专利名称：基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法
技术领域：
基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，属于蜂蜜质量检测技术领域。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂通过采集植物的花粉和活体植物的分泌液，经自身所含有的特殊物质充分酿造而成的粘稠的、甜味的液体，是一种有益于人体健康的天然的甜味食品，作为甜味成分和功能成分，被广泛用于食品、医药和保健品工业。我国年产蜂蜜30万吨左右，全国现有蜂农约30万人，蜂产品加工企业2000余家， 年产值约80亿元。目前在世界市场上，蜂蜜的年贸易量在23万吨左右，我国年出口大约10 多万吨，出口的蜂蜜原料约占国际蜂蜜市场总量的20%，占世界蜂蜜年贸易量的43%，居世界第一，中国已成世界上最大的蜂产品生产和出口国。我国蜂蜜主销日本、欧盟、美国等国家和地区，年均创汇约1亿美元，蜂蜜生产与出口对农作物授粉、农民致富和出口创汇起到了不可替代的积极作用。然而，近年来面对我国蜂产品出口的快速增长，欧美等国家纷纷对我国蜂产品采取各种限制措施，设置各种非关税壁全，提出许多相当苛刻的蜂产品药物残留标准，例如氯霉素的控制限量为0. 1 μ g/kg，而蜂蜜中需要检测的污染物种类更是多达100多种，在出口蜂蜜中任何一种污染物超标都会对我国蜂蜜出口造成重大的经济损失。例如1994年欧盟(EU)出台了禁止在一切食用动物养殖中使用氯霉素的规定。在 2001年，欧盟在我国出口虾仁中多次检出氯霉素，随后在蜂蜜等产品中也检出氯霉素。以此为由，2002年1月，欧盟对包括蜂蜜在内的100多种中国产动物源性产品禁止进口，并引发美国、日本、加拿大、沙特、捷克等多个国家的连锁反应。自此以后的数年间，我国蜂蜜、蜂王浆不能向欧盟出口，向美国、日本、加拿大等国家的出口也严重受阻，这给我国养蜂、蜂产品生产和出口企业造成了重大的经济损失，也给我国蜂业界，包括生产、销售、外贸部门以及蜂产品经营等方方面面敲起了警钟。直到2006年，欧盟、美国等才相继开放我国动物源产品的进口，但大幅度提高了对中国蜂产品药物残留的检出限量要求。由于检测标准提高到了十分苛刻的程度，使我国蜂产品出口仍然受到很大的限制。如何从源头抓起，按欧盟等进口国要求建立残留监控体系，做到科学养蜂、合理用药已成了蜂业界的共识和整个行业急需解决的重大问题。但是，由于我国蜜蜂养殖户规模小，素质低，转场频繁，因而监控难度大，农药、抗生素、重金属等污染物超标现象时有发生。尽管目前我国和相关蜂产品进口国都相继出台了大量关于农药、抗生素等污染物检测的国家标准和国际标准，但这些方法大都注重检测的准确性而忽略了检测的快速性和成本等因素，因而具有检测速度慢、检测品种少(一个标准一般只能检测一种污染物)，检测费用高等缺点。对于我国蜂蜜养殖户小而分散的国情， 若对散户销售的蜂蜜每批都采用国标进行全面检测显然是行不通的。因为做一次污染物的全面检测需要数万元人民币，而对于大多数散户来说，其产品的全部销售利润可能还不够支付检测费。但若不能采取有效的检测技术来及时剔除个别不法蜂农混入的污染物超标的蜂蜜，而在最终的出口蜂蜜中检测出某种违禁污染物的话，对蜂蜜出口企业来说其后果也将是非常严重的甚至是灾难性的。因此，在蜂产品收购和半成品生产过程中，开发一种能快速检测各种污染物的低成本检测方法对于蜂产品加工企业提高产品质量、降低生产成本、 增加企业利润具有非常重要的意义。蜂蜜中的抗生素主要是蜂农为了治疗蜂病而人为引入的。目前我国常见的抗生素有氯霉素类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、青霉素类、硝基咪唑类等。其中每一类抗生素又根据某些结构的变化而又有多种品种。因此，要对蜂蜜中的各种抗生素分别进行检测在技术上是非常困难的，在经济上成本也是非常昂贵的。另一方面，尽管其种类繁多，但根据其在不同溶剂中的溶解性质，还是可以粗略地分为几大类，例如根据抗生素的溶解性可以分为脂溶性污染物和水溶性抗生素两大类，而在水溶性抗生素中，又可根据其电荷可分为阴离子性污染物和阳离子性抗生素等。在通常的提取过程中， 由于脂溶性溶剂与水不混溶，因而萃取液分为两相，很容易分离。但脂溶性溶剂不能提取水溶性抗生素，不过大部分水溶性抗生素可以通过调节PH值将其转化为水溶性较弱的状态后再用脂溶性溶剂进行提取。一般来说，含有弱酸性阴离子解离基团的物质在酸性条件下会与氢离子结合而降低其离解度，从而降低其水溶性而增加脂溶性；相反，含有弱碱性阳离子解离基团的物质在碱性条件下也会降低其水溶性而增加脂溶性。或者说PH低有利于酸性物质在有机相中的分配，相反，PH高有利于碱性物质在有机相中的分配。经过初步实验， 我们发现大部分抗生素都可以通过脂溶性有机溶剂或在调节PH之后通过脂溶性有机溶剂萃取。例如青霉素钠是水溶性很高的抗生素，但其分子中含有羧基，当PH低于3时，青霉素钠分子中的羧基与氢离子结合，可大大降低其水溶性，从而可以用乙酸乙酯将其大部分提取出来。仅有少量品种如氨基糖苷类污染物因水溶性太大而无法采用脂溶性有机溶剂进行提取。对于这类污染物，可通过国标方法单独检测。在对蜂蜜中抗生素进行萃取时，对萃取剂需考虑以下条件①与目标物极性相近； ②与水不混溶；③毒性小；④沸点在45 80°C以便浓缩。综合以上条件，本项目初步选择乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷等为萃取剂，加NaCl盐析，超声或微波辅助萃取。抗生素的传统高效液相色谱检测技术都是通过分离提取某种抗生素，然后将其高效液相色谱图谱与该抗生素的标准图谱进行对照而进行各种定性或定量测定。而本项目所使用的原理刚好相反，首先是建立各种来源的无污染蜂蜜样品(或称为空白蜂蜜样品)的标准图谱库，然后用分类提取的方法对待测样品进行分类提取，提取液的高效液相色谱图再与空白蜂蜜的标准图谱库进行比对，若在提取液中发现了比空白样品中更多的峰，则该样品就有可能是含有抗生素污染物的样品，在此基础上，再根据峰的位置和大小确定其可能的抗生素污染物种类。此外，由于蜂蜜本身含有大量的有机化合物，例如维生素、黄酮、 有机酸等，这些物质对人体具有较好的营养价值，是蜂蜜本身所具有的特征性物质，这些物质在一定条件下也有可能会被提取溶剂所抽提，而在高效液相色谱图上以峰的形式表现出来。因此，为避免这些物质的干扰，还需要根据蜂蜜的特性提前制订不含污染物的各品种空白蜂蜜的标准图谱。在实际的检测过程中，就可以通过与相应品种空白蜂蜜标准图谱的比较，确定是否有多余的可疑污染物峰，再与各种标准抗生素的标准图谱对照，从而确定可疑抗生素污染物的种类。然后，再采用国家标准测定方法确定具体抗生素污染物的品种和数量。应该指出的是，由于目前绝大多数蜂农在蜜蜂的生产过程中都能坚持科学用药， 并对少数用药后生产的蜂蜜进行单独处理，因此，目前含有抗生素的蜂蜜在所收购的蜂蜜中只占极少数，从数量上看，这少量的含抗生素污染物的蜂蜜所占比重微乎其微，但若一旦混入大量的正品蜂蜜中，将会严重影响正品蜂蜜的质量，其后果将是非常严重的。因此，本项目的目的就是要在数量众多的正品蜂蜜中及时鉴别出含有抗生素污染物的劣质蜂蜜，以便对这些蜂蜜单独进行处理。在实际的检测过程中，只需提前建立各品种空白蜂蜜的标准图谱库，在收购的蜂蜜中若发现在相应空白蜂蜜色谱峰中增加了某个可疑色谱峰，即可怀疑这种蜂蜜含有某种抗生素污染物，应单独存放再根据可疑色谱峰的位置用国标法进行检测确证即可。因此，本项目所建立的蜂蜜中抗生素的快速检测方法主要包括三个方面的内容 ①是提前制订各种空白蜂蜜的标准图谱，建立各种空白蜂蜜的标准图谱库；②是提前制订各种抗生素的标准图谱，建立各种抗生素的标准图谱库；③是项目的核心技术“蜂蜜中抗生素的分类提取技术”，主要就是根据抗生素的这些性质分别进行提取，可将常见的100多种抗生素归类为少数几种类型，仅采用几类提取方法对蜂蜜进行提取，再与标准图谱库进行对照先与①中空白蜂蜜的标准图谱库进行对照，若没有多余的峰则为合格，可混入大量蜂蜜中进行收混合加工；若有多余的峰则为可疑样品，需要与②中的各种污染物的标准图谱库进行对照，或通过常规的国标法进行确认。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，快速而低成本的将少部分含有抗生素的蜂蜜样品鉴别出来，从而大大减少提取工作量， 缩短抗生素的提取时间，提高检测效率，降低检测成本，为出口蜂蜜的安全生产提供技术支撑。本发明的技术方案基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，步骤如下
①蜂蜜中抗生素残留的分类提取
将蜂蜜样品分别在中性PH7. 0、酸性pH2. 5、及碱性pH9. 0条件下用有机溶剂乙酸乙酯或二氯甲烷进行提取，将蜂蜜样品中的大部分抗生素残留提取到溶剂中，得到含有抗生素残留的分类提取液，留待后续分析检测；
②抗生素残留的快速初筛检测
将步骤①所得含有抗生素残留的分类提取液采用高效液相色谱分离检测技术、高效液相色谱一质谱联用技术、便携式气相色谱仪或气相色谱-质谱联用技术进行检测，获得各种不同的检测图谱；
③各种空白蜂蜜的标准图谱库的建立
按照步骤①和步骤②所述的分类提取技术和抗生素残留的快速初筛检测技术对各种不含污染物的空白蜂蜜进行提取和检测，得到各种空白蜂蜜的标准图谱库；
④各种抗生素残留的标准图谱库的建立按照步骤①和步骤②所述的分类提取技术和抗生素残留的快速初筛检测技术对精确添加某种抗生素后的空白蜂蜜进行抗生素残留的提取和检测，得到含有某种抗生素的蜂蜜的标准图谱库；对逐一进行添加各种抗生素后的空白蜂蜜进行抗生素残留的提取和检测， 得到含有各种抗生素残留的标准图谱；
⑤然后将步骤②获得的各种不同的检测图谱与步骤④抗生素残留的标准图谱、步骤③ 空白蜂蜜的标准图谱进行对照，即获得相应抗生素残留的种类和含量方面的信息。⑥从被测蜂蜜的检测图谱中发现了比空白蜂蜜中有更多的峰，即根据出峰位置初步判断含有某种抗生素残留，然后再结合该种抗生素残留的国标检测方法进行确证。所述抗生素为氯霉素类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、 青霉素类和/或硝基咪唑类。上述抗生素具体为23种抗生素1、甲硝唑；2、磺胺嘧啶；3、磺胺吡啶；4、土霉素； 5、依诺沙星；6、磺胺甲嘧啶；7、氧氟沙星；8、诺氟沙星、氟罗沙星；9、四环素；10、培氟沙星； 11、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶；12、洛美沙星；13、恩诺沙星；14、奥硝唑；15、加替沙星；16、司帕沙星；17、盐酸金霉素；18、多西环素；19、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲噁唑；20、氯霉素。综上所述，本发明在提前建立相应的图谱库时工作量较大，但一旦成功地建立了图谱库，在后续的分析和检测过程中将会非常的方便和快速，并能低成本而快速的从大量正常蜂蜜中鉴别出含有污染物的蜂蜜。本发明涉及到分析化学、仪器分析、食品化学、食品工艺学等多个技术领域，需相互交叉渗透，反复研究创新才能解决。本发明的有益效果由于大多数的蜂蜜都是合格的蜂蜜，在提前建立了标准图谱库的情况下，采用本发明的方法可以快速而低成本的将少部分含有污染物的样品鉴别出来，从而大大减少提取工作量，缩短污染物的提取时间，提高检测效率，降低检测成本。综上所述，将本发明研制的分类快速高通量检测方法与国家标准检测方法相结合，可以低成本而快速地检测出蜂蜜中的多种污染物，为企业及时鉴别出可能有污染的蜂蜜提供了技术保障。本发明为出口蜂蜜企业建立快速、高通量、低成本的蜂蜜中污染物检测监控技术体系，改变目前蜂蜜中污染物检测效率低、检测目标单一、价格昂贵、检测时间长等缺陷，提升企业的污染物检测技术水平和监控效率，为出口蜂蜜的安全生产提供技术支撑。
图1蜂蜜的生产工艺流程图。图2蜂蜜中污染物的高通量快速初筛技术工艺流程图。图3某蜂蜜的空白蜂蜜的标准色谱图。图4 23种抗生素标准品混合物残留色谱图。
具体实施例方式实施例1某空白蜂蜜的标准图谱 ①蜂蜜中抗生素残留的分类提取
将某蜂蜜的空白蜂蜜样品分别在PH7. 0、pH2. 5、及pH9. 0条件下用有机溶剂乙酸乙酯或二氯甲烷进行提取，将空白蜂蜜样品中的大部分抗生素残留提取到溶剂中，得到含有抗生素残留的分类提取液，留待后续分析检测； ②抗生素残留的快速初筛检测
将步骤①所得含有抗生素残留的分类提取液采用高效液相色谱分离检测技术、高效液相色谱一质谱联用技术、便携式气相色谱仪或气相色谱-质谱联用技术进行检测，获得该蜂蜜的空白蜂蜜的标准图谱，如图3所示。实施例2抗生素残留的标准图谱库
按照与实施例1相同的分类提取技术和抗生素残留的快速检测技术对在实施例1所用某蜂蜜的空白蜂蜜样品中精确添加某种抗生素后的蜂蜜样品进行抗生素残留的提取和检测，得到含有某种抗生素的蜂蜜的标准图谱库。对23种抗生素逐一进行添加后的空白蜂蜜进行抗生素残留的提取和检测，得到含有各种抗生素残留的标准图谱；23种抗生素标准品混合物残留色谱图，如图4所示。23种抗生素的标准曲线数据如表1所示。所述23种抗生素为1、甲硝唑；2、磺胺嘧啶；3、磺胺吡啶；4、土霉素；5、依诺沙星；6、磺胺甲嘧啶；7、氧氟沙星；8、诺氟沙星、氟罗沙星；9、四环素；10、培氟沙星；11、环丙沙星、磺胺二甲嘧啶；12、洛美沙星；13、恩诺沙星；14、奥硝唑；15、加替沙星；16、司帕沙星； 17、盐酸金霉素；18、多西环素；19、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲噁唑；20、氯霉素。色谱条件(空白蜂蜜样品与分别添加23种抗生素的蜂蜜样品所采用的色谱条件均相同。)
色谱柱月旭 Ultimate AQ-C18 (250mmX4. 6mm) 流动相乙腈-水(pH 2.51) 流速lmL/min
检测器紫外检测器(双波长模式) 检测波长分别为274nm、315nm 柱温30°C
流动相梯度如表2所示表1 23种抗生素标准曲线及线性范围
抗生素种类线性方程线性范围(yg/ml)相关系数甲硝唑y=45.744x+0. 71960. 2 - 20.9998奥硝唑y=20.411x+0. 45840. 2 - 20.9994氯霉素y=16.792x - 0. 00250. 2 - 20.9983土霉素y=12.810x - 0. 87040. 2 - 20. 9986四环素y=17. 934x - 0. 26540. 2 - 20.9995多西环素y=12. 049x+0. 99970. 2 - 20. 9992盐酸金霉素y=10. 643x+l. 52450. 2 - 20. 9982司帕沙星y=29. 902x+2. 92490. 2 - 20.9987加替沙星y=20. 316x+l. 45560. 2 - 20.9995氧氟沙星y=12.804x+0. 53530. 2 - 20. 9996洛美沙星y=41.463x - 3. 40120. 2 - 20.9981环丙沙星y=20.900x - 0. 22050. 2 - 21.0000依诺沙星y=50.847x - 6. 92930. 2 - 20. 9999诺氟沙星y=55.755x - 11. 8320. 2 - 20.9979培氟沙星y=36. 711x - 0. 11900. 2 - 20.9982恩诺沙星y=28. 146x - 0. 57700. 2 - 20. 9999氟罗沙星y=22. 735x - 0. 43280. 2 - 20. 9998
权利要求
1.基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，其特征在于步骤如下①蜂蜜中抗生素残留的分类提取将蜂蜜样品分别在中性PH7. 0、酸性pH2. 5、及碱性pH9. 0条件下用有机溶剂乙酸乙酯或二氯甲烷进行提取，将蜂蜜样品中的大部分抗生素残留提取到溶剂中，得到含有抗生素残留的分类提取液，留待后续分析检测；②抗生素残留的快速初筛检测将步骤①所得含有抗生素残留的分类提取液采用高效液相色谱分离检测技术、高效液相色谱一质谱联用技术、便携式气相色谱仪或气相色谱-质谱联用技术进行检测，获得各种不同的检测图谱；③各种空白蜂蜜的标准图谱库的建立按照步骤①和步骤②所述的分类提取技术和抗生素残留的快速初筛检测技术对各种不含污染物的空白蜂蜜进行提取和检测，得到各种空白蜂蜜的标准图谱库；④各种抗生素残留的标准图谱库的建立按照步骤①和步骤②所述的分类提取技术和抗生素残留的快速初筛检测技术对精确添加某种抗生素后的空白蜂蜜进行抗生素残留的提取和检测，得到含有某种抗生素的蜂蜜的标准图谱库；对逐一进行添加各种抗生素后的空白蜂蜜进行抗生素残留的提取和检测， 得到含有各种抗生素残留的标准图谱库；⑤然后将步骤②获得的各种不同的检测图谱与步骤④抗生素残留的标准图谱、步骤③ 空白蜂蜜的标准图谱进行对照，即获得相应抗生素残留的种类和含量方面的信息；⑥从被测蜂蜜的检测图谱中发现了比空白蜂蜜中有更多的峰，即根据出峰位置初步判断含有某种抗生素残留，然后再结合该种抗生素残留的国标检测方法进行确证；所述抗生素为氯霉素类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、青霉素类和/或硝基咪唑类。
全文摘要
基于快速分类提取技术检测蜂蜜中抗生素残留的方法，属于蜂蜜质量检测技术领域。本发明主要通过先建立空白蜂蜜的标准图谱库以及精确添加某种抗生素后的抗生素残留的标准图谱库为前提，再将待检测的蜂蜜样品的检测图与抗生素残留的标准图谱库进行比较，判断待检测蜂蜜样品中抗生素含量是否超标。本发明所述方法可以快速而低成本的将少部分含有污染物的样品鉴别出来，大大减少提取工作量，缩短污染物的提取时间，提高检测效率，降低检测成本；为出口蜂蜜企业建立快速、高通量、低成本的蜂蜜中污染物检测监控技术体系，改变目前蜂蜜中污染物检测效率低、检测目标单一、价格昂贵、检测时间长等缺陷，为出口蜂蜜的安全生产提供技术支撑。
文档编号G01N30/02GK102183596SQ20111004912
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者卢坤, 童群义, 陈大伟, 陈金林 申请人:江南大学, 江苏省庆缘康生物科技有限公司