专利名称：菖蒲对柴油胁迫生理响应特征的表征方法
技术领域：
本专利涉及一种菖蒲(Acorus calamus Linn)对柴油胁迫生理响应特征的表征方
法。
背景技术：
随着石油化工行业的发展，在石油的大规模开采、冶炼、运输、使用和处理过程中， 污染、遗漏、井喷、输油管道泄漏等事故频发，而且海上石油作业的规模越来越大，漏油随着海水冲到近海及海岸湿地，溢入水中的污油会逐渐发生物理风化(如蒸发、乳化、扩散、溶解、吸附和沉降)、化学风化(主要是光降解作用)和生物风化(主要是生物降解)等作用。溢油刚进入水体后，由于油膜很厚会迅速向四周扩展，当油层变薄和破裂为碎片后就加速了油层面积并加强了风化过程例如蒸发、溶解和乳化作用进程。水面上的石油类中的低分子量的苯类和多环芳烃类致癌物质有极少部分可溶解于水中，其它组分在波浪作用及经过蒸发、乳化及吸附作用后而产生重质油或残余油，这部分污油会向岸边聚集，这些剩余部分逐渐聚合成浙青块，它们与江岸相互作用并被吸附，某些悬浮油滴及重质组分会附着在悬浮颗粒物质上而慢慢下沉到底部沉降下来进入沉积物中或漂浮于岸边的湿地中。溢油不仅会污染有关的水域，也会导致严重的岸边土壤环境污染，直接或间接地破坏湿地植被及其生态环境。目前使用的石油类污染环境修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复等， 传统的物理化学修复方法成本高，且容易带来二次污染，微生物修复的方法可能会导致细菌等微生物对土壤和地下水的生物性污染。植物修复是一种绿色原位修复技术，所收获的植株可以进行集中处理，不会造成二次污染，同时植物修复进程不仅不会破坏土壤生态环境，还有助于改善因油污染而引起的土壤退化和生产力下降，恢复并提高其生物多样性。利用植物来修复石油类污染环境正逐步成为未来油污治理研究的一个重要方向。而植物对油污胁迫生理响应特征的表征方法，将为石油类污染环境的植物修复和环境污染风险评价提供有效的理论依据和基础技术支持。目前有关植物对石油类胁迫的生理生态响应研究并不多，还没有形成规范统一的表征方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种湿地植物菖蒲(Acorus calamus Linn)对柴油胁迫生理响应特征的表征方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为
一种菖蒲对柴油胁迫生理响应特征的表征方法，其特征在于该方法的具体步骤为 取菖蒲叶片组织用联苯胺染色后，测试菖蒲叶片组织细胞中的过氧化氢的浓度应小于 IOOOOmg · kg-1。本发明通过预实验筛选出来能够耐受柴油污染环境的湿地植物菖蒲作为试验植物，菖蒲在我国南北各地均有分布，并广布世界温带及亚热带。它生于池塘、湖泊岸边浅水区，沼泽地或泡子中。菖蒲最适宜生长的温度为2(T25°C，它在10°C以下就会停止生长。菖蒲冬季以地下茎潜入泥中越冬，属于多年水生草本植物。菖蒲有香气，根状茎横走，粗稍扁，直径0. 5 2cm，有多数不定根(须根)。叶基生，叶片剑状线形，长5(Tl20Cm或更长，中部宽广3cm，叶基部成鞘状，抱茎，中部以下渐尖，中助脉明显，两侧均隆起，每侧有3飞条平行脉；叶基部有膜质叶鞘，后脱落。花茎基生出，扁三棱形，长2(T50cm，叶状佛焰苞长 2(T40cm。肉穗花序直立或斜向上生长，圆柱形，黄绿色，长圹9mm，直径6 12cm ；花两性，密集生长，花被片6枚，条形，长2. 5mm,宽Imm ；雄蕊6枚，稍长于花被，花丝扁平，花药淡黄色； 子房长圆柱形，长3mm，直径1.2mm，顶端圆锥状，花柱短，胚珠多数。浆果红色，长圆形，有种子广4粒。花期6 9月，果期8 10月。本发明方法是以典型湿地植物菖蒲为试验样本，选取属于石油类污染物的柴油为污染物，在不同浓度梯度的柴油污染基质中培养菖蒲，注意不定期浇水，保持基质的饱和含水率；菖蒲在萌发及生长过程中，其细胞组织会对不同浓度梯度的柴油污染胁迫产生不同的生理响应，研究中采用联苯胺(3，3-diaminobenzidine-HCl, DAB)染色液为染色 剂，它能与菖蒲细胞中的过氧化氢产生红褐色斑点。利用这一原理可以明显地检测到在柴油胁迫下湿地植物叶片细胞是否受到氧化损伤？是否产生了过氧化氢以及产生数量的多少？实验中如果产生的红褐色斑点越多，那么就证明菖蒲叶片中的过氧化氢产生量越多；这样就可以利用这种方法表征湿地植物菖蒲对柴油胁迫的生理响应特征。为了进一步探讨柴油污染物对菖蒲的氧化损伤是否已对其DNA造成了影响？本发明还探讨了将菖蒲根细胞的原生质体提取并进行单细胞凝胶电泳实验，最终染色后在荧光显微镜下观察发现柴油污染物对菖蒲根细胞造成的氧化损伤的微观响应特征，并证明当柴油污染浓度在IOOOOmg · kg"1范围内时，在早期生长阶段一般不会进一步损害菖蒲的DNA 或对DNA产生的损伤比较轻微。本发明通过试验发现菖蒲叶片中过氧化氢测定可以表征菖蒲对柴油胁迫生理响应特征，而单细胞凝胶电泳实验测定的DNA损伤则不能作为表征菖蒲早期阶段对柴油胁迫生理响应特征的指标。本发明针对柴油污染的湿地环境，利用菖蒲实验探索能够表征柴油胁迫下植物生理响应特征的研究方法，建立规范统一的表征植物对石油类污染物胁迫下生理响应特征的生物学方法和油类环境污染导致植物损伤的监测系统，更好地修复石油类污染的湿地土壤环境，更加有效地进行油类环境污染风险评价研究。
具体实施例方式选择柴油为单一污染物，通过预实验得到菖蒲的耐受范围，然后设置6个平行浓度，分别为0，2000，4000，6000，8000及IOOOOmg · kg"1 (干砂)拌入盛有50g干砂样的培养基(90mmX15mm)中，选取已灭菌的菖蒲种子30颗放入培养基中，在人工气候室(28°C， 12/12h)中培养50天，定期观察菖蒲种子萌发情况，及时添加无菌水，试验期间，注意保持各培养基含水量一致，沙土始终保持湿润及一定的含水量。待菖蒲生长到30天，各个培养基中的菖蒲长势可以明显区分时，在各培养皿中分别取三株长势相当、生物量相近的菖蒲进行试验一，与此同时再在各培养皿中分别取三株长势相当、生物量相近的菖蒲进行试验二。试验一分别取剖成薄片的菖蒲叶片浸入DAB染色液中，25°C避光染色8h，将DAB 染色液完全吸出，蒸馏水清洗4次后加入无水乙醇在40°C水浴加热脱色，光学显微镜40倍下观察其染色情况。试验二 分别取广5mm根尖细胞酶解法提取原生质体，利用0. 75%和0. 65%的正常熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖制作“三明治”凝胶，在碱性电泳液中电泳20min，溴化乙锭染色后在荧光显微镜上观察染色情况。叶片受不同浓度的柴油胁迫产生红褐色斑点，柴油浓度为2000mg -kg"1时，被染色的红褐斑很少，植物体内过氧化氢积累相当少；当柴油浓度上升为4000mg · kg"1时，菖蒲植物叶片中的保卫细胞均被染成褐色，说明该处过氧化氢积累较多，并且呈叶脉状条形分布； 当浓度继续增大至8000mg .kg—1及IOOOOmg .kg—1时，菖蒲 的整个叶片大部分已被染成深红褐色，过氧化氢严重积累，证明柴油污染物的胁迫已经严重损害到了植物的生理活动，使得菖蒲叶片不能很好的生长，继续培养，菖蒲整个植株生长缓慢，并逐渐趋向死亡。因此，可以用菖蒲叶片中过氧化氢测定来表征湿地植物对柴油污染胁迫的生理响应特征。环境中的一些理化因素对湿地植物生长会造成严重的影响甚至遗传损伤。对菖蒲发芽后30天的菖蒲幼苗进行实验，选取与柴油接触密切的菖蒲根作为试验材料进行单细胞凝胶电泳试验。可以看出，基本上没有看到彗星拖尾现象，而且经多次实验证明确实看不到彗星拖尾现象，也就是未发现柴油污染物剂量_反应关系。分析可能原因是柴油污染物对菖蒲的DNA未达到直接损害或者损害水平很低；柴油污染物刺激菖蒲的植物细胞产生过氧化氢等一系列电子基团会对其DNA产生一定的刺激，但其刺激并没有达到实验显著水平，并没有引起其DNA发生突变。因此实验发现利用单细胞凝胶电泳实验测定的植物DNA 损伤不能作为表征菖蒲早期阶段对柴油胁迫生理响应特征的指标。本发明通过试验研究发现，测定湿地植物菖蒲叶片中过氧化氢可以作为表征菖蒲对柴油胁迫生理响应特征的生物学方法；而通过单细胞凝胶电泳实验测定的DNA损伤则不能作为表征菖蒲早期阶段对柴油胁迫生理响应特征的指标。该项发明可以为石油类污染湿地环境的植物修复以及建立石油类污染引起植物损伤的监测系统和环境污染风险评价提供理论依据和基础技术支持。
权利要求
1. 一种菖蒲对柴油胁迫生理响应特征的表征方法，其特征在于该方法的具体步骤为取菖蒲叶片组织用联苯胺染色后，测试菖蒲叶片组织细胞中的过氧化氢的浓度应小于 IOOOOmg · kg-1。
全文摘要
本发明涉及一种菖蒲对柴油污染胁迫的生理响应特征的方法，该方法的具体步骤为取菖蒲叶片组织用联苯胺染色后，测试菖蒲叶片组织细胞中的过氧化氢的浓度应小于10000mg·kg-1。本发明针对柴油污染的湿地环境，利用菖蒲实验探索能够表征柴油胁迫下植物生理响应特征的研究方法，建立规范统一的表征植物对石油类污染物胁迫下生理响应特征的生物学方法和油类环境污染导致植物损伤的监测系统，更好地修复石油类污染的湿地土壤环境，更加有效地进行油类环境污染风险评价研究。
文档编号G01N21/64GK102183498SQ201110043819
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者刘发辉, 刘晓艳, 刘珊珊, 张新颖, 苏鹏程, 赵婉余, 陈丽莎, 顾蓓莉 申请人:上海大学