专利名称：检测脑炎类病毒的ELISA-Array方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测脑炎类病毒的ELISA-Array方法及其专用试剂盒。
背景技术：
我国是脑炎类病毒危害严重的国家，正确诊断致病菌是有效控制其传播的基础， 也是进行有效治疗的关键。我国所流行的脑炎类病毒性病原体，主要包括日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)、蝶传脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus, TBE)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒(Dengue virus, DV)等，均为虫媒传播的病毒，其中日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalliis virus，JEV)、蜱传脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus，TBE)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus,EEEV) 可引起严重的脑炎症状，并具有较高的致死率，辛德比斯病毒(Sindbis Virus)和登革病毒 (Dengue virus,DV)的临床症状较为轻微，针对以上病原体，临床上应采取不同的治疗手段和防控措施，但以上病毒均为虫媒传播，早期均有相似的症状，因此，建立准确的早期诊断方法，对于脑炎类病毒病的防控具有重要价值。目前已有多种可同时检测多种抗原的技术方法，包括双相凝胶电泳、蛋白芯片、质谱、液相悬浮芯片技术等。然而，由于操作复杂、成本高，这些技术难以进行临床应用。ELISA-Array技术是一种新型检测系统，它在传统ELISA技术基础上发展而来，集合了酶联免疫分析(ELISA)和微阵列(Array)技术而形成的新一代检测技术体系。既秉承了蛋白芯片技术高通量、高平行的特点；同时该技术还保持ELISA方法的成熟、操作简便、 成本低的优势，针对病原体的ELISA-Array技术检测，国内尚无其他单位研究。该技术将各种抗体由大规模全自动点样设备以微阵列的形式排布于微孔板板孔内，可用于同时检测多种病原体，数十倍提高了 ELISA检测的通量。由于每个微孔实现了一份样本的多种检测，使用中减少了临床标本和检测试剂的用量。在操作技术上，该技术流程与传统ELISA方法基本相同，所用耗材为96孔酶联板， 仪器为酶联自动洗板仪、酶联反应仪，可用排枪加样，反应过程中所用试剂也与传统ELISA 相同。仅在显色和结果读取过程与传统ELISA有差异。以化学发光试剂代替了传统ELISA 中所使用的TMB(或DAB)底物，从而进一步放大信号，以芯片阅读仪检测实验结果，代替了酶联检测仪。因此，使用单位可沿用大部分已有的ELISA相关仪器，且技术人员不需要很高的专业背景和复杂的操作培训，易于基层检测单位的接受和推广。目前，国内外仅有ELISA-Array技术用于肿瘤标志物的研究报道，尚未用于传染病的检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测脑炎类病毒的抗体组。
本发明提供的抗体组，包括6种捕获抗体；所述6种捕获抗体分别为抗日本乙型脑炎病毒的抗体4D5、抗蜱传脑炎病毒的抗体2B5、抗辛德比斯病毒的抗体IFl、抗登革病毒2型的抗体2B8、抗登革病毒4型的抗体4F9 和抗东部马脑炎病毒的抗体4E11。所述每种捕获抗体均以捕获抗体溶液的形式存在；每种所述捕获抗体溶液均按照如下方法制备将所述捕获抗体与点样液混合得到的捕获抗体溶液，所述捕获抗体在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度为0. 025mg/ ml-0. 2mg/ml ；所述点样液按照如下方法制备将甘油、Triton-XlOO和浓度为0. 01M、PH为7. 2 的磷酸盐缓冲液混合，得到点样液，所述甘油在所述点样液中的浓度为15% -25% (体积百分含量)，所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0. 001%-0. 006% (体积百分含量)。所述捕获抗体2B8、4D5、2B5、4E111和IFl在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度均为0. 05mg/ml，所述捕获抗体4F9在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度为0. lmg/ml ；所述甘油在所述点样液中的浓度为20% (体积百分含量)，所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0.004% (体积百分含量)。所述抗体组还包括3种检测抗体抗乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和/或登革病毒的抗体2A10、抗辛德比斯病毒的抗体IFl和抗东部马脑炎病毒的抗体4E11。所述2A10、1F1 和 4E11 的效价分别为(1 320), (1 80), (1 80)；每种所述检测抗体均以标记物标记检测抗体的形式存在；所述标记物标记检测抗体中的标记物为生物素。ELISA实验检测中3株检测抗体生物素标记2A10，生物素标记IFl和生物素标记 4E11的效价，分别采用的抗原为蜱传脑炎病毒灭活抗原、辛德比斯病毒灭活抗原、东部马脑炎病毒灭活抗原，病毒滴度分别为2X 106PFU/ml，2X 107PFU/ml，2. 5X 106PFU/ml，检测体积均为50 μ L0所述抗体组由所述6种捕获抗体和所述3种检测抗体组成；所述抗体组中的每种抗体均为独立包装；所述抗体组中的每种抗体均为单克隆抗体；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒 (Japanese Encephalitis virus)、!^7!专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型(Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。本发明的另一个目的是提供一种用于检测脑炎类病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括所述的抗体组；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒 (Japanese Encephalitis virus)、!^7!专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型(Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。本发明的第三个目的是提供一种检测脑炎类病毒的酶标板。本发明提供的酶标板，按照如下方法制备在酶标板的每个孔中加入以下6种捕获抗体抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5、抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5、抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1、抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8、抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9和抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11，每种所述捕获抗体以捕获抗体溶液的形式加入；所述抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5的溶液30nl ；所述抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5的溶液30nl ；所述抗辛德比斯病毒的单克隆抗体IFl的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗辛德比斯病毒的单克隆抗体IFl的溶液30nl ；所述抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗登革病毒2 型的单克隆抗体2B8的溶液30nl ；所述抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9，溶质在溶液中的浓度是0. lmg/ml ；每个孔中加入抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9的溶液30nl ；所述抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11的溶液30nl ；所述点样液按照如下方法制备将甘油、Triton-XlOO和浓度为0. 01M、PH为7. 2 的磷酸盐缓冲液混合，得到点样液，所述甘油在所述点样液中的浓度为20% (体积百分含量)，所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0. 004% (体积百分含量)。本发明的第四个目的是提供一种检测脑炎类病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括所述的酶标板和检测抗体混合液；所述检测抗体的混合液按照如下方法制备将抗乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和 /或登革病毒的单克隆抗体2A10、抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1、抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11与抗体稀释液混合，得到检测抗体的混合液，所述2A10 IFl 4E11 抗体稀释液的体积比为1 4 4 320;所述2A10、1F1 和 4E11 的效价分别为(1 320), (1 80), (1 80)；所述2A10、1F1和4E11均以标记物标记抗体的形式存在；所述标记物具体为生物素。所述的抗体组或所述的试剂盒在制备检测脑炎类病毒产品和/或检测脑炎类病毒中的应用也是本发明保护的范围；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒 (Japanese Encephalitis virus)、!^7!专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型(Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。本发明的第五个目的是提供一种检测待测样本中脑炎类病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将所述的抗体组或所述的试剂盒中6种捕获抗体均点样在点样孔中，得到含有捕获抗体的点样孔；2)向步骤1)得到的点样孔中加入待测样本，孵育，得到加样后点样孔；3)向步骤2、得到的加样后点样孔中加入所述的抗体组或所述的试剂盒中的3种检测抗体的混合液，孵育，得到一抗结合点样孔；4)向步骤幻得到的一抗结合点样孔中加入HRP标记的亲和素，孵育，得到二抗结合点样孔；5)向步骤4)得到的HRP标记的亲和素结合点样孔中加入化学发光液，进行扫描检测，若检测到在对应捕获抗体的所在位置无相互作用，则样品不含有或不候选含有对应的脑炎类病毒；若检测到在对应捕获抗体所在位置有相互作用，确定样品中含有或候选含有对应的脑炎类病毒。步骤1)中，所述6种捕获抗体的加入体积比为1 :1:1:1:1: 1 ；每一种捕获抗体点样量均为30nl/每孔；步骤2)中，所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为池；待测样本的加入量为 50ul/ 孔；步骤幻中，所述检测抗体的混合液按照如下方法制备将所述3种检测抗体与抗体稀释液混合，得到3种检测抗体的混合液，所述2A10 IFl 4E11 抗体稀释液的体积比为 1 4 4 320 ；所述抗体稀释液为含5%小牛血清的浓度为0. 01M, PH为7. 2的磷酸盐缓冲液；所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为池；步骤4)中，所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为Ih ；在步骤1)和步骤2、之间还包括封闭、洗涤的步骤。所述待测样本为离体血清、脑脊液或脑炎类病毒培养物；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒 (Japanese Encephalitis virus)、!^7!专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型(Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。本发明的实验证明，本发明制备了 6种脑炎病毒的特异性单克隆抗体，通过利用该ELISA-Array技术平台，并进行实验条件的优化，建立了可同时检测6种脑炎类病毒的 Array-ELISA技术，可用于6种脑炎相关病毒(日本乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、东部马脑炎病毒、辛德比斯病毒、登革病毒2型、登革病毒4型)的检测，该技术方法与普通ELISA相比，特异性相当，灵敏性高，最高可达10倍以上，具有较高的临床应用前景。
图1为不同点样液及2B5抗体不同点样浓度的检测结果图2为4D5、2B8、1F1、4E11、4F9抗体不同点样浓度的检测结果
图3为六种脑炎病毒的ELISA-Array检测结果图4为多种脑炎病毒同时检测的ELISA-Array结果图5为利用无关抗原对阵列3的特异性检测结果图6为3份TBEV感染病人血清的检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、ELISA-Array的条件摸索一、抗体点样条件的优化1、单克隆抗体的制备和纯化单克隆抗体4D5，2B5，1F1，2B8，4F9，4E11和2A10 (均记载在单克隆抗体2A10在蛋白芯片技术检测黄病毒属病毒中的应用，孙婷婷，李裕昌，刘洪，康晓平，林方，祝庆余，杨银辉，鲁承，中华微生物和免疫学杂志，2010年30卷第8期，775-778，公众均可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。登革病毒单克隆抗体血清学性质研究， 刘景兰，陈万荣，崔振民，辛颜彬，杨保安，徐品芳，祝庆余，阎国珍，中国免疫学杂志，1985年 02期，3-6页，公众均可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。登革 2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定，辛颜彬，杨保安，徐品芳，祝庆余，阎国珍，军事医学科学院院刊，1986年第10卷第1期，59-62页，公众均可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)均通过杂交瘤技术制备获得，并通过亲和层析进行纯化，得到7种抗体。其中，4D5，2B5，1F1，2B8，4F9，4E11为捕获抗体。每株抗体所靶向的病原体如下表2中所示，具体如下4D5为抗日本乙型脑炎病毒(JEV)的单克隆抗体；2B5为抗蜱传脑炎病毒(TBEV) 的单克隆抗体；IFl为抗辛德比斯病毒(SV)的单克隆抗体；2B8为抗登革病毒2型(DV-2) 的单克隆抗体；4F9为抗登革病毒4型(DV-4)的单克隆抗体；4E11为抗东部马脑炎病毒的 (EEEV)单克隆抗体；单抗2A10靶向黄病毒属病毒的保守序列，可作为乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒及登革病毒的共同检测抗体，IFl和4E11既作为捕获抗体，又作为检测抗体。利用生物素标记试剂盒(biotin-NHS ester, Pierce, Germany，产品目录号1854210)对3株检测抗体 (2A10, IFl和4E11)进行生物素标记，标记过程按照说明书操作进行，得到3种检测抗体 生物素标记2A10，生物素标记IFl和生物素标记4E11，通过普通ELISA实验可特异检测到该3株抗体与病毒抗原结合后可分别与亲和素特异性结合，说明该3株抗体已成功标记生物素。ELISA实验检测中3株检测抗体生物素标记2A10，生物素标记IFl和生物素标记 4E11的效价，分别采用的抗原为蜱传脑炎病毒灭活抗原(制备方法见后面)、辛德比斯病毒灭活抗原(制备方法见后面)、东部马脑炎病毒灭活抗原(制备方法见后面)，病毒滴度分别为2 X 106PFU/ml，2 X 107PFU/ml，2. 5 X 106PFU/ml，检测体积均为50 μ L。结果为生物素标记2Α10,生物素标记IFl和生物素标记4Ε11这3株抗体的效价分别为1 320,1 80、 1 80。
2、病毒培养日本乙型脑炎病毒(JEV)(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是杨银辉，朱晓光，张永国，康晓平等。利用基因芯片技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志，2007，30 (12) :1360-1363)、 登革病毒2型(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Murthy HM, Clum S, Padmanabhan R. Dengue virus NS3 serine protease. Crystal structure and insights into interaction of the active site with substrates by molecular modeling and structural analysis of mutational effects. J Biol Chem，1999，274 (9) :5573-5580.)和登革病毒 4 型(Microarray hybridization for assessment of the genetic stability of chimeric West Nile/ dengue 4virus, Laassri M, Bidzhieva B,Speicher J,Pletnev AG, Chumakov L. , J. Med. Voro 1. ,20IlMay ；83 (5) ；910-920，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)接种C6/36 (购自ATCC，CRL-1660)进行培养；辛德比斯病毒(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是熊鸿燕，刘育京等，短波紫外线与交联淀粉碘对血浆中辛德比斯病毒灭活的研究，中国消毒学杂志，1998年第四期)、蜱传脑炎病毒(TBEV，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是胡玉洋，杨银辉，刘洪，康晓平，朱晓光，司炳银，祝庆余，森林脑炎病毒(TBEV)实时定量iTaqMan PCR检测方法的建立，解放军医学杂志2006，31，745-748)和EEEV(东部马脑炎病毒 EEEV 毒株 SSP. North American Variant, GenBank 登录号X63135，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Volchkov. V E, Volchkova. V. A. and Netesov SV, Complete nucleotide sequence of the Eastern equine encephalitis virus genome. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1991,5, 8-15)接种BHK-21细胞(购自ATCC，CAT. CCL 10)进行培养。培养过程均在BSL-2或者BSL-3实验室内进行，具体培养如下分别接种病毒3_4 天，待细胞出现病变后收集细胞培养上清液，进行空斑试验以确定病毒滴度(操作步骤参照医用实验病毒学，1985年，北京，人民军医出版社出版)，6种培养上清的病毒滴度分别为日本乙型脑炎病毒(JEV)培养物106PFU/ml、登革病毒2型培养物106PFU/ml、登革病毒 4型培养物1. 5X 106PFU/ml、辛德比斯病毒培养物2X 107PFU/ml、TBEV蜱传脑炎病毒培养物 2 X 106PFU/ml、EEEV 培养物 107PFU/ml。分别向5种病毒培养上清中加入0-丙内酯至终浓度为0.025%，41过夜进行病毒灭活。第二天于37°C放置lh，将β-丙内酯分解掉，分别得到灭活日本乙型脑炎病毒 (JEV)培养物、灭活登革病毒2型培养物、灭活登革病毒4型培养物、灭活辛德比斯病毒培养物(辛德比斯病毒灭活抗原)、灭活TBEV蜱传脑炎病毒培养物(蜱传脑炎病毒灭活抗原)、 灭活EEEV培养物(东部马脑炎病毒灭活抗原)。3、抗体点样条件的优化在点样过程中，对不同点样液及点样浓度的使用效果均进行了评估，用以摸索最佳的点样条件。分别将上述6种捕获抗体用3种不同的点样液进行稀释点样1、 PBS (0. OlM 的磷酸盐缓冲液，ΡΗ7. 2 (配方如下=IL 水中含 Na2HPO4 · 12H20 2. 86g，NaC18. 5g，NaH2PO4CH2O 0. 312g，)，2、含20% (体积百分含量)甘油的PBS，3、含20%甘油及0. 004% (体积百分含量)Triton-XlOO的PBS0通过观察及分析结果中每个检测点的形状及信号强度来确定最适的点样液及抗体的点样浓度1)分别取3种不同的抗体点样液稀释捕获抗体，2倍系列稀释，浓度为0. 0125、 0. 025,0. 05、0· 1和0. 2mg/ml，共5个不同的点样浓度；2)利用点样仪(BD6000 ；California,USA)将6种捕获抗体均点样在点样孔中，每个孔中点6个捕获抗体，且每个孔的点样阵列1如表IA所示，点于ELISA板中(每一种捕获抗体点样量均为30nl/每孔)；3)点样后用含3% BSA的PBS进行封闭，置37°C孵箱中lh，然后用含0. 的 Tween-20的PBS (PBST)洗涤3次。然后将ELISA板进行干燥，密封，置4°C保存待用；4)采用双抗体夹心的模式进行检测。将由上述步骤2得到的已灭活的TBEV病毒培养物用PBS稀释为5X 105PFU/ml，加入ELISA-Array微孔板中，50ul/孔，37°C孵育浊。 PBS-T洗涤三次；5)加入用抗体稀释液稀释的生物素标记抗体混合液(生物素标记2A10，生物素标记1F1，生物素标记4E11和抗体稀释液的体积比分别为1 :4:4: 320，抗体稀释液为含 5%小牛血清的PBQ，37°C孵育浊。PBS-T洗涤三次；6)加入1 50稀释的HRP标记的亲和素(康为世纪公司产品，CW0124)，50ul/孔， 37°C孵育Ih。PBS-T洗涤三次；7)加入化学发光液，50ul/孔，将微孔板置生物芯片阅读仪中扫描检测。并用 Monster软件进行结果分析。表IA抗体点样阵列权利要求
1.一种检测脑炎类病毒的抗体组，包括6种捕获抗体；所述6种捕获抗体分别为抗日本乙型脑炎病毒的抗体4D5、抗蜱传脑炎病毒的抗体 2B5、抗辛德比斯病毒的抗体1F1、抗登革病毒2型的抗体2B8、抗登革病毒4型的抗体4F9 和抗东部马脑炎病毒的抗体4E11。
2.根据权利要求1所述的抗体组，其特征在于 所述每种捕获抗体均以捕获抗体溶液的形式存在；每种所述捕获抗体溶液均按照如下方法制备将捕获抗体与点样液混合得到的捕获抗体溶液，所述捕获抗体在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度为0. 025mg/ml-0. 2mg/ml ；所述点样液按照如下方法制备将甘油、Triton-XlOO和浓度为0. 01M、PH为7. 2的磷酸盐缓冲液混合，得到点样液，所述甘油在所述点样液中的浓度为15% -25% (体积百分含量)，所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0. 001% -0. 006% (体积百分含量)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体组，其特征在于所述捕获抗体2B8、4D5、2B5、1F1和4E11在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度均为 0. 05mg/ml，所述捕获抗体4F9在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度为0. lmg/ml ；所述甘油在所述点样液中的浓度为20% (体积百分含量)，所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0. 004% (体积百分含量)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的抗体组，其特征在于所述抗体组还包括3种检测抗体抗乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和/或登革病毒的抗体2A10、抗辛德比斯病毒的抗体IFl和抗东部马脑炎病毒的抗体4E11。
5.根据权利要求1-4中任一所述的抗体组，其特征在于所述 2A10、1F1 和 4E11 的效价分别为(1 320), (1 80)、(1 80)； 每种所述检测抗体均以标记物标记检测抗体的形式存在； 所述标记物标记检测抗体中的标记物为生物素； 所述抗体组由所述6种捕获抗体和所述3种检测抗体组成； 所述抗体组中每种抗体均为独立包装； 所述抗体组中每种抗体均为单克隆抗体；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、!^7I专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒 (Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型 (Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。
6.一种用于检测脑炎类病毒的试剂盒，包括权利要求1-5所述的抗体组；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、!^7!专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒 (Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型 (Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。
7.—种检测脑炎类病毒的酶标板，按照如下方法制备在酶标板的每个孔中加入如下 6种捕获抗体抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5、抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5、 抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1、抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8、抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9和抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11，每种所述捕获抗体以捕获抗体溶液的形式加入；所述抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗日本乙型脑炎病毒的单克隆抗体4D5的溶液30nl ；所述抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5的溶液30nl ；所述抗辛德比斯病毒的单克隆抗体IFl的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗辛德比斯病毒的单克隆抗体IFl的溶液30nl ；所述抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗登革病毒2 型的单克隆抗体2B8，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗登革病毒2型的单克隆抗体2B8的溶液30nl ；所述抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗登革病毒4 型的单克隆抗体4F9，溶质在溶液中的浓度是0. lmg/ml ；每个孔中加入抗登革病毒4型的单克隆抗体4F9的溶液30nl ；所述抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11的溶液中，溶剂是点样液，溶质是抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11，溶质在溶液中的浓度是0. 05mg/ml ；每个孔中加入抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11的溶液30nl ；所述点样液按照如下方法制备将甘油、Triton-XlOO和浓度为0. 01M、PH为7. 2的磷酸盐缓冲液混合，得到点样液，所述甘油在所述点样液中的浓度为20% (体积百分含量)， 所述Triton-XlOO在所述点样液中的浓度为0. 004% (体积百分含量)。
8.—种检测脑炎类病毒的试剂盒，包括权利要求7所述的酶标板和检测抗体混合液； 所述检测抗体的混合液按照如下方法制备将抗乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和/或登革病毒的单克隆抗体2A10、抗辛德比斯病毒的单克隆抗体1F1、抗东部马脑炎病毒的单克隆抗体4E11与抗体稀释液混合，得到检测抗体的混合液，所述2A10 IFl 4E11 抗体稀释液的体积比为1 4 4 320;所述 2A10、1F1 和 4E11 的效价分别为(1 320), (1 80), (1 80)； 所述2A10、1F1和4E11均以标记物标记抗体的形式存在； 所述标记物具体为生物素。
9.权利要求1-5中任一所述的抗体组或权利要求7所述的酶标板或权利要求6或8所述的试剂盒在制备检测脑炎类病毒产品和/或检测脑炎类病毒中的应用；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、!^7I专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒 (Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型 (Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。
10.一种检测待测样本中脑炎类病毒的方法，包括如下步骤1)将权利要求1-5中任一所述的抗体组或权利要求7所述的酶标板或权利要求6或8 所述的试剂盒中6种捕获抗体均点样在点样孔中，得到含有捕获抗体的点样孔；2)向步骤1)得到的点样孔中加入待测样本，孵育，得到加样后点样孔；3)向步骤幻得到的加样后点样孔中加入权利要求1-5中任一所述的抗体组或权利要求7所述的酶标板或权利要求6或8所述的试剂盒中的3种检测抗体的混合液，孵育，得到一抗结合点样孔；4)向步骤幻得到的一抗结合点样孔中加入HRP标记的亲和素，孵育，得到二抗结合点样孔；5)向步骤4)得到的HRP标记的亲和素结合点样孔中加入化学发光液，进行扫描检测， 若检测到在对应捕获抗体的所在位置无相互作用，则样品不含有或不候选含有对应的脑炎类病毒；若检测在对应捕获抗体所在位置有相互作用，确定样品中含有或候选含有对应的脑炎类病毒；步骤1)中，所述6种捕获抗体的点样体积比为1 :1:1:1:1:1;步骤2)中，所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为池；步骤幻中，所述检测抗体的混合液按照如下方法制备将所述3种检测抗体与抗体稀释液混合，得到3种检测抗体的混合液，所述2A10 IFl 4E11 抗体稀释液的体积比为 1 4 4 320 ；所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为池；步骤4)中，所述孵育的温度为37°C，所述孵育的时间为Ih ；所述待测样本为离体血清或脑炎类病毒培养物；所述脑炎类病毒为如下6种脑炎病毒中的至少一种日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、!^7I专脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、东部马脑炎病毒 (Eastern equine encephalitis virus)、辛德比斯病毒(Sindbis Virus)、登革病毒 2 型 (Dengue 2virus)禾口登革病毒 4 型(Dengue 4virus)。
全文摘要
本发明公开了一种检测脑炎类病毒的ELISA-Array方法及其专用试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括6种捕获抗体，每种所述捕获抗体为将抗体与点样液混合得到的混合液，每种所述捕获抗体中所述抗体在对应的所述捕获抗体溶液中的浓度均为0.05mg/ml。本发明的实验证明，本发明制备了6种脑炎病毒的特异性单克隆抗体，通过利用该ELISA-Array技术平台，并进行实验条件的优化，建立了可同时检测6种脑炎类病毒的Array-ELISA技术，可用于6种脑炎相关病毒的检测，该技术方法与普通ELISA相比，特异性相当，灵敏性高，最高可达10倍以上，具有较高的临床应用前景。
文档编号G01N33/577GK102426237SQ201110263488
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者常国辉, 康晓平, 户义, 李裕昌, 李靖, 杨银辉, 林方, 祝庆余, 范丽, 魏婧靖 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所