专利名称：肌钙蛋白T(Troponin-T,TNT)测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及ー种采用乳胶增强免疫比浊法測定人血清中肌钙蛋白含量的试剂盒。
背景技术：
CTnT是反映心肌细胞损伤的灵敏性、特异性较高的生化指标。CTnT检测敏感性为87. 5%，阴性预期值达92. 9%，准确性66. 7 %。其对AMI的诊断具有较高的灵敏度和特异性。也有学者认为心肌损伤的标志物cTnT和cTnl是诊断AMI的“金标准”。cTnT诊断AMI窗ロ期为3小时至21日，更适用于确诊那些发病超过3日且心电图不能确定诊断的AMI病 例。Msir等发现cTnT、cTnI和CK-MB (质量分析)的4小时AMI诊断的阳性率分别为55%、59%、64%。而另ー个试验认为TnT在胸痛发作后6小时内是心肌损伤的敏感标志物，并且可以与“金标准” CK-MB(质量分析)相比较，同时发现cTnT的诊断特异性仅46%。分析其原因可能是ー定数量的病人在不稳定型心绞痛时仅有微小心肌损伤的结果。亦有人认为与CK/CK-MB活性比较，cTnT和cTnl —致阴性的病例可排除诊断AMI/不稳定型心绞痛(UAP)，提示cTnT是ー极有价值的临床指标。目前在临床上使用的TNT检测方法有放射免疫法(IRA)，此法直接可以测血浆，但该法有环境污染以及对操作者有一定的放射性辐射；化学发光法，该法较放射免疫法较为敏感，准确，但成本相对昂贵，需要配套的仪器才可以使用；酶免疫法(ELISA)，存在操作繁琐，标本需要预处理，检测时间长等缺点。而胶乳增强免疫比浊法具有操作简便，快速，检测灵敏度高、特异、定量准确等优点，在临床应用能得到广泛认可。
发明内容
本发明的目的是建立ー种新的检测方法，通过羊抗人的肌钙蛋白T抗体与胶乳颗粒偶联，采用胶乳增强比浊法来測定人体血清中TNT的含量，运用该方法的试剂应具有不需要预处理标本，操作简单，准确度高，重复性好，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪及分光光度计上使用。为了解决上述的技术问题，本发明实现了以下技术I. ー种采用胶乳增强免疫比浊法检测TNT含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1，R2以及校准品；所述试剂Rl :PH值为6. 5-8. O的缓冲液，所述试剂R2为抗人TNT抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的TNT的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然TNT。2.所述的TNT检测试剂盒中的Rl试剂主要包含缓冲液，无机盐，加速剂和防腐剤。3.所述的TNT检测试剂盒中R2试剂主要包含稳定剂，抗人单(多)克隆抗体胶乳颗粒，缓冲液，稳定剂和防腐剤。其中乳胶微球直径为60-150nm。4.试剂Rl所述的无机盐选自氯化钠，氯化镁，氯化钾ー种或几种。缓冲液为磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。加速剂为聚こニ醇4000，聚こニ醇6000，聚こニ醇 8000
5.试剂R2所选用的抗体为鼠抗人TNT单克隆抗体，羊抗人TNT单克隆抗体，兔抗人TNT单克隆抗体ー种或者几种混合。也可以选鼠抗人TNT多克隆抗体，羊抗人TNT多克隆抗体，兔抗人TNT多克隆抗体其中ー种。 6.试剂R2中的稳定剂选自小牛白蛋白，甘氨酸，明胶，吐温20，曲拉通ー种或者几种。7.本发明所述的试剂R2为抗人TNT抗体胶乳试剂，采用的是抗人的TNT抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心(过滤)的方法去掉未反应的偶联剂以及术反应的抗体，在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散·而成。8.所述抗人TNT抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。步骤I :将胶乳在PH6. 5的溶液中活化。步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化ニ亚胺，加PH7. 5-9. O的缓冲液，加入TNT抗体，在37度反应4小吋。步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. O的封闭液体封闭12小时。步骤5 :将步骤4所得的液体洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。9.作为优选，步骤I中所用的缓冲液为PBS缓冲液，MES缓冲液，碳酸盐缓冲液中的任何一种缓冲液，且浓度在20-100mmol/L，PH在5. 5-6. 5之间。10.作为优选，步骤I中所用的胶乳可以是羧基化的聚苯こ烯胶乳或者是氨基化的聚苯こ烯胶乳。其孔径在60nm-150nm均可。 11.作为优选，步骤I中含有I- (3- ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺、I- (3_ ニ甲基氨基丙基)-3_こ基碳ニ亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者多种。12.作为优选，在步骤2中，去掉溶液I中所含的未反应的物质，采用的是高速冷冻离心机或者超微孔径的过滤膜进行过滤。13.作为优选，在步骤5中，所用的稳定剂是小牛血清白蛋白，明胶，甘氨酸，脱脂奶粉ー种或者几种相混合。15本发明检测的原理是利用抗原抗体反应，先加入试剂R1，使血清中的TNT的位点暴露，当加入抗人的TNT胶乳颗粒溶液，使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物，从而产生一定的浊度，在人血清中TNT的含量在一定的范围内TNT的含量与浊度成正比。再通过标准曲线进行计算，从而得到TNT的含量。16本发明与现有技术相比，具有如下特点I)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，最低检测能够达到O. lng/L，操作简单，快速，从检测到出结果最多只需要10分钟，甚至更短。2)本发明的试剂盒R2试剂中的抗体乳胶的制备由于采用的化学偶联法，稳定性好，在2-8度至少可以保存18个月。而采用物理吸附法的胶乳抗体试剂，批间差异比较大，而且稳定性不好。3)本发明试剂盒与进ロ试剂盒对样品中TNT含量检测的数据经统计分析，无显著性差异，检测结果可靠，在临床上可以替代进ロ试剂或者化学发光试剂，大幅降低成本以及检测时间。
图I为本发明实施例I的校准曲线图2为本发明实施例I的测定值与化学分光试剂盒测定值的相关分析。实施案例本发明公开了ー种检测TNT含量的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进エ艺參数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明内。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围对本文所述的方法和应用进行改动或者适当变更与组合，本实现和应用本发明技木。下面以具体的实施例对本发明做进ー步说明。 一、TNT试剂R2即抗人TNT抗体胶乳试剂的制备I :将2g孔径大小为80nm的羧基化的胶乳加入到50ml的含有1_(3_ ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺200mg/L的PH7. O的O. 4mol/L的MES缓冲液中，反应2小时。2 :将反应液分成5ml/管，在转速为16000转/分的高速冷冻离心机中离心30分钟后，去掉上清液，每管加浓度为O. 4mol/L的磷酸盐缓冲液5ml混匀。继续在速为16000转/分的高速冷冻离心机中离心30分钟后，去掉上清液，每管加浓度为O. 4mol/L的磷酸盐缓冲液5ml混匀。3，每管加入羊抗人TNT抗体lOOmg，在37度反应6小时。4 向每管中加入含有5g/L的6氨基己酸PH 8. O的磷酸盐缓冲液10ml。5 :每管液体加小牛白蛋白O. 08g，摇匀反应12小时。5 :将所得的液体通过2次离心，转速为16000转/分，洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有O. 5g/L的明胶和O. 2g/L小牛白蛋白和O. 05%的曲拉通以及O. lg/L叠氮钠的
O.4mol/LPBS缓冲液分散即可。ニ、TNT试剂Rl即样品缓冲液的制备
磷酸ニ氢钠2. 86g/L
磷酸氢ニ钠28. 65g/L
氯化钠6. 87g/し
氯化镁O. 34g/L
聚こニ醇 600018. 5g/L
叠氮钠1.5g/l.
纯水IL三TNT试剂中校准品的制备I)校准品稀释液磷酸ニ氢钠‘とS6g/I.
磷酸氢ニ钠狀.65g/L
氯化钠9g/L
小牛白蛋白5()g/L 叠氮钠2.5g/l
稳定剂1(.)k/L2)按照需要的TNT參考校准品浓度将相应的重组TNT纯品320ng加入校准品稀释液20ml的缓冲液中，制备得到16ng/ml浓度的TNT校准品在使用的时候在用缓冲液按照比例稀释成多个浓度。四)TNT测定方法(日立7060全自动生化分析仪)校准品浓度16ng/ml8ng/ml 4ng/ml 2ng/ml Ong/ml测定波长主波长576nm 副波长800nm试剂比例R1 R2 S = 200ul 50ul 20ul校准方式spline读点方式在试剂Rl与样品加入，反应5分钟，读点Al，然后加入R2后，反应5分钟，再读点A2，计算吸光度的变化。校准曲线见图I五)本发明所述试剂盒的分析性能评估I.灵敏度测定用本发明所述的试剂盒对空白样本(含有5%牛血清的生理盐水)重复测定20次，最低检测限度为空白的均值浓度加上ニ个标准差，得到最低检测限度为O. 12ng/ml。2.线性评估取浓度将近50ng/ml (43. 2ng/ml)的临床血清标本,进行稀释,至少稀释6个点，姆个点重复测定3次，根据式⑴，(2)，(3)计算出直线方程y = a+bx
权利要求
1.ー种采用胶乳增强免疫比浊法检测人血清中TnT含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂Rl，R2以及校准液；所述试剂RlPH值为6. 5-8. O的缓冲液，所述试剂R2为抗人TNT抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的TNT的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然TNT。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人TNT抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
步骤I :将羧化的胶乳在PH6. 5的溶液活化。
步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化ニ亚胺，加PH7. 5-9. O的缓冲液，加入TNT抗体，在37度反应4小时。
步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。
步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. O的封闭液体封闭12小吋。
步骤5 :将步骤4所得的液体离心去上清液，取沉淀后用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤I所述溶液为含有I-(3- ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺、I-(3-ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者ニ种。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤3所述溶液含有6-氨基己酸，甘氨酸
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤2所述的洗涤过程为高速冷冻离心机离心或者是用孔径小于IOOnm的中空纤维管状进行过滤。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤4所述溶液含有的稳定剂选自甘氨酸，小牛血清，以及吐温-20、曲拉通等表面活性剂以及氯化钠、氯化镁中的一种或者几种。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤4所述溶液含有的甘氨酸，小牛血清的浓度为O. 05-0. 5% (质量分数)吐温-20或者曲拉通浓度为O. 005-0. 01 % (体积分数)氯化镁、氯化钠的浓度为O. 05-0. 15% (质量分数)。
全文摘要
本发明涉及一种测定血清中的肌钙蛋白T含量测定的试剂盒。所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪以及各种特种蛋白仪的免疫比浊法检测肌钙蛋白T含量的试剂盒。技术方案是免疫增强比浊法检测肌钙蛋白T试剂盒，包括a、试剂R1缓冲液、防腐剂、加速剂、无机盐、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2缓冲液、结合有抗人的肌钙蛋白抗体、防腐剂，乳胶微球直径为60-150nm；c、参考校准品缓冲液，稳定剂，防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人蛋白肌钙蛋白T纯品，其余为纯化水。
文档编号G01N33/531GK102841206SQ201110168449
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者何仕钊, 王徽 申请人:南京诺尔曼生物技术有限公司