专利名称：一种同时检测苹果中五种多酚并进行品种识别的hplc方法
技术领域：
本发明涉及一种苹果中五种多酚的检测方法，特别涉及利用多酚检测含量进行不同品种的识别方法的建立。
背景技术：
多酚类物质是具有苯环并结合有多个羟基化学结构的物质总称，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等。一般作为生长代谢中的次生产物，广泛存在于植物的组织中，对植物的生长发育和调节，基因的诱导表达，信号转导，紫外辐射的吸收，生物固氮以及果蔬加工过程中风味的形成，颜色变化(如褐变)，果蔬饮料的混浊与沉淀，等都有一定的影响。其中，没食子酸，绿原酸，咖啡酸，原儿茶酸和芦丁是植物中广泛存在的五种多酚，以其抗病毒，抗癌症等药理特性越来越受到中外学者的关注。这五种化合物的结构式如下所
不
权利要求
1.一种同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法，其特征是，包括以下步骤(1)苹果的前处理将苹果去核，加入足量的抗坏血酸水溶液，用榨汁机粉碎后采用超声、氮气保护或加热方法防止褐变；(2)多酚物质的提取采用甲醇-水溶液或乙酸乙酯提取，所述甲醇-水溶液提取为称取粉碎好的苹果样品，加入甲醇-水溶液，涡旋震荡后超声；离心，将上清液过滤至烧瓶，然后重复萃取一次， 合并上清液；取上清液过0. 45 μ m的滤膜，然后用HPLC检测；所述乙酸乙酯提取为称取粉碎好的苹果样品，加入乙酸乙酯，涡旋震荡后超声；离心，将上清液过滤至烧瓶，然后重复萃取一次，合并上清液；旋转蒸干后用乙腈定容，然后用HPLC检测；(3)五种多酚的同时检测HPLC-DAD检测色谱柱=Atlantis C18，规格为5 μ m, 250mmX 4. 5mm，选择柱温，选择流动相梯度洗脱，选择测定波长后检测；(4)多酚含量测定方法的建立用甲醇-水溶液逐级稀释五种多酚标准品，配制成一组混合工作标准溶液，以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，分别建立标准校正曲线，在检测样品时，根据样品所得的相对响应值，然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
2.如权利要求1所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法，其特征是，所述步骤(1)采用超声方法防止褐变，所述抗坏血酸溶液的质量百分浓度为1%。
3.如权利要求1所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法，其特征是，所述步骤(2)多酚物质的提取为称取5g粉碎好的苹果样品，加入20mL甲醇-水溶液，涡旋震荡IOs 后超声30min，以4000rpm离心5min，将上清液过滤至150ml烧瓶，然后重复萃取一次，合并上清液；取2. Oml上清液过0. 45 μ m滤膜后，取40 μ L用HPLC检测，所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1 1。
4.如权利要求1-3中任意-项所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法，其特征是，所述步骤(3)流动相为A 乙酸-水溶液，B:乙腈；所述梯度洗脱为流速为Iml/ min，初始比例为流动相A B体积比95 5，到18min时流动相A B体积比变为65 35， 到19min时恢复为95 5，柱温35°C，检测波长为270nm，检测时间20min。
5.如权利要求1-3中任意一项所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法，其特征是，所述骤(4)多酚含量测定方法的建立为首先称取五种多酚标准品各10mg，分别用甲醇-水溶液溶解为lmg/mL的标准储备液于_20°C保存，然后用甲醇-水溶液继续稀释到 10ug/mL的中间液，密封保存于4°C ；配制混合标准溶液，用甲醇-水溶液逐级稀释使绿原酸含量为1-100 μ g/mL，其他四种多酚含量为0. 5-50μ g/mL ；然后以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，分别建立标准校正曲线，在检测样品时，根据样品所得的相对响应值，然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量，所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1 1。
6.利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法，其特征是，将不同品种不同地区的苹果按照权利要求1所述方法进行处理，并对其五种多酚含量数据进行比较，选择含量差距较大的两种多酚作为分布图的横纵坐标做出分布图，然后利用测定的待测苹果的多酚含量数据，通过分布图找出待测苹果所对应的品种和产地。
7.如权利要求6所述的利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法，其特征是， 选择绿原酸和芦丁含量作为分布图的横纵坐标做分布图。
8.如权利要求6或7所述的利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法，其特征是，所述不同品种不同地区苹果的处理方法为称取5g勻质好的苹果样品，加入20mL体积比1 1的甲醇-水溶液，涡旋震荡IOs后超声30min，以4000rpm离心5min，将上清液过滤至150ml烧瓶，然后重复萃取一次，合并上清液；取2. Oml上清液过0. 45 μ m滤膜后，取 40yL用HPLC检测；根据样品所得的相对响应值，然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测苹果中五种多酚并进行品种识别的HPLC方法。它首先将苹果去核，加入抗坏血酸，粉碎后采用超声、氮气保护或加热方法防止褐变，然后加入甲醇-水溶液或乙酸乙酯超声提取，收集上清液后重复提取一次，合并上清液，进行HPLC检测。根据不同品种不同地区所测五种多酚含量分析，采用绿原酸和芦丁作为目标化合物对七个不同苹果品种进行识别。本发明采用HPLC同时快速分离测定五种多酚，并达到对不同品种的苹果识别的目的，此方法样品前处理简单，成本低，可同时测定，实现了对不同品种苹果的识别。
文档编号G01N30/06GK102175790SQ20111000217
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者吕潇, 李增梅, 苑学霞, 谷小红, 赵善仓, 邓立刚, 郭长英, 陈学兵, 陈宁宁 申请人:山东省农业科学院中心实验室