专利名称：一种基于生物矿化原理的超微量蛋白质定量检测方法
技术领域：
本发明涉及基于生物矿化原理的超微量蛋白质定量检测方法。
背景技术：
近年来，贵金属纳米微粒被广泛应用于生物检测分析技术中，为生命科学领域的发展起到了重要的推动作用。以贵金属纳米微粒为核心，发展出一系列新型生物分子分析检测技术，在生物医学相关的各个研究领域，特别是超微量分子识别、肿瘤早期诊断、食品安全快速检测、水质监测等方面发挥重要的作用，对超微量生物分子分析技术的发展产生了深远的影响。其中，纳米金(AuNPS)以其尺度依赖性的物理化学特性被广泛应用于生物光学探针的设计中。纳米金光学探针的设计与应用通常以表面修饰生物识别敏感组件的纳米金为核心，进行生物识别并与检测对象实现共价偶联。分子识别组件与目标分子的特异性结合在纳米金微粒表面产生相应的物理(化学)变化，进而转换放大为可检测的光学或电学信号。因而，纳米金生物光学探针的设计成为痕量生物分子识别检测的有力途径。然而，现有的表面未修饰的纳米金与待测蛋白间依赖静电作用或表面张力作用， 以非共价方式偶联，很容易解离，多存在黏连，团聚现象，而且对周围环境敏感，降低检测的灵敏度与特异性。而且，现有的蛋白质定量技术的对特定目标蛋白的识别能力有限，检测灵敏度较低，稳定性较差，检测周期长，成本高。要解决上述问题，制备成本低廉的检测试剂同时建立相应的简便分析方法就成为市场的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纳米金微粒生物矿化原理的超微量蛋白质定量检测方法。本发明的技术方案是这样实现的(1)、表面氨基化的纳米金种子制备以树状体(PPIHA)和氯金酸(HAuCl4)为原料，使用微波回流加热法制备得到表面氨基化的纳米金种子溶胶。将l_2mL，0. 67%的氯金酸溶液溶解于100_150mL超纯水中，加入85-95 uL, 5% PPIHA的甲苯溶液；充分搅拌混合后，用微波回流加热3-6min，制得表面氨基化的纳米金种子溶胶，4°C密封保存。在本步骤中一方面，PPIHA作为还原剂使氯金酸中的Au3+还原为Au纳米微粒；另一方面，PPIHA在还原Au3+的同时对纳米金表面进行了氨基化修饰，以利于其同蛋白质的共价偶联。由此，制得表面氨基化的纳米金种子溶胶。(2)、纳米金-蛋白偶联物(AuNPs-BSA)制备将180-200 μ L，的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)溶液加入到 3-5mL步骤(1)制得的纳米金种子溶胶中，加入110-130yL 1 %盐酸，摇勻后用超纯水稀释至6ml，制得AuNPs-BSA偶联物。在上述条件下，纳米金表面氨基和BSA的表面羧基等氨基酸残基通过共价偶联相互结合，继而制得AuNPs-BSA偶联物。
(3)、AuNPs-BSA偶联物的生物矿化为实现aunps-bsa偶联物的矿化，取l-2mL AuNPs-BSA偶联物与0. 6-0. 8mL ph为 7. 0磷酸盐缓冲液混合，摇勻，用超纯水稀释至10mL，备用。取一定量(0-180 μ L范围内)的上述AuNPs-BSA偶联物，加入到3. OOmL超纯水中。 然后依次加入l_2mL 0. 02%氯金酸溶液，l-3mL pH 2. 26的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液以及 2-3mL 8. OX 10_3mol/L的盐酸羟胺溶液(NH2OH · HCL)，再用超纯水稀释到8_10mL。随后置于38°C孵育18-2;3min，得到AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物用于检测。在此过程中，纳米金表面偶联的BSA形成特异性的电场吸引溶液中的Au3+离子在纳米金偶联物表面富集，使得纳米金表面氯金酸-盐酸羟胺慢反应体系的反应速度加快，促使氯金酸在盐酸羟胺的作用下还原为金单质并沉积在纳米金偶联物表面。AuNPs-BSA偶联物发生生物矿化反应，Au3+ 在纳米金偶联物表面还原成Au，选择性扩大了纳米金偶联物的粒径，相应增强了复合物共振散射光谱的特征峰值强度。在0-180 μ L范围内，纳米金偶联物生物矿化产物的特征峰值强度BSA浓度之间的保持良好的线性对应关系，因而可利用产物的共振散射光谱特征峰值强度作为检测信号用于BSA的定量检测。(4)、共振散射光谱工作曲线制备在o-isoyl范围内，间隔10yl，按照步骤(3)所述方法制得一系列不同浓度的 aunps-bsa偶联物的生物矿化产物；在200nm至soonm的光谱范围内测定产物的共振散射光谱，取特征峰的强度对bsa浓度做曲线，得到可检测o-isoyl bsa的工作曲线。此曲线可用于超微量蛋白质的定量检测。(5)、测定实际样品方法按照步骤⑵，将180 μ L待测BSA溶液制得AuNPs-BSA偶联物。依照步骤⑷得到其生物矿化产物，检测其共振散射光谱，在工作曲线上读出相应浓度。本发明解决的技术关键在于选择树状体和氯金酸为原料一步制备表面氨基修饰的纳米金溶胶，制得的纳米金粒径均一，分布均勻。同时，使用生物矿化的方法实现纳米金-蛋白质偶联物共振散射信号的选择性大幅增强，提高了检测的选择性和灵敏性，保证了该方法定量分析的特异性和稳定性。本发明不仅限于超微量BSA的定量检测，也可推广用于其它微量蛋白质的定量分析。针对不同的蛋白质，需要调节步骤O)中纳米金-蛋白偶联物制备的相应PH值条件以及偶联物形成所需蛋白质的最低用量，继而制备相应的稳定纳米金偶联物进行后续步骤。本发明的效果体现在(1)本发明提出的表面氨基修饰纳米金溶胶的制备方法，以树状体和氯金酸为原材料，利用微波回流加热法一步制得，设备要求低，制备工艺简捷，成本低，易于实现产业化生产。(2)采用本发明技术所制备的纳米金溶胶体系，纳米金微粒粒径均一(13-16nm)， 分散度高且光学性质稳定。(3)本发明以共价偶联的方式解决了纳米金-蛋白偶联物稳定性差、易团聚的缺点。利用生物矿化方法实现了纳米金-蛋白偶联物共振散射光谱信号的选择性增强，特征峰值信号增强322倍。(4)本发明建立的超微量蛋白质定量分析方法灵敏度高，检出限低至3.00Xl(T9mOl/L，远低于现有的商品化蛋白质定量分析方法。同时，本方法的检测范围为 3. 00X10_9mol/L至2. 40 X 10_8mol/L，优于目前市场上同类检测方法，且检测时间短，检测
稳定性和准确度高。
具体实施例方式实施方式一用树状体(PPIHA)和氯金酸(HAuCl4)为原料，微波回流加热法制备得到表面氨基化的纳米金种子溶胶。将1. 5mL，0. 67%的氯金酸溶液溶解于IOOmL超纯水中，加入90 μ L， 5% PPIHA的甲苯溶液；充分搅拌混合后，用微波回流加热5min。给4mL制得的纳米金种子溶胶中加入180yL，l%的牛血清白蛋白(Bovineserum albumin, BSA)溶液，再加入120yL 1 %盐酸，摇勻后用超纯水稀释至6ml，反应生成 AuNPs-BSA 偶联物。取1. 8mL AuNPs-BSA偶联物与0. 6mL pH为7. 0磷酸盐缓冲液混合，摇勻，用超纯水稀释至10mL，备用。间隔IOyL取一定量(0_180μ 范围内)的上述AuNPs-BSA偶联物，加入到3. OOmL超纯水中。然后依次加入2mL 0. 02%氯金酸溶液，2mL pH 2.沈的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液以及2. 4mL 8.0X10-3mol/L的盐酸羟胺溶液，再用超纯水稀释到10mL，随后置于38°C孵育20min制得一系列不同浓度的AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物；在200nm至 SOOnm的光谱范围内测定产物的共振散射光谱，取特征峰的强度对BSA浓度做曲线，得到可检测0-180yL BSA的工作曲线。本实例中40nmol/L至M0nmol/L范围内M8nm处共振峰值强度同偶联物浓度保持良好线性关系。其线性拟合曲线方程为I548nm = 2. 02E6*Cbsa+1. 23E6, R2 = 0. 9915重复制备过程，即可通过检测共振散射光谱，在工作曲线上读出相应浓度。实施方式二 以树状体(PPIHA)和氯金酸(HAuCl4)为原料，微波回流加热法制备得到表面氨基化的纳米金种子溶胶。将1.2mL 0.67%的氯金酸溶液溶解于IOOmL超纯水中，加入85 μ L， 5% PPIHA的甲苯溶液；充分搅拌混合后，用微波回流加热5min。将180 μ L，的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)溶液加入到 4. 5mL 步骤(1)制得的纳米金种子溶胶中，加入115yL 盐酸，摇勻后用超纯水稀释至6ml，制得AuNPs-BSA偶联物。取1. 5mL AuNPs-BSA偶联物与0. 6mL pH为7. 0磷酸盐缓冲液混合，摇勻，用超纯水稀释至10mL，备用。间隔IOyL取一定量(0_180yL范围内)的上述AuNPs-BSA偶联物， 加入到3. OOmL超纯水中。然后依次加入1. 6mL 0. 02%氯金酸溶液，2mL pH 2. 26的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液以及2. 5mL 8.0X10-3mol/L的盐酸羟胺溶液(NH20H .HCL)，再用超纯水稀释到10mL。随后置于38°C孵育20min，得到AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物；在200nm 至SOOnm的光谱范围内测定产物的共振散射光谱，取特征峰的强度对BSA浓度做曲线，得到可检测0-180yL BSA的工作曲线。本实例中40nmol/L至M0nmol/L范围内548nm处共振峰值强度同偶联物浓度保持良好线性关系。其线性拟合曲线方程为I548nm = 1. 93E6*CBSA+1. 01E6, R2 = 0. 9930重复制备过程，即可通过检测共振散射光谱，在工作曲线上读出相应浓度。
实施方式三用树状体(PPIHA)和氯金酸(HAuCl4)为原料，微波回流加热法制备得到表面氨基化的纳米金种子溶胶。将2mL，0. 67%的氯金酸溶液溶解于135mL超纯水中，加入95 μ L，5% PPIHA的甲苯溶液；充分搅拌混合后，用微波回流加热5min。给5mL制得的纳米金种子溶胶中加入200yL，l%的牛血清白蛋白(Bovineserum albumin, BSA)溶液，再加入130yL 1 %盐酸，摇勻后用超纯水稀释至6ml，反应生成 AuNPs-BSA 偶联物。取aiiL AuNPs-BSA偶联物与0. 8mL pH为7. 0磷酸盐缓冲液混合，摇勻，用超纯水稀释至12mL，备用。间隔15 μ L取一定量(0-180 μ L范围内)的上述AuNPs-BSA偶联物， 加入到3. OOmL超纯水中。然后依次加入2mL 0. 02%氯金酸溶液，2. 8mL pH 2.沈的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液以及3mL 8. OX 10_3mol/L的盐酸羟胺溶液，再用超纯水稀释到10mL，随后置于38°C孵育20min制得一系列不同浓度的AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物；在200nm 至SOOnm的光谱范围内测定产物的共振散射光谱，取特征峰的强度对BSA浓度做曲线，得到可检测0-180yL BSA的工作曲线。本实例中40nmol/L至M0nmol/L范围内548nm处共振峰值强度同偶联物浓度保持良好线性关系。其线性拟合曲线方程为I548nm = 2. 21E6*Cbsa+1. 20E6, R2 = 0. 9902重复制备过程，即可通过检测共振散射光谱，在工作曲线上读出相应浓度。
权利要求
1. 一种基于纳米金微粒生物矿化原理的超微量蛋白质定量检测方法，其特征在于，利用纳米金的共振散射光谱的变化进行检测，包含以下步骤(1)表面氨基化的纳米金种子制备以树状体PPIHA和氯金酸HAuCl4为原料，使用微波回流加热法制备得到表面氨基化的纳米金种子溶胶，将l_2mL，重量百分比为0. 67%的氯金酸溶液溶解于100_150mL超纯水中，加入85-95 μ L，重量百分比为5% PPIHA的甲苯溶液；充分搅拌混合后，用微波回流加热 3-6min，制得表面氨基化的纳米金种子溶胶，4°C密封保存；(2)纳米金-蛋白偶联物AuNPs-BSA制备将180-200 μ L，重量百分比为的牛血清白蛋白Bovine serum albumin，BSA溶液加入到3-5mL步骤(1)制得的纳米金种子溶胶中，加入110-130 μ L重量百分比为1 %盐酸，摇勻后用超纯水稀释至6ml，制得AuNPs-BSA偶联物；(3)AuNPs-BSA偶联物的生物矿化取l-2mL AuNPs-BSA偶联物与0. 6-0. 8mL pH为7. 0磷酸盐缓冲液混合，摇勻，用超纯水稀释至10mL，备用；取0-180 μ L上述AuNPs-BSA偶联物，加入到3. OOmL超纯水中，然后依次加入l_2mL 0. 02%氯金酸溶液，l-3mL pH 2. 26的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液以及2_3mL 8. OX 10_3mOl/ L的盐酸羟胺溶液NH2OH ·Ηα，再用超纯水稀释到8-10mL，随后置于38°C孵育18_2;3min，得到AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物用于检测；(4)共振散射光谱工作曲线制备在O-ISOyL范围内，间隔10yL，按照步骤(3)所述方法制得一系列不同浓度的 AuNPs-BSA偶联物的生物矿化产物；在200nm至SOOnm的光谱范围内测定产物的共振散射光谱，取特征峰的强度对BSA浓度做曲线，得到可检测0-180 μ L BSA的工作曲线，此曲线可用于超微量蛋白质的定量检测；(5)测定实际样品方法按照步骤( ，将180 μ L待测BSA溶液制得AuNPs-BSA偶联物，依照步骤(4)得到其生物矿化产物，检测其共振散射光谱，在工作曲线上读出相应浓度。
全文摘要
本发明公开了一种基于纳米金微粒生物矿化原理的超微量蛋白质定量检测方法，该方法首先以第一代树状体(PPIHA)和氯金酸(HAuCl4)为原料，采用微波回流加热法制备表面氨基修饰的纳米金胶体，将制得的胶体在常温下与待测蛋白质结合形成偶联物，接着在柠檬酸钠-氯金酸体系中进行纳米金-蛋白偶联物的生物矿化，然后用荧光光谱光谱仪对生物矿化产物进行共振散射光谱分析。因产物共振散射光谱在特征波长处的峰值强度与蛋白质浓度呈线性关系，可对超微量蛋白质进行定量检测。本发明所建立的超微量蛋白质定量方法，简便快速，具有高灵敏、高特异性和准确度。本方法可移植性强，可用于肿瘤早期诊断、食品安全快速检测、水质监测等方面。
文档编号G01N21/66GK102230896SQ20111008993
公开日2011年11月2日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日
发明者刘钊, 朱键, 李剑君, 赵军武 申请人:西安交通大学