专利名称：一种用于妊娠高血压疾病诊断的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种用于妊娠高血压疾病诊断的试剂盒。
背景技术：
妊娠高血压疾病是最常见的妊娠合并的综合征之一，其影响了 7-10%的妊娠者， 主要包括妊娠期高血压和子痫前期；子痫前期也称先兆子痫，是妊娠高血压和大量蛋白尿的最主要病因，其临床特征是妊娠20周后出现高血压、水肿、大量蛋白尿和肾功能不全，并随孕月增加而逐渐加重，分娩后病情常迅速好转，大多在产后6周内恢复正常，最迟不超过 3个月。2001年Williams将蛋白尿作为子痫前期诊断的必要条件之一，说明肾损害的普遍性。蛋白尿是评价子痫前期肾病较客观的指标，反映肾脏功能受损程度并与病情严重性成正相关。子痫前期已成为母体和胎儿发病及死亡的主要原因，然而，由于其发病机制尚不明确，且缺乏可靠的诊断和治疗方法而使其处理受阻。有报道指出，子痫前期患者蛋白尿的发生不仅源于肾小球内皮细胞损伤，且与足细胞损伤密切相关；研究表明，子痫前期患者分娩低体重儿或早产的风险、预后需进行肾活检的风险以及随后发生终末期肾病的风险均增加，因此，有关子痫前期肾病蛋白尿的发病机制的研究以及寻找新的诊断和治疗方法等课题引起有关研究者关注。肾活检是当前被人们广泛接受和认可的诊断肾小球疾病的“金标准”，但该方法存在发生严重并发症的潜在风险，且对妊娠妇女这一特殊人群更不适宜接受此类创伤性检查，因此，临床急需一种非侵入性的检查手段用于子痫前期肾病的诊断。尿液蛋白质组学作为一种高通量方法在肾脏研究中已被较多的用于识别诊断和预后的生物标志物的候选蛋白，而且作为一种非侵入性检查和易被患者接受的工具尤其适用于孕妇。近年来，有研究利用尿液蛋白质组学研究肾脏疾病发生机制、治疗靶点和寻找新的生物标志物。尿液蛋白质组包括全身血液来源和肾脏来源的蛋白质，可反映系统和肾脏特异性的功能异常，由于生物学体液中存在大量的小肽，所以尿液是理想的生物标志物的来源之一，且因尿液容易获取，故与血浆蛋白质组比较则相对简单。目前，经典的二维电泳O-DE)已被广泛用于尿液蛋白质组学的研究，但其缺点也逐渐被认识到，如低灵敏度、费时，而且常会漏掉一些低丰度蛋白质。近年有研究采用一种用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)方法避免现有技术的缺点，用于同时定量多种蛋白质并提供精确的鉴定和定量，并与二维液相色谱与串联质谱OD LC-MS/MS)技术联用，作为高通量蛋白质鉴定和相对定量的标准方法之一。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种非侵入性的识别妊娠高血压疾病相关尿液蛋白质标志物的检查工具，具体涉及一种用于妊娠高血压疾病诊断的试剂
品.ο本发明采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记和二维液相色谱与串联质谱QD LC-MS/MS)联用技术，比较妊娠高血压疾病和正常妊娠者尿液蛋白质组，识别和验证与子痫前期蛋白尿发生机制密切相关的蛋白质，依此基础，提供妊娠高血压疾病诊断的试剂盒。具体而言，本发明的用于妊娠高血压疾病诊断的试剂盒，其特征在于，其包括至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述的捕捉试剂能够特异识别子痫前期的角蛋白(Keratin)、α -辅肌动蛋白-4 (Alpha-actinin-4)、Afamin, α -2-巨球蛋白 (Alpha-2-macroglobulin)、血清白蛋白(ALB)、α 1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)、波形蛋白 (Vimentin)、微管蛋白(Tubulin beta_2C chain)；本发明中，所述蛋白的121/119比值和121/118比值均上调；本发明的试剂盒，还包括能够特异识别血管紧张素原(AGT)蛋白的捕捉试剂；本发明中，所述子痫前期和妊娠期高血压的血管紧张素原(AGT)蛋白表达下调。本发明的试剂盒，用于检测妊娠高血压疾病患者的尿液。本发明中，所述的捕捉制剂优选单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体或抗体片段等特异抗体，所述特异抗体能针对角蛋白(Keratin)、α -辅肌动蛋白_4(Alpha-actinin-4)、 Afamin, α-2-巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin)、血清白蛋白(ALB)、α -抗胰蛋白酶 (SERPINA1)、波形蛋白(Vimentin)和 / 或微管蛋白(Tubulin beta_2C chain)，也能针对角蛋白(Keratin)、α -辅肌动蛋白 _4 (Alpha-actinin-4)、Afamin, α -2-巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin)、血清白蛋白(ALB)、α 1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)、波形蛋白 (Vimentin)、微管蛋白(Tubulin beta_2C chain)和血管紧张素原(AGT)。所述的抗体可通过商业途径获得，还可通过常规抗体制备的方法来完成，如通过重组方法制备的抗体，如噬菌体展示抗体，从转基因动物(如小鼠)中分离的抗体，用转入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体。此外，也可通过表达和纯化上述人源的标志物蛋白，用其免疫动物以获得免疫血清，再用常规的方法纯化血清中的抗体而获得。所述的捕捉试剂还是能够和所述角蛋白(Keratin)、α -辅肌动蛋白-4 (Alpha-actinin-4)、Afamin> α -2- gi^SS (Alpha-2-macroglobulin) > ^iyf S ^ 白(ALB)、α -抗胰蛋白酶(SERPINA1)、波形蛋白(Vimentin)、微管蛋白(Tubulin beta-2C chain)和/或血管紧张素原(AGT)蛋白特异识别的其它化学试剂，这些化学试剂能通过生化反应特异识别上述标志物蛋白，而不限于抗原抗体识别方式。所述的测试剂包括可检测的标记成份，所述标记成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射活性物质中的一种；通过上述可检测的标记物成份能定性或定量测定样品中的标志物蛋白。如上所述，酶可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖酶或乙酰胆碱醋酶；辅基的例子包括链霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白；荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸醋、若丹明、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括发光氨，生物发光物质的例子包括但不限于荧光素酶，荧光素和水母发光蛋白；放射活性物质包括125I、35S、14C、3H或Mg52。本发明的测试样品为妊娠高血压疾病患者的尿液；所述检测试剂盒还含有必要的检测所需的稀释试剂或缓冲试剂。
本发明中，所述的检测试剂与捕捉试剂分装或与捕捉试剂偶联。制备本发明检测试剂盒，可通过市场商业途径获得试剂盒中的捕捉试剂、检测试剂盒必要的稀释缓冲液，其中，本发明的实施例中的捕捉试剂采用的是商业来源的特异抗体，也可按常规抗体制备的方法制得；所述的试剂盒的各组分只需常规使用，无需特别操作，可按照各组成试剂使用说明来进行或按照常规实验方法操作，本领域技术人员能够结合样品的特点正确使用检测试剂盒。本发明所述的标志物蛋白的识别检测载体不限于试剂盒的方式，其它检测载体如蛋白芯片、检测试纸等也能被用来检测所述蛋白标志物。本发明提供了妊娠高血压疾病相关尿液蛋白质标志物的用途。本发明所述标志物蛋白具有制备用于妊娠高血压诊断的特异抗体的用途，利用其特异抗体可制备用于诊断妊娠高血压的试剂盒、蛋白芯片或检测试纸等检测产品。使用时，本试剂盒应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记和二维液相色谱与串联质谱OD LC-MS/MS)联用技术定量和鉴定蛋白质，Protein Pilot 3. 0软件分析质谱图，IPI international Protein hdex)数据库中搜索肽段信息，Gene Ontology (GO)和 Metacore软件进行相关生物信息学分析；采用ELISA方法验证差异表达的蛋白质。使用结果表明，在2次2D LC-MS/MS实验中分别鉴定到507和516个蛋白，其中362 个蛋白在2次实验中均被鉴定到，5个蛋白无iTRAQ标记的比值信息；子痫前期组与正常妊娠组比较，有113个蛋白在2次实验中均有明显差异(ratio < 0. 833或ratio > 1. 2),31 个蛋白在三组间比较均有显著差异；所述的差异蛋白质与血液凝固、细胞粘附和分化、免疫反应和细胞骨架重塑的生物过程有关，其在蛋白质的网络中有相互作用。在所述的差异蛋白质中，子痫前期患者尿液的血管紧张素原(angiotensinogen AGT)表达下调，该结果与 ELISA的验证结果一致。本发明发现了多种差异表达的蛋白质，所述的蛋白质信息能为探索子痫前期肾病蛋白尿的发生机制提供依据，为寻找子痫前期肾病早期诊断及预测的生物标志物提供线索；本发明还发现检测血管紧张素原(AGT)有助于子痫前期肾病的诊断。本发明的试剂盒是利用生物化学实验来分析妊娠高血压疾病患者的尿液中的特异蛋白标志物，达到诊断妊娠高血压的目的，可用于诊断子痫前期肾病；本发明的检测方法独特，特异性高，具有极大的市场前景。
图1是本发明的流程图。图2是本发明中主成分分析图。图3是本发明中聚类分析图。
具体实施例方式实施例1一、实验方法如图1所示，实验方法如下1、病例筛选
从2009年3月至2010年3月，于复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科共入选71位妊娠妇女，包括为蛋白质组学研究筛选差异蛋白质的30位妇女(筛选集合)和为验证所筛选蛋白质的41位妇女(验证集合)，进行横断面研究。在验证集合中(n = 30)， 分别有子痫前期患者(n = 10)、妊娠期高血压患者(n = 10)和正常妊娠者(n = 10)每组各10例研究对象。入选标准根据国际认可的诊断标准，子痫前期组定义为妊娠20周后出现收缩压(SBP)彡HOmmHg和/或舒张压(DBP)彡90mmHg，并且随机尿的圆盘电泳分析尿蛋白定性> 1+或定量> 300mg/Mh，除外尿路感染。妊娠期高血压定义为妊娠20周后出现 SBP彡HOmmHg和/或DBP彡90mmHg但没有明显的蛋白尿(即随机尿的圆盘电泳分析尿蛋白定性< 1+或定量< 300mg/Mh)。排除有糖尿病、甲状腺、肝脏疾病、慢性肾脏病或既往有慢性高血压病史的患者。MDRD GFR公式计算估计的肾小球滤过率(eGFR)。本研究已被伦理审核机构批准，所有研究对象签署知情同意书。2、尿标本的收集和处理用无菌容器收集清晨第一次中断尿标本(50ml)，其中50ml立即离心G°C， 3000g)45min，弃沉淀，留取上清，分别以IOml分装于无菌离心管，并加入蛋白酶抑制剂 (Complete mini, Roche, Mannheim, Germany)以防止蛋白酶水解，然后储存于_80°C用于蛋白质组学筛选研究；余2ml尿标本以4°C，2000g离心lOmin，弃沉淀，留取上清液分别以 500 μ 1分装于无菌Ep管中，_80°C储存用于验证实验。用于本实验的所有标本仅溶解一次并于完全溶解后充分摇勻。所有尿标本均于未使用任何药物治疗前收集。在筛选集合中， 每组10例患者的尿上清(每例患者各取IOml)的混合用于蛋白质组学筛选。冷丙酮/三氯乙酸法提取尿蛋白将尿标本10倍体积的冷丙酮(含10%三氯乙酸，TCA)与尿标本混合，_20°C沉淀过夜后，4°C，12000g超速离心15min，留取沉淀，再次加入冷丙酮，-20°C，30min后离心，以去除残余三氯乙酸，留取沉淀即为尿蛋白。Bradford法测蛋白浓度。3、尿蛋白处理和标记采用ftOteoMiner 蛋白富集试剂盒(Bio-Rad)基于磁珠技术(bead based)亲和去除高丰度蛋白质，所有操作步骤参照说明书，洗脱下来的样品通过Bradford法进行定量。iTRAQ 标记按照试剂盒(Applied Biosystem Inc.，Foster city, CA)操作步骤进行， 即取各组尿液蛋白质样品各lOOyg，每管分别加入预冷的丙酮(丙酮样品体积比= 5:1)，_20°C沉淀1小时，4°C，12000rpm超速离心15min后将沉淀重悬于20 μ 1溶解缓冲液中。尿蛋白经还原、半胱氨酸封闭及胰酶(Sigma Co. USA)过夜消化酶解后，将iTRAQ标记试剂118，119和121分别用于标记正常妊娠组、妊娠期高血压组和子痫前期组的尿蛋白样品，然后用S印-Pak Vac C18柱(Waters，Milford，MA)除盐，并真空干燥样品。4、二维液相色谱串联质谱QD LC-MS/MS)分析4. 1第一维强阳离子柱(SCX)分离通过强阳离子交换(SCX)色谱仪(岛津，日本)在20AD高效液相色谱(RPLC)系统上使用 Polysulfoethyl 柱子(2. 1 X 100mm, 5 μ m, 200 A5The Nest Group, Southborough， ΜΑ)。将iTRAQ标记后的混合肽裂解。肽段混合物在缓冲液A相[IOmM KH2PO4 (国药
6集团)，25%ACN(乙腈，Fisher scientific, Fair lawn, New Jersey), PH 2.6]中重建并上样至SCX交换柱，然后以200 μ 1/min的流速流经0-80%梯度(60min)的缓冲液B相 [IOmM KH2PO4 (国药集团)，350mM KCl，25% ACN(乙腈，Fisher scientific, Fair lawn, New Jersey)，PH 2. 6]，从而使肽段分离。检测紫外光波长为214nm和^Onm处的吸光度值，根据峰型和时间共收取20个梯度，真空离心浓缩。4. 2维反相液质联用RPLC-MS将上述浓缩样品用50uL RPLC A 相[5% ACN,0. 1 % 甲酸(TEDIA，Fairfield, USA)]溶解，进行第二维分析；将分离的肽段样品装入ZORBAX 300SB-C18反相柱(5 μ m， 300 A, 0. IX 150mm ；Microm, Auburn, CA) ^t 20AD HPLC (Shimadzu ；Kyoto, Japan) Wi 用QSTAR XL系统的质谱仪(Applied Biosystem, USA)上分析，然后以0. 3 μ 1/min的流速流经5% -；35%梯度(90min)HPLC缓冲液B相(95% ACN，0· 甲酸)；质谱(MS)扫描范围是m/z 400-1800，一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描，MS/MS扫描范围是m/z 100-2000。上述实验重复两次，分别用RUN 1和RUN 2表示。5、数据分析和生物信息学应用 Protein Pilot 3· 0 软件(version 3.0, revision 114732，Applied Biosystem, USA) ^Ι/γΜ β 15 IPI (International Protein Index) WMW- (version 3. 45, HUMAN)中搜索肽段信息，进行肽段鉴定和定量。用Paragon算法和ftx) Group算法(Applied Biosystem,USA)确定最终的蛋白质。鉴定的蛋白质以Unused ProtScore > 1. 3作为阈值其至少超过一个肽的可信度在95%以上。iTRAQ倍数变化的截断值<0.83或> 1. 20的蛋白质定义为差异表达的蛋白质。6、ELISA法验证差异表达蛋白质蛋白质组学实验中所筛选到的差异表达的蛋白质-尿AGT(血管紧张素原)在验证集合(n = 41，14例子痫前期患者，14例妊娠期高血压患者和13例正常妊娠者)研究对象的尿液中用ELISA法进行验证，所有操作按照商业化的AGT ELISA试剂盒(IBL，Japan) 说明书进行。每个标本做1个复孔。试剂盒可检测到的AGT最小浓度是0.31ng/ml。批间和批内变异度分别是4. 3 7. 0%和4. 4 5. 5%。标准曲线的相关系数> 0. 99。7、统计分析数据用SPSS 13. 0软件处理，以均数士标准差表示。ANOVA用于正态分布数据的组间比较，Marm-Whitney U检验用于非正态数据两组间的比较。P < 0. 05具有统计学意义。二、实验结果1、蛋白质组学筛选实验研究对象(筛选集合)的人口学资料子痫前期患者(n = 10)、妊娠期高血压患者(n = 10)与正常妊娠者(n = 10)各组间年龄、身高、体重和体重指数(BMI)无显著差异，但与正常妊娠组比较，子痫前期组和妊娠期高血压组患者血压显著升高；与另外两组比较，子痫前期组患者的新生儿体重显著降低、母体血尿素氮、肌酐、尿酸显著升高，eGFR显著降低(虽然肾功能仍在正常范围内)。 子痫前期组M小时尿蛋白定量显著高于妊娠高血压组合正常妊娠组。2、尿液蛋白质组学的全局描述
本发明在两次实验中(RUN 1和RUN 2)分别鉴定到507和516个蛋白，在两次实验中均共同鉴定到的蛋白有362个。由于子痫前期组的临床特征及肾脏相关检查与其他两组比较有显著差异；而妊娠期高血压组与正常妊娠组比较除血压显著升高及轻度蛋白尿外余无显著差异，因此在两次实验中121/118(子痫前期组/正常妊娠组)的iTRAQ比值均有差异(iTRAQ比值<0.83或>1.20)的蛋白质定义为差异表达蛋白。根据这一标准，在362 个共同鉴定的蛋白质中，有113个差异表达(上调或下调)的蛋白质，其中31/113个蛋白质在三组间比较均有显著差异。3、主成分分析和聚类分析如图2所示，通过主成分分析发现，在三维坐标中，妊娠期高血压组的样本与正常妊娠组较为接近，而子痫前期组的样本距离其他两组较远，此结果与这类疾病的临床表现
等相一致。如图3所示，聚类分析发现，子痫前期组和妊娠期高血压组与正常妊娠组比较的差异蛋白有角蛋白(Keratin)、α -辅肌动蛋白_4(Alpha-actinin-4) ,Afamin, α _2_巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin)、血清白蛋白(ALB)、α -抗胰蛋白酶(SERPINA1)、波形蛋白(Vimentin)、β _2C微管蛋白(Tubulin beta_2C chain)等；这些蛋白的 121/119 比值和 121/118比值均为上调。此外，还鉴定到，与正常妊娠组比较，AGT蛋白在子痫前期组和妊娠期高血压组表达下调。4、差异表达蛋白间的相互作用子痫前期是一种涉及多系统紊乱的复杂综合征。本发明研究了部分差异蛋白质之间的相互作用发现，血管紧张素原(AGT)、α 1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)和血清白蛋白(ALB) 位于网络中心，且血管紧张素原(AGT)与α 1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)之间能够通过部分差异蛋白而发生相互作用。5、ELISA法验证差异蛋白质-AGT尿液蛋白质组学的筛选实验发现，与正常妊娠组比较，子痫前期组和妊娠期高血压组尿液的AGT前体蛋白表达下调。在验证实验中，选取另一部分研究对象(验证集合，η = 41)的尿标本通过ELISA法进行验证，结果发现子痫前期组患者的尿AGT浓度Gl.01±64.29ng/ml)显著低于正常妊娠组的尿AGT浓度(116. 21 士65. 59ng/ml，P < 0. 001)，且略低于妊娠期高血压组患者的尿AGT浓度(86. 60士62. 75ng/ml, P > 0. 05)。 尿 AGT 浓度与血压(SBP :r = -0. 345，P = 0. 027 ；DBP :r = 0. 314，P = 0. 045)和尿液中的足细胞丢失(r = -0. 399，P = 0. 016)密切相关。受试者工作特性(ROC)曲线表明，尿AGT 的曲线下面积(AUC)是0. 791 (95% CI :0. 623-0. 959，P = 0. 002)。敏感性与特异性分析表明，当选取最高约登指数时，尿AGT浓度的截断值是60ng/ml，用于子痫前期患者与正常妊娠者鉴别的敏感性、特异性和准确度分别是78. 57%,76. 92%, 77. 78%。这一结果有力验证了本发明中尿液蛋白质组学实验的结果，即与正常妊娠组比较，子痫前期组和妊娠期高血压组尿液的AGT前体蛋白表达下调，表明尿AGT对于子痫前期的诊断很有价值，尿AGT的表达下调可能参与了子痫前期肾病患者蛋白尿的发生机制。实验结果表明，本发明通过比较子痫前期妇女、妊娠高血压妇女和正常妊娠妇女的尿液蛋白质组，寻找各组尿液中差异表达的蛋白质，从而为发现早期诊断和预防子痫前期肾损伤的标志物奠定基础，也为研究子痫前期肾损伤的发病机制提供线索。
权利要求
1.一种用于妊娠高血压疾病诊断的试剂盒，其特征在于，包括至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述的捕捉试剂能特异识别角蛋白、α-辅肌动蛋白-4、Afamin、α-2-巨球蛋白、 血清白蛋白、α -抗胰蛋白酶、波形蛋白和/或微管蛋白。
2.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有特异识别血管紧张素原蛋白的捕捉试剂。
3.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕捉试剂包括针对角蛋白、α-辅肌动蛋白-4、Afamin、α-2-巨球蛋白、血清白蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、波形蛋白和/或 β-2C微管蛋白的特异抗体。
4.按权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕捉试剂包括针对角蛋白、α-辅肌动蛋白-4、Afamin、α-2-巨球蛋白、血清白蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、波形蛋白、β-2C微管蛋白和/或血管紧张素原蛋白的特异抗体。
5.按权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括可检测的标记成份，所述的标记成份包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质或放射活性物质中的一种。
6.按权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂与捕捉试剂分装或与捕捉试剂偶联。
7.按权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，应用的检测样品为妊娠高血压疾病妊娠患者的尿液。
8.按权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，检测样品中所述蛋白的121/119比值和121/118比值均上调；血管紧张素原蛋白表达下调。
9.权利要求1或2的角蛋白、α-辅肌动蛋白-4、Afamin、α-2-巨球蛋白、血清白蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、波形蛋白、微管蛋白和血管紧张素原蛋白在制备用于妊娠高血压疾病诊断的特异抗体中的用途。
10.按权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的特异抗体的检测载体是试剂盒、蛋白芯片或检测试纸。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种用于妊娠高血压疾病诊断的试剂盒。本发明试剂盒包括针对角蛋白、α-辅肌动蛋白-4、Afamin、α-2-巨球蛋白、血清白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、波形蛋白、β-2C微管蛋白和/或血管紧张素原蛋白的特异抗体。本发明试剂盒能检测妊娠高血压疾病患者尿液样本中多种差异表达的蛋白质，所述的蛋白质信息能为探索子痫前期肾病蛋白尿的发生机制提供依据，为寻找子痫前期肾病早期诊断及预测的生物标志物提供线索；本发明为妊娠高血压疾病标志物提供一种非侵入性的检查工具，可用于诊断子痫前期肾病以及妊娠高血压疾病。
文档编号G01N33/68GK102192987SQ20111004929
公开日2011年9月21日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者张扬, 陈桂香, 顾勇 申请人:复旦大学附属上海市第五人民医院