞；休眠细胞；以及存在特异性抗原的细胞；或其组合。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中，不同的细胞状态和/或细胞类型可以用本方法中所用的两种或以上检测手段中的至少一种检测手段进行区分。
13.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段被用于检测表明细胞类型或状态的特异性细胞标志。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段与细胞中的分子，或细胞表面上的分子，或由细胞分泌的分子相互作用或结合。
15.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段与细胞中或细胞表面上存在的特征或小体相互作用或结合。
16.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段与细胞内或细胞上的胞内微生物结合，并且将处于受感染状态的细胞相对于不具有胞内微生物感染的非感染细胞区分开。
17.根据前述任一项权利要求方法，其中，蛋白质或分子的存在、缺乏或大量可确定细胞状态；或核酸序列的表达可确定细胞状态；或细胞表面上存在的抗原可确定细胞状态。
18.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段是选自于抗体，探针，如PNA探针，分子染色/染料，和配体，或其组合。
19.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段包括活体染色/死体染色。
20.根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段是经荧光标记的。
21.依据之前权利要求根据前述任一项权利要求的方法，其中，检测手段的靶目标包括细胞表面标记，细胞内蛋白，细胞骨架蛋白和/或病毒/细菌蛋白，和/或核苷酸，或其组口 O
22.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织样本是由酶消化或物理方法分散/破碎。
23.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织被消化而形成细胞悬浊液，可选择地是使用胶原酶进行消化。
24.根据前述任一项权利要求的方法，其中，与细胞接触的试剂包括感染性试剂和/或潜在的治疗试剂。
25.根据前述任一项权利要求的方法，其中，试剂包括任意选自于病毒，噬菌体；细菌； 真菌；朊病毒；药物；化学品；核酸；蛋白质；抗体；过敏原；氧化剂；激素；细胞信号分子； 和毒素；或其组合。
26.根据前述任一项权利要求的方法，其中，本方法进一步包括将细胞与抑制剂接触。
27.根据权利要求沈的方法，其中，抑制剂是治疗试剂的抑制剂，或者，是感染性试剂的抑制剂。
28.根据权利要求沈或27的方法，其中，抑制剂包括任意选自于药物；抗病毒剂；抗生素；抗体；激素；核酸，如RNA或DNA ；蛋白质；噬菌体；细胞信号分子；和毒素；或其组合。
29.根据前述任一项权利要求的方法，其中，本方法进一步包括检测和/或鉴别非活体且非死体的样本中的材料。
30.根据前述任一项权利要求的方法，其中，组织分析可用于以下一种或以上(i)分析试剂对组织样本的影响；(ii)模拟在与感染性试剂接触时组织样本中的发病过程；(iii) 新的药物试剂的临床前毒性测试；(iv)新的药物试剂的临床前药效测试；(ν)对易受感染的个体的鉴别；(Vi)对易患疾病的个体的鉴别；以及(vii)对疾病易感性的机制的鉴别。
31.用于组织分析的试剂盒，包括用于区别组织样本中的不同细胞和/或细胞状态的多种检测手段。
32.根据权利要求31的试剂盒，其中，该试剂盒进一步包括组织消化试剂。
33.使用根据权利要求1-30中任一项的方法进行以下一种或多种(i)分析试剂对组织外植体的影响；(ii)模拟组织样本在与感染性试剂接触时的发病过程；(iii) 一种或以上新药物试剂临床前毒性和/或药效测试；(iv)鉴别易受感染和/或易患疾病的个体；(ν) 鉴别对特定治疗方法很有可能产生反应或产生不良反应的个体；以及(vi)鉴别对疾病易感性的机制。
全文摘要
本发明提供了组织分析，疾病模拟或药物开发的方法，包括步骤提供包括至少两种不同类型细胞的组织样本；将组织样本中的细胞与试剂体外接触；使细胞与三个或以上的用于区别三种或以上不同细胞类型和/或不同细胞状态的检测手段接触；检验检测手段从而确定样本中的不同细胞类型和/或不同细胞状态。本发明进一步提供了用于实施本发明方法的试剂盒以及本发明方法的应用。
文档编号G01N33/80GK102439458SQ201080021912
公开日2012年5月2日 申请日期2010年5月19日 优先权日2009年5月21日
发明者卡尔·詹姆斯·史铁波, 托马斯·迈克尔·艾伦·威尔金森, 拉德科·迪尤卡诺维科, 本杰明·里奥·尼古拉斯 申请人:南安普敦大学