专利名称：一种采用指示剂置换反应的氯溴碘离子半定量检测方法
技术领域：
本发明涉及置换反应，具体地说是一种采用指示剂置换反应的氯溴或碘离子的半定量检测方法。
背景技术：
无机离子，特别是氯、溴和碘离子，在环境、工业以及生物中扮演着极为重要的角色。举个离子，氯离子保持着细胞的渗透平衡，并且调节着人体的PH值；溴离子，通常被用来作为镇静剂，调节中枢神经系统。碘离子，能够从本质上阻断过量的甲状腺激素释放到血液中，从而帮助抑制诸如焦虑、暴躁等症状。这些卤素阴离子一方面对生命具有不可或缺的重要性，另一方面，过量的卤素阴离子却有着致命的毒性。
国际上目前广泛采用的卤素离子定性定量检测技术包括库伦滴定法、离子选择电极法、流动注射法、传感器法等。各种基于氢键的受体也相继被研究，如基于NH的氨基化合物、尿素、硫脲等，以及基于CH的各种受体等。然而，这些无机阴离子的传感相对来说比较困难，尤其是在水中。这很大程度上是由于阴离子通常具有较低的电荷/半径比，从而使得他们对受体的静电键合效率较低。更重要的是，氯、溴、碘离子具有相对较高的溶剂化自由能，这就意味着受体必须与介质有效竞争。目前为止，还没有一种较有效并且便利的方法用于这些阴离子的快速检测。
银离子通常用来定性区分氯、溴和碘离子。然而，其相对较弱的颜色区别(AgCl白色，AgBr浅黄色，AgI黄色)使得对这些沉淀的颜色区分变得尤其困难。并且，由于过量的氯、溴或碘离子会使其生成的沉淀进一步溶解，采用这种方法对这些卤素离子的定量分析几乎显得不可能。发明内容
本发明的目的在于提供一种基于指示剂置换反应的氯、溴或碘离子半定量检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
I)金属离子显色剂与金属离子螯合①5-100 μ L O. 01mol/L硝酸银水溶液加入到 0.5-5mL O.1mM 3，5_Br2_PADAP ([2-(3，5) - 二溴-2-吡啶偶氮]-5-二乙氨基苯酚)金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；②5-100 μ L O.Olmol/L氯化汞水溶液加入到0. 5-5mL 0. lmM3,5-Br2-PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀5-100 μ L 0. 01mmol/L硝酸银水溶液加入到0. 5_5mL 0.1 μ M3， 5-Br2-PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液中(体积比1:1)，充分混匀5-100 μ L0.01_01/1氯化汞水溶液加入到0. 5-5mL 0.1 μ M3，5_Br2_PADAP ([2-(3，5) -二溴-2-卩比啶偶氮]-5-二 乙氨基苯酚)金属离子显色剂的醇水混合溶液中(体积比1: 1)，充分混匀；
2)指示剂的置换反应分别加入100 μ M-1OmM浓度的氯、溴或碘离子钠盐水溶液到上述显色剂与金属离子螯合的有色溶液中，经充分反应后，10000-15000rpm离心2_5分钟；
3)比色读取取内径O. 5-1. 7毫米，外径1. 5-2. 5毫米的石英管，蘸取离心后的上层清液，溶液在毛细作用下吸入石英管中；将与氯、溴或碘离子钠盐水溶液反应后的硝酸银螯合有色溶液以及氯化汞螯合有色溶液的上层清液吸取到石英管中后，与不同浓度有色螯合物置换反应后的多个石英管并排放置，构成阵列。
4)采用CCD、数码相机或扫描仪等彩色成像设备对石英管阵列一次成像，提取各个透明石英管中溶液的颜色信息，通过Photoshop等软件对这些溶液的颜色信息进行数字化处理，选取有代表性的多个区域，得到其图像对应的RGB值，并进行平均。将其平均后的 RGB值按照比例进行条形码的可视化处理，条形码码条宽度代表其按比例缩放的红、绿、蓝值。
5)数理统计将阵列对微摩尔至毫摩尔级几个不同标准浓度下氯、溴和碘离子的颜色数字化并构建相应的“指纹图谱”后，为减少样本偏差，对每种实验重复5-10次对应实验，将所有氯、溴或碘离子在特定浓度下对应的每组实验的R，G, B值构建矩阵，采用多维变量统计软件包(Matlab, MVSP (Mult1-Variate Statistic Package)或 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences)等统计软件,将矩阵导入软件后,在软件中采用聚类分析或主成分分析等数理统计方法对结果进行归类；对于未知样本，结合已有指纹图谱库及聚类分析后的结果，进行归一化，由未知样本归一的类别判定其为何种卤素离子及其半定量的大致浓度范围。
具体为
一种采用指示剂置换反应的氯、溴或碘离子半定量检测方法，所述方法包括金属离子显色剂与金属离子螯合，指示剂置换，比色读取，以及样品测定，其特征在于
以金属离子显色剂(3，5-8^^^么？([2-(3，5)-二溴-2-吡啶偶氮]-5-二乙氨基苯酚)与金属离子的螯合物作为氯、溴或碘离子检测的指示剂；为检测较宽浓度范围，以多种不同浓度有色螯合物作为检测单元，提取每种有色螯合物对应的颜色信息，将所有这些颜色信息归总，构建阵列系统；基于银离子和汞离子能与氯、溴或碘离子形成沉淀，在氯、溴或碘离子过量情况下，沉淀进一步溶解的原理，构建氯溴或碘离子与指示剂共同竞争金属离子的反应；沉淀经离心滤去后，由透明石英玻璃管吸取上层清液，通过提取上层清液颜色信息后，构建阵列系统；
I)显色剂(3，5-8^^^4 ([2-(3，5)-二溴-2-吡啶偶氮]-5_二乙氨基苯酚)与金属离子螯合微摩尔至毫摩尔级浓度硝酸银(或氯化汞)与金属离子显色剂按1:1摩尔比混合,产生颜色变化；
2)指示剂的置换反应加入微摩尔至毫摩尔级浓度的氯、溴或碘离子水溶液到上述混合溶液中，经充分反应后，离心除去多余沉淀；
3)比色读取取透明石英管，蘸取离心后的上层清液，溶液在毛细作用下吸入石英管中；将几种不同浓度有色螯合物指示剂作为检测单元，将蘸取其各自反应后上层清液的透明石英管放在一起，构建阵列，一次性对阵列颜色成像，用Photoshop软件对石英管中的颜色进行数字化，构建该特定浓度下的氯、溴或碘离子的“指纹图谱”。分别对从微摩尔至毫摩尔级的氯、溴和碘离子的多个浓度进行测试，将不同浓度下氯、溴或碘离子的“指纹图谱”合并，构建“指纹图谱库”。
4)在未知样品测试过程后,采用数理统计方法,运用Matlab,MVSP(Mult1-Variate Statistic Package)或 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences)等统计软件，将样品的图谱数据与“指纹图谱库”的数据库相对照，从而对未知浓度的氯、溴或碘离子进行定性或半定量的分析。
所述彩色成像设备为(XD、数码相机或扫描仪。
所述数理统计是将图像数字化后对数据聚类分析或主成分分析方法。
所述“指纹图谱”是将图像数字化后的RGB值按比例用条形码方式进行可视化直观显示。
在样品测试过程后，提取石英管中反应后溶液的颜色信息，选定均一的特定区域， 求得其对应的色彩平均RGB值，将直观的图像数字化；
反应后所产生的颜色变化能够通过数字化的形式反映出来，为定量与半定量分析提供依据，同时有利于数据库的数理统计分析，为不同浓度下的氯溴或碘构建与之对应的 “指纹图谱”。
所述色彩平均RGB值对由图像颜色变化构建的数据库进行数理统计分析，采用一种聚类分析或主成分分析用于数据归一化的方法，进行分类。
所述金属离子指示剂为3，5-Br2-PADAP ([2_ (3，5) - 二溴-2-吡啶偶氮]-5- 二乙 氨基苯酹);
透明石英管内径1. 7毫米，外径2. 5毫米；
金属离子指示剂浓度分别为O.1mM和O.1 μ M两种。
所述阵列中具有二种或二种以上不同浓度的指示剂金属螯合物，每种氯溴碘离子都有可能在其它非特异性指示剂上有不同程度的响应，因此可以形成相对应的指纹响应谱，而不仅仅只是一个指示剂响应；增加了传感器的响应维度，有效排除了不同卤素离子对同一种指示剂响应的相互干扰；
CCD、数码相机或扫描仪等，取代大型的光谱仪设备，被用来在线提取指示剂反应前后的颜色变化并进行数字化处理，所形成的颜色阵列构成对应不同浓度氯溴碘离子的 “指纹图谱”。聚类分析和主成分分析等数理统计方法被用来对未知样品进行归类分析。
本发明具有如下优点
1.指示剂置换反应相比较于传统的硝酸银鉴别氯、溴或碘离子而言，其颜色变化明显加强，能在一定程度上提升检测的灵敏度。
2.多种浓度指示剂金属螯合物作为不同检测单元，相互补充，增强了传感器对不同浓度氯、溴或碘离子的区分能力。
3.颜色变化通过数字化的形式反映出来，为定量与半定量分析提供基础，同时有利于数据库的数理统计分析。
图1为反应的原理图。金属离子(Mn+:Ag+/Hg2+)首先与金属离子显色剂(3， 5-Br2-PADAP ([2- (3,5)- 二溴-2-吡啶偶氮]_5_ 二乙氨基苯酚)螯合，产生颜色变化，随后氯、溴或碘离子(钠盐)与指示剂一道竞争金属离子，最终生成沉淀，将金属离子从指示剂螯合物中置换出来，使有色金属离子螯合物的颜色变回到初始或接近金属离子显色剂初始的状态。过量的卤素离子与生成的沉淀又可以进一步反应，生成可溶性的配合物，使竞争反应不拘泥于简单的1:1反应，从而为比例阵列式设计提供依据。
图2为两种不同浓度(O.1mM和O.1 μ Μ)的金属显色剂螯合物构建的比色传感器阵列，经由0.5mM溴离子(钠盐)竞争后，银离子与汞离子分别被不同程度地置换出来，使指示剂颜色回归到或靠近初始的颜色。各石英管采集溶液的平均RGB值标于对应下方。
图3为条形码方式表达的可视化不同浓度(1χ1(Γ5，5χ1(Γ5，1χ1θΛ5χ1θΛ χ1(Γ3， 5χ10_3以及Ixl0_2mol/L)氯、溴或碘离子钠盐水溶液的“指纹图谱”。
图4 为该阵列对不同浓度(IxlO-5, 5χ1(Γ5，1χ1θΛ 5χ1θΛ IxlO-3, 5xl(T3 以及 Ixl0_2mol/L)氯、溴或碘离子钠盐水溶液响应的聚类分析。每种浓度氯、溴或碘离子进行5 次平行试验，阵列设计优良的重现性确保了同一种浓度下的同一种卤素离子的5组平行试验很好地归为一类；同时，建立在不同浓度氯、溴或碘离子数字化后“指纹图谱”的数据库基础上，多维度的响应使得其彼此得以有效区分。
图5为该阵列方法对未知样本的检测试验。从图中可看出，未知样本归类到碘离子1x10_4M区间，由此大致得知未知样本为碘离子，其浓度约为1x10_4M。
具体实施方式
标准“指纹图谱”库的建立
具体为
I)金属离子显色剂与金属离子螯合①20 μ L O. Olmol/L硝酸银水溶液加入到1.98mL O.1mM 3，5_Br2_PADAP ([2-(3，5) - 二溴-2-吡啶偶氮]-5-二乙氨基苯酚)金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；②20yL O. Olmol/L氯化汞水溶液加入到1.98mL 0.1mM 3，5_Br2_PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1) 中，充分混匀逾20 μ L 0. 01mmol/L硝酸银水溶液加入到1. 98mL 0.1 μ M 3，5_Br2_PADAP 金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；④20 μ L 0. 01mmol/L氯化汞水溶液加入到1.98mL 0. ΙμΜ 3，5_Br2_PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比 I D中，充分混匀；
2)指示剂的置换反应分别加入 1χ10-5，5χ10_5，1χ1(Γ4，5χ1θΛ 1χ1(Γ3，5χ1(Γ3 以及 Ixl0_2mol/L的氯离子、溴离子或碘离子钠盐水溶液到上述显色剂与金属离子螯合的有色溶液中，经充分反应后，15000rpm离心2分钟。
3)比色读取取内径1. 7毫米，外径2. 5毫米的石英管，蘸取离心后的上层清液， 溶液在毛细作用下吸入石英管中；分别将与氯离子、溴离子或碘离子钠盐水溶液反应后的 0.1mM硝酸银/指示剂，0.1mM氯化汞/指示剂，0.1 μ M硝酸银/指示剂，以及0.1 μ M氯化汞 /指示剂上层清液吸取到石英管中后，构成阵列，采用扫描仪一次对氯离子、溴离子或碘离子钠盐的四种溶液颜色成像，用Photoshop软件对石英管中的颜色进行数字化，选取有代表性的特定区域，提取其RGB值，构建该特定浓度下的氯、溴或碘离子钠盐的“指纹图谱”。
4)对从 I(T2-1(T5HioI/L 浓度范围内(IxlO-5, 5χ1(Γ5，1χ1θΛ 5χ1θΛ IxlO-3, 5xl(T3 以及 lxlCT2mol/LlxlCT5, 5xlCT5, IxlCT4, 5xlCT4, IxlCT3, 5xlCT3 以及 lxlCT2mol/L)的氯、溴或碘离子钠盐重复上述实验，构建不同浓度下氯离子、溴离子或碘离子钠盐水溶液的“指纹图谱” 库。
未知样本的测定
取其中一种卤素离子作为待测样品，按其在O.1mM浓度左右配置未知样本溶液。
I)金属离子显色剂与金属离子螯合①20 μ L O. 01mol/L硝酸银水溶液加入到1. 98mL O.1mM 3，5_Br2_PADAP ([2-(3，5) - 二溴-2-吡啶偶氮]-5-二乙氨基苯酚)金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；②20yL O.Olmol/L氯化汞水溶液加入到1.98mL 0.1mM 3，5_Br2_PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1) 中，充分混匀逾20 μ L 0. 01mmol/L硝酸银水溶液加入到1. 98mL 0.1 μ M 3，5_Br2_PADAP 金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；@20yL 0. 01mmol/L氯化汞水溶液加入到1. 98mL 0. ΙμΜ 3,5-Br 2-PADAP金属离子显色剂的醇水混合溶液(体积比1:1)中，充分混匀；
2)指示剂的置换反应分别加入上述待测样品到显色剂与金属离子螯合的溶液中，经充分反应后，15000rpm离心2分钟。
3)比色读取取内径1. 7毫米，外径2. 5毫米的石英管，蘸取离心后的上层清液， 溶液在毛细作用下吸入石英管中；将与待测样本反应后的0.1mM硝酸银/指示剂，0.1mM 氯化汞/指示剂，0.1 μ M硝酸银/指示剂，以及0.1 μ M氯化汞/指示剂上层清液吸取到石英管中后，并排摆放，构成阵列，采用扫描仪一次对四种溶液颜色成像，选取特定区域，用 Photoshop软件对石英管中的颜色进行数字化，提取数字化后的RGB值，构建该待测样本的 “指纹图谱”。
4)将其“指纹图谱”与不同浓度(1χ1(Γ5，5χ1(Γ5，1χ1θΛ 5χ1θΛ lxl(T3，5xl(T3 以及 Ixl0_2mol/L)下氯离子、溴离子和碘离子的标准“指纹图谱”库比对，得到未知样本所含何种卤素离子的信息。将待测溶液对应的R，G，B值输入上述标准“指纹图 谱库”，采用多维变量统计软件包MVSP(Mult1-Variate Statistic Package)统计软件，将所得矩阵导入软件后， 在软件中采用聚类分析数理统计方法对结果进行归一化，得到未知样品浓度范围的半定量信息；如图5中所示，可知待测样本为碘离子，其大致浓度约为1x10_4M。
本发明将指示剂与金属离子螯合后，借助于氯、溴或碘离子对金属离子的沉淀反应，将金属离子从螯合物中置换出来，从而使螯合物重新回到指示剂初始的颜色。该方法用彩色成像设备(扫描仪，数码相机等)采集指示剂颜色变化，将其颜色变化对应的红、绿、蓝 (RGB)色光谱值构建对应氯溴或碘的“指纹图谱”。在样品测试过程中，采用聚类分析以及主成分分析等数理统计方法，将样品的图谱与“指纹图谱”库相对照，从而对未知的氯、溴或碘离子进行半定量的分析。本方法包括显色剂与金属离子的螯合，指示剂的置换，比色分析等几步。金属离子被卤素离子竞争沉淀后，从螯合物中置换出来，使螯合物颜色变回到初始指示剂的状态，其颜色变化经成像设备采集，并数字化，为定量或半定量测定提供依据，并能对肉眼无法观察到的细小色差进行辨别，进一步提升传感器的检测灵敏度。
权利要求
1.一种采用指示剂置换反应的氯溴碘离子半定量检测方法，包括金属离子显色剂与金属离子螯合，指示剂置换，比色读取，以及样品测定，其特征在于以金属离子显色剂与对应金属离子形成的有色螯合物作为氯、溴或碘离子检测的指示剂；为检测较宽浓度范围，以二种以上Ixl0_5-1x10_2mol/L间不同浓度的这种有色螯合物作为检测单元，提取每种有色螯合物对应的颜色信息，将所有这些颜色信息归总，构建阵列系统；基于银离子和汞离子能与氯、溴或碘离子(钠盐)形成沉淀，在氯、溴或碘离子过量情况下，沉淀进一步溶解的原理，构建氯、溴或碘离子与金属离子显色剂共同竞争金属离子的反应；所生产的沉淀经离心滤去后，由透明石英玻璃管吸取上层清液，通过提取各个沉淀反应后的上层清液颜色信息，将所有这些颜色信息归总，构建阵列系统；1)显色剂与金属离子螯合0.1-1毫摩尔浓度的硝酸银(或氯化汞)与对应金属离子显色剂按1:1摩尔比混合，产生颜色变化；2)指示剂的置换反应加入Ixl0_5-1xl0_2mol/L浓度的氯、溴或碘离子钠盐水溶液到上述混合溶液中，经充分反应后，离心除去多余沉淀；3)比色读取取透明石英管，蘸取离心后的上层清液，溶液在毛细作用下吸入石英管中；将二种以上lX10_5-lX10_2mol/L间不同浓度有色螯合物指示剂作为检测单元，将蘸取其各自反应后上层清液的透明石英管放在一起，构建阵列，一次性对阵列颜色成像，用 Photoshop软件对石英管中的颜色进行数字化，构建该特定浓度下的氯、溴或碘离子的“指纹图谱”。分别对从微摩尔至毫摩尔级的氯、溴和碘离子的多个浓度进行测试，将不同浓度下氯、溴或碘离子的“指纹图谱”合并，构建“指纹图谱库”。4)在未知样品测试过程后，采用数理统计方法，运用Matlab,MVSP(Mult1-Variate Statistic Package)或 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences)等统计软件，将样品的图谱数据与“指纹图谱库”的数据库相对照，从而对未知浓度的氯、溴或碘离子进行定性或半定量的分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述彩色成像设备为CCD、数码相机或扫描仪。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述数理统计是将图像数字化后对数据聚类分析或主成分分析方法。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述“指纹图谱”是将图像数字化后的RGB 值按比例用条形码方式进行可视化直观显示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在样品测试过程后，提取石英管中反应后溶液的颜色信息，选定均一的特定区域，求得其对应的色彩平均RGB值，将直观的图像数字化；反应后所产生的颜色变化能够通过数字化的形式反映出来，为定量与半定量分析提供依据，同时有利于数据库的数理统计分析，为不同浓度下的氯溴或碘构建与之对应的“指纹图谱”。所述色彩平均RGB值对由图像颜色变化构建的数据库进行数理统计分析，采用一种聚类分析或主成分分析用于数据归一化的方法，进行分类。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述金属离子显色剂为3， 5-Br2-PADAP ([2- (3,5)- 二溴-2-吡啶偶氮]_5_ 二乙氨基苯酚)；透明石英管内径1. 7毫米，外径2. 5毫米，长约4毫米； 金属离子显色剂浓度分别为O.1mM和O.1 μ M两种。
全文摘要
本发明涉及置换反应，是一种采用指示剂置换反应用于氯溴碘离子半定量检测的方法将指示剂与金属离子螯合后，借助于氯、溴或碘离子对金属离子的沉淀反应，将金属离子从螯合物中置换出来，从而使螯合物重新回到指示剂初始的颜色。该方法用彩色成像设备(扫描仪，数码相机等)采集指示剂颜色变化，将其颜色变化对应的红、绿、蓝(RGB)色光谱值构建对应浓度氯、溴或碘离子的“指纹图谱”。在样品测试过程中，采用聚类分析以及主成分分析等数理统计方法，将样品的图谱与“指纹图谱”库相对照，从而对未知浓度的氯、溴或碘离子进行半定量的分析。
文档编号G01N21/78GK103018233SQ20111030010
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者冯亮, 关亚风, 李慧, 沈铮 申请人:中国科学院大连化学物理研究所