专利名称：人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸(microRNA, miRNA)标志物及其应用。
背景技术：
我国妊娠期高血压疾病发病率约为9.4%，国外报道为7% 12%，是孕产妇及围生儿死亡的重要原因。妊娠期高血压疾病包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及慢性高血压。子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的涉及多系统的疾病，发病率为1% 5%，以妊娠20周后发生高血压、蛋白尿、水肿等为主要临床特点。子痫前期根据病情轻重分为轻度和重度两类。轻度子痫前期是指妊娠20周后出现血压彡140/90mmHg,尿蛋白(+ )或尿蛋白彡300mg/24h,可伴有上腹部不适、头痛等症状。子痫前期患者出现下述任一不良情况可诊断为重度子痫前期:①血压持续升高:收缩压彡16OmmHg和(或)舒张压彡IlOmmHg ;②蛋白尿彡2.0g/24小时或随机蛋白尿彡(++) !③血清肌酐彡1.2mg/dL除非已知之前就已升高血小板〈100，000/ML (<100X 109/L) ； 微血管病性溶血一LDH升高；⑥血清转氨酶水平升高一ALT或AS ;，⑦持续头痛或其他大脑或视觉障碍；⑧持续上腹部疼痛。病情严重者可以导致子痫，甚至合并全身多脏器损害如肝肾功能损害、脑出血、心力衰竭、弥漫性血管内凝血等，严重威胁母儿的安全。子痫前期的好发因素包括初产妇、孕妇年龄小于18岁或大于40岁、多胎妊娠、合并慢性高血压、慢性肾炎、抗磷脂综合征、糖尿病等内科疾病、营养不良以及子痫前期家族史等。子痫前期发病愈早、母儿受损时间越长、并发症越多、预后也越差。因此围生医学根据本病发病早晚又分为早发型子痫前期和迟发型子痫前期。近来研究发现早发型与迟发型子痫前期在遗传背景、发病与复发风险、病理生理指标改变、临床特点、远期心血管病风险有一定差别。早发型子痫前期主要表现为胎盘功能紊乱与血管内皮功能障碍；而迟发型子痫前期常表现为母体的异常反应。如何确定早发型与迟发型的分界？根据美国和加拿大等国家标准，一般把妊娠34周前发生的子痫前期定为早发型子痫前期；^ 34周发病的子痫前期称为迟发型子痫前期。但近年来又有研究表明妊娠32周前发病的子痫前期引起的孕产妇死亡率是足月后发生子痫前期的20倍，所以国内外有些学者也把妊娠32周作为早发型与迟发型子痫前期的分界。子痫前期发病机制尚未完全阐明，目前大多认为是胎盘相关性疾病，胎盘的娩出后病情缓解或治愈。具有遗传易感性，可能涉及血压调节、血栓形成、血管内皮细胞功能、血管重铸、代谢免疫等等相关的基因。在多基因背景下、生活行为、环境等因素相互作用，可能影响母胎免疫耐受、母胎界面滋养细胞功能障碍、侵袭力下降使胎盘浅着床、或螺旋动脉重铸不足，胎盘缺血缺氧、局部细胞免疫反应增强、胎盘局部出现氧化应激释放氧自由基导致血管内皮激活和损伤，血管内皮合成或分泌血管收缩因子舒张因子平衡失调，导致小动脉痉挛、胎盘及全身脏器血液灌流量下降。此外血管内皮损伤又可使凝血因子增加，抗纤溶活性增强，纤溶活性下降致血液高凝状态或微血栓形成，甚至发生慢性血管内凝血(DIC)，引起多脏器损害。胎盘功能减退、胎盘缺血缺氧可以导致胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫、医源性早产、胎死宫内甚至新生儿死亡。子痫前期治疗以监测母胎状态、对症治疗(如解痉、镇静、降压、促胎儿生长等)、必要时终止妊娠以减少母儿并发症为主要处理措施，至今终止妊娠仍是唯一的治愈方法。子痫前期临床诊断时间为妊娠20周后，但本病在发病前一段时期机体就可能发生一系列病理生理改变，并且对母儿产生不同程度损害，甚至是无法挽回的不良结局。因此我们需要在亚临床或更早、甚至孕前就采取相关的干预措施来避免或减少本病的发生、减慢病程，减轻母儿的不良结局。为此我们迫切需要寻找本病特异标志物与治疗靶点，从而尽早启动预防与干预措施，对减少本病的发生、改善母儿预后具有极其重要的意义。微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30%以上。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，血清miRNA与重度子痫前期等的相互关系尚未见报道。最新的研究成果发现血清中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了 专门报道，《Nature》杂志也在其网站首页的一最新研究进展||专栏中展示了这一最新研究进展。然而血清中miRNA在重度子痫前期早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与重度子痫前期发病相关的特异血清miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国妊娠高血压的防治也将是一次强有力的推动。
发明内容
本发明的目的是提供与人类重度子痫前期发生相关的血清microRNA标志物。本发明的另一个目的是提供上述血清microRNA标志物的引物。本发明还有一个目的是提供上述血清microRNA标志物或其引物的应用。本发明再有一个目的是提供含有上述血清microRNA标志物或其引物的用于人类重度子痫前期诊断或监测的试剂盒。本发明的目的是通过下列技术措施实现的:与人类重度子痫前期相关的血清microRNA标志物，选自hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多种。所述的血清microRNA 标志物由 hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和hsa-miR-10a构成。所述的血清microRNA标志物，其中hsa-miR-193a_5p的序列为ugggucuuugcgggcgagaugaCSEQ ID N0.1), hsa-miR-424 的序列为 cagcagcaauucauguuuugaa(SEQ ID N0.2), hsa-miR-10a 的序列为 uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID N0.3)。所述的血清microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.4，下游引物为SEQ ID N0.5 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQID N0.8，下游引物为 SEQ ID N0.9。所述的血清microRNA标志物或其引物在制备重度子痫前期诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的试剂。一种人类重度子痫前期诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述血清microRNA标志物(hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多种)的引物。所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9)中的多对。所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有下列3对引物SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。本发明详细描述如下:本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了 RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array,Real-time PCRCTaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:一、研究对象选择和分组依据A组:健康对照组(n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验证)，无
其他全身性重大疾病。B组:重度子痫前期组(n=100，20人芯片筛选，40人一期验证，40人独立人群验
证)，无其他全身性重大疾病。二、血液血清分离及前处理(I)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000rpm离心5min，取上清每100 μ I分装至洁净1.5ml EP管中(2)向EP管中加入900 μ I TRIzol，充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。(3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，IOOOOrpm离心15秒,弃下层废液。(4)在离心柱上加入700 μ I RffT缓冲液，IOOOOrpm离心15秒,弃下层废液。(5)在离心柱上加入500 μ I RPE缓冲液，IOOOOrpm离心15秒，弃下层液。重复一遍。
(6)将离心柱加入一个新的2ml的管子，IOOOOrpm离心I分钟，用于去除RPE缓冲液。(7)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50 ii IDEPC处理的水，离心I分钟。(8)_70°C保存处理后的样本。本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自QiagenmiRNeasy Mini Kit (货号217004)这个试剂盒,下同。三、Real-time PCR方法测量血清miRNAs表达量1.取经前处理的血清，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。按下表所示配制反转录体系:
权利要求
1.人类重度子痫前期相关的血衆microRNA标志物，选自hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多种。
2.根据权利要求1所述的血衆microRNA标志物，其特征在于由hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 构成。
3.根据权利要求1或2所述的血衆microRNA标志物，其特征在于hsa-miR-193a-5p的序列为 SEQ ID N0.1，hsa-miR-424 的序列为 SEQ ID N0.2，hsa-miR-lOa 的序列为 SEQ IDN0.30
4.权利要求3所述的血浆microRNA标志物的引物，其特征在于序列为SEQID N0.1的标志物的上游引物为SEQ ID N0.4，下游引物为SEQ ID N0.5 ;序列为SEQ ID N0.2的标志物的上游引物为SEQ ID N0.6，下游引物为SEQ ID N0.7 ;序列为SEQ ID N0.3的标志物的上游引物为SEQ ID N0.8，下游引物为SEQ ID N0.9。
5.权利要求1或2所述的血浆microRNA标志物在制备人类重度子痫前期诊断或监测试剂中的应用。
6.权利要求4所述的引物在制备人类重度子痫前期诊断或监测试剂中的应用。
7.一种人类重度子痫前期诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1或2所述的血浆microRNA标志物的引物。
8.根据权利要求7所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求4所述引物中的多对。
9.根据权利要求8所述的诊断或监测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物SEQIDN0.4 和 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。
全文摘要
本发明属于基因工程及临床医学领域，公开了人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424和hsa-miR-10a中的多种。该标志物对重度子痫前期患者具有特异性和敏感性，可用于制备重度子痫前期的诊断或监测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK103205430SQ20131015781
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者夏彦恺, 吴炜, 吕述彦, 傅广波, 陆春城, 王心如 申请人:夏彦恺