专利名称：一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法
技术领域：
本发明涉及一种准确检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法，具体属于大气颗粒物和工业纳米颗粒污染风险评价技术领域。
背景技术：
大气颗粒物已经成为我国城市大气的首要污染物，而大气纳米颗粒(或大气超细颗粒)是大气颗粒物重要组成部分。工业纳米颗粒是指在三维空间中至少有一维的尺度处于f IOOnm的颗粒，目前工业纳米颗粒已广泛应用于涂料、化妆品、催化剂、医学等领域中，工业纳米颗粒在生产和使用的过程中会有意或无意的散发到大气中，成为大气纳米颗粒的一部分。对大气纳米颗粒和工业纳米颗粒健康效应的研究已经成为环境毒理学、环境科学等的研究热点。传统的研究方法如MTT (3- (4,5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -3, 5-di-phenytetrazoliumromide, 坐蓝)、U)H (lactate dehydrogenase, Ψ ΜΜΜΜ) 评价方法存在一些缺点，如结果表现不直观，影响因素较多，准确度不高，需要多次重复实验，耗时较多，实验试剂存在致癌性等。因此需要探寻新的方法和手段对大气纳米颗粒和工业纳米颗粒的细胞毒性进行检测和评价。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法。本细胞实验检测方法直接简单，可同时检测多种纳米颗粒；其结果显示为图像和数据，使大气纳米颗粒和工业纳米颗粒的细胞毒性差异直观形象，准确度
尚ο本发明的基本构思是
利用 DCFH-DA (2\7~-dichlorodihydrofluorescin diacetate, 2~，7~_ 二氯荧光黄双乙酸盐)法检测细胞内活性氧的含量是区分大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的理想方法。活性氧(reactive oxygen species，R0S) —般包括氧化氢、超氧自由基、羟自由基等，活性氧过高会引起细胞毒性，导致细胞膜通透性改变、DNA损伤等。DCFH-DA是一种非极性、非荧光的化学物质，能够穿透细胞膜，被细胞内的酶降解为还原性二氯荧光素 T -dichlorodihydrof luorescin, DCFH)，DCFH可被活性氧(ROS)自由基氧化成为高效荧光物质氧化性二氯荧光素(2\7:diChl0r0fluOTesCin，DCF)。通过检测荧光强度可得知细胞内活性氧的含量，因此，利用DCFH-DA法区分大气纳米颗粒和工业纳米颗粒的细胞毒性的差异已成为可能。为了达到上述目的，基于以上发明构思，本发明采用下述技术方案
一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法，它的操作顺序和步骤如
下
a.把用胰酶消化下来的细胞吸入离心管中，弃去上清液，加入培养基配成细胞悬浮液，并用移液枪吹打 使细胞分散均勻，接种于细胞培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养24 小时；
b.将配制的颗粒物溶液与培养基混合，配成染毒溶液；使用移液枪将细胞培养皿中废液吸出，用D-hanlTs平衡盐溶液清洗细胞；然后用移液枪吸取染毒溶液滴加到细胞培养皿中对细胞进行染毒，放入培养箱中培养4小时；
c.用D-HanlTs平衡盐溶液清洗细胞，然后分别加入DCFH-DA荧光探针与培养基的混合溶液，用锡箔纸密闭包裹，放入培养箱中培养0. 5小时；
d.用D-HanlTs平衡盐溶液清洗细胞，在倒置荧光显微镜下观察荧光强度及荧光分布，并拍照；
e.通过荧光分析软件处理图片得到初始数据并分析比较。本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点
(1)细胞制片快速简单，原材料容易购买；
(2)细胞检测方法结果准确，影响因素较少，并可同时检测多种纳米颗粒；
(3)实验试剂安全可靠，没有较大的毒性；
(4)结果显示为图像和数据，既可以通过图片直接观测荧光强度的强弱来比较分析细胞毒性的差异，也可以通过数据来分析细胞毒性的差异。
图1为检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的实验原理图2为实施例1利用DCFH-DA法检测大气纳米颗粒物染毒组分荧光强度的大小； 图3为实施例1利用DCFH-DA法检测工业纳米NiO颗粒染毒组分荧光强度的大小； 图4为实施例1利用DCFH-DA法检测工业纳米ZnO颗粒染毒组分荧光强度的大小； 图5为实施例1利用DCFH-DA法检测工业纳米CeO2颗粒染毒组分荧光强度的大小； 图6为实施例1通过IPWIN60荧光分析软件及Excel处理后得出的具体荧光强度数
据；
图7为实施例2利用DCFH-DA法检测工业纳米NiO颗粒染毒组分荧光强度的大小； 图8为实施例2利用DCFH-DA法检测工业纳米CeO2颗粒染毒组分荧光强度的大小； 图9为实施例2通过IPWIN60荧光分析软件及Excel处理后得出的具体荧光强度数据。
具体实施例方式下面结合
对本发明的实施例作进一步详细描述。实施例1
如图1所示，一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法，它的操作顺序和步骤如下
a.把用胰酶消化下来的细胞吸入离心管中，弃去上清液，加入含10%胎牛血清的培养基配成3mL的IXlO5个/mL细胞悬浮液，并用移液枪吹打使细胞分散均勻，接种于细胞培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养24小时；
b.将配制的工业纳米NiO、ZnO,CeO2颗粒物以及大气纳米颗粒物溶液分别与培养基混合，配成4种5(^g/mL的染毒溶液；使用移液枪将细胞培养皿中废液吸出，用2mL D-hank~ s平衡盐溶液清洗细胞；然后用移液枪吸取染毒溶液滴加到细胞培养皿中对细胞进行染毒， 放入培养箱中培养4小时；
c.用2mLD-HanlT s平衡盐溶液清洗细胞，然后分别加入2mL DCFH-DA荧光探针与培养基的混合溶液(荧光探针与培养基的体积比为1 :2100)，用锡箔纸密闭包裹放入培养箱中培养0.5小时；
d.利用D-HanlTs平衡盐溶液清洗细胞，在倒置荧光显微镜下观察荧光强度及荧光分布，拍照；
e.通过荧光分析软件IPWIN60处理图片得到初始数据，使用Excel分析比较。如图2、图3、图4、图5所示，均为实例1所描述的利用倒置荧光显微镜观测细胞后所拍的图片，图6为使用IPWIN60处理图片得到初始数据，用EXCEL比较分析后的数据图， 结果显示，颗粒物染毒组分细胞内荧光强度大小依次为纳米Μ0>纳米Ζη0>大气纳米颗粒 >纳米CeO2,即颗粒物对细胞毒性的大小为纳米Μ0>纳米Ζη0>大气纳米颗粒 > 纳米Ce02。实施例2
在本实例中，细胞培养和接种与实施例1 一致，染毒过程略有不同，不同之处在于配成 100 μ g/mL的染毒溶液，染毒组分只有工业纳米NiO和纳米CeO2颗粒。如图7、图8所示，均为实例2所描述的利用倒置荧光显微镜观测细胞后所拍的图片，图9为使用IPWIN60处理图片得到初始数据，结果显示，工业纳米NiO颗粒染毒组分荧光强度较强，工业纳米CeO2颗粒染毒组分荧光强度较弱，但随着染毒浓度的增加，工业纳米 NiO颗粒和CeO2的荧光强度较实施例1中有所增强。
权利要求
1. 一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法，其特征在于，它的操作顺序和步骤如下a.把用胰酶消化下来的细胞吸入离心管中，弃去上清液，加入培养基配成细胞悬浮液，并用移液枪吹打使细胞分散均勻，接种于细胞培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养24 小时；b.将配制的颗粒物溶液与培养基混合，配成染毒溶液；使用移液枪将细胞培养皿中废液吸出，用D-hanlTs平衡盐溶液清洗细胞；然后用移液枪吸取染毒溶液滴加到细胞培养皿中，放入培养箱中培养4小时；c.用D-HanlTs平衡盐溶液清洗细胞，然后分别加入DCFH-DA荧光探针与培养基的混合溶液，用锡箔纸密闭包裹，放入培养箱中培养0. 5小时；d.用D-HanlTs平衡盐溶液清洗细胞，在倒置荧光显微镜下观察荧光强度及荧光分布， 并拍照；e.通过荧光分析软件处理图片得到初始数据并比较分析。
全文摘要
本发明涉及一种检测大气纳米颗粒和工业纳米颗粒细胞毒性差异的方法，步骤如下a.用培养基配成细胞悬浮液，接种于细胞培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养24小时；b.将配制的颗粒物溶液与培养基混合，配成染毒溶液；用D-hank`s平衡盐溶液清洗细胞；对细胞进行染毒，放入培养箱中培养4小时；c.加入DCFH-DA荧光探针与培养基的混合溶液，用锡箔纸密闭包裹，放入培养箱中培养0.5小时；d.在倒置荧光显微镜下观察荧光强度及荧光分布，并拍照；e.通过荧光分析软件处理图片得到初始数据并分析比较。本方法 细胞制片快速简单，原材料容易购买；细胞检测方法结果准确，影响因素较少，并可同时检测多种纳米颗粒；实验试剂安全可靠，没有较大的毒性。
文档编号G01N21/64GK102346147SQ20111027387
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者任晶晶, 吕森林, 张睿, 易飞, 郝晓洁 申请人:上海大学