专利名称：一种检测电离辐射剂量的生物学方法
一种检测电离辐射剂量的生物学方法技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种辐射剂量的生物学检测方法。
技术背景
评估电离辐射对健康的危害程度，急、慢性辐射损伤的诊断和治疗等都需要了解和确定受照剂量。机体细胞、DNA、蛋白质等在电离辐射后所发生的变化与辐射剂量之间存在着一定的剂量效应关系，通过这些可检测的生物学指标可估算辐射剂量的大小。与物理检测相比，生物剂量检测的最大优势是直接反映了机体对电离辐射的反应。
目前进行辐射剂量的生物检测的方法很多，常用的有通过检测照射所引起的染色体断片、双着丝粒、交换或易位等指标而提出的微核法和染色体核型分析法；通过照射后 DNA损伤而形成的彗星尾与未受损的细胞表现的彗星核心之间的关系来研究预测辐射剂量的单细胞凝胶电泳(彗星试验)法。随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子指标作为剂量检测的标识，比如电离辐射可以引起组蛋白Y-H2AX的快速磷酸化，与其特异性抗体反应后，可形成可见的foci，Y-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子。电离辐射诱导的造血细胞的损伤可导致细胞一些编码标志蛋白的基因位点突变从而产生异常的编码蛋白或蛋白缺失。这些异常或缺失的蛋白可作为剂量监测的标识，常见的有Hb (血红蛋白)、GPA (血型糖蛋白A)、HLA (人白细胞抗原)、TCR(T细胞抗原受体)、HPRT (次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)等。但这些方法的共同缺点是存在操作复杂、主观因素较多、检测成本较高、只能对高剂量的放射线进行检测和度量等。对低剂量放射线的生物检测和度量，目前还没有一种准确灵敏的方法。随着核能发展及辐射技术在临床诊断与治疗和工、农业生产中的应用，低剂量电离辐射与人民生活中的接触日益增多，对低剂量照射的生物学研究显得更有现实意义。因此当前迫切需要有一种使用方便、精确度高，同时能对高、低剂量的辐射进行生物检测的方法。发明内容
本发明的目的在于提供一种使用方便、精确度高，同时能对高、低剂量的辐射进行生物检测的方法。
本发明基于以下原理细胞周期是连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的这一连续过程，包含Gl期、S期、G2期、M期四个阶段。辐射可以干扰正常的细胞周期，低剂量辐射可能加快细胞周期，使整个细胞周期的时间缩短；相反， 高剂量辐射可以引起细胞周期延长，使整个细胞周期的时间延长甚至阻滞；药物松胞素B 可以阻滞细胞的整体分裂而不阻滞细胞核的分裂。这样受到不同剂量照射的细胞经松胞素 B处理后所形成双核细胞的数目就和照射剂量密切相关。
本发明提供的辐射剂量的生物学检测方法，具体步骤如下1、取辐射敏感性细胞株，分为低剂量和高剂量照射组，照射剂量小于IOcGy的为低剂量照射组，照射剂量大于40cGy为高剂量照射组；2、松胞素B处理照射后，立即向细胞培养液内加入松胞素B，终浓度为2-6yg/ml， 37 °C温箱继续培养；3、低渗处理细胞离心弃上清后，每管细胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室温低渗 10-20min ；4、固定液固定采用两步固定法，低渗后加入固定液，按质量比，固定液低渗液=1 5-8)，滴管混勻后立即离心，弃上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液为甲醇和冰醋酸混合溶液，按质量比为甲醇冰醋酸=7-9 1 ；5、双核和四核细胞的判断由于细胞受到照射后，细胞的有丝分裂会受到干扰，细胞核异型性明显，松胞素B处理以后除产生正常的双核细胞外，还会出现一大一小的两个细胞核，如果小核大小超过细胞核的1/3，那么此类细胞也记为双核细胞；对于四核细胞的判断标准，所有大于3个核的细胞均记为四核细胞。每个样品至少记数1000个细胞；6、通过统计细胞四核率，对低剂量辐射进行定量，通过统计细胞双核率，对高剂量辐射进行定量。双核率=双核细胞数/N，四核率=四核细胞数/N。N为统计细胞数。N不少于 1000。
本发明的优点本发明能解决现有辐射剂量生物检测法的多种问题。如能够提高剂量检测的精确度， 已有的单细胞凝胶电泳(彗星试验)法及染色体核型分析的操作复杂，检测时主观因素较多，对技术要求过高，检测的参数很多，很难准确定量；而本发明的照射后的细胞经松胞素 B处理后细胞核数目变化的多少就能准确并直观的进行定性和定量。其次，单细胞凝胶电泳 (彗星试验)法及染色体核型分析等对高剂量辐射进行定量敏感性还可以，但不能对低剂量辐射进行定量；而本发明中照射后的细胞用松胞素B处理后细胞的四核率变化能很好的对低剂量辐射进行定量，对于高剂量辐射细胞的双核率可以对其进行定量。因此，本发明借助四核率和双核率这两个非常直观的指标，可以分别对低、高剂量辐射进行准确定量。
本发明可用于高、低放射性剂量的生物检测，是一种辐射剂量的生物学检测的新方法。另外该技术也可用于各种药物或毒物对细胞增殖的影响，也可以用于估算药物或毒物剂量的大小，因此可以用于药物或毒物的毒理学研究。
具体实施方式
1)照射条件和实验分组取对数生长期HMy2. CIR人B淋巴母细胞(1 X IO6细胞/ 皿)接种于60mm培养皿中，培养24h,在室温下对细胞施以1.6,3.2,4.8,6.4,8cGy低剂量照射或者0. 4，1,2,4,8,12，16，20Gy高剂量照射，同时设置无照射的空白组，各组设三个重复(n=3)。
2)细胞照射后，立即将细胞孵育于含3 μ g/ml松胞素B (Sigma公司)的新鲜培养液中继续培养Mh。
3) 将细胞转移入15ml离心管内，300g离心IOmin去除培养液，每管细胞加入 7ml 0. 075M KCl 混勻，室温低渗 IOmin0
4)加入Iml固定液(按质量比计，甲醇冰醋酸9 1)预固定细胞。
5) 300g离心IOmin除去低渗液，每管加入5ml固定液固定30min。
6) 300g离心lOmin，保留约0. 5ml固定液，滴片，干燥。
7)用Giemsa染液染色30min，40倍显微镜观察。
8) 数据处理根据双核细胞数和四核细胞数分别计算细胞的双核率和四核率， 双核率=双核细胞数/1000，四核率=四核细胞数/1000。1000为统计的细胞数。
实验效果在使用的0至6. 4cGy的低剂量范围内，受照淋巴细胞的四核率与受照剂量呈线性剂量-效应关系Y4n = a+bD，相关系数为0. 957，能明显的表现出辐射兴奋性效应；在0. 4 至20Gy的剂量范围内，受照细胞的双核率与受照剂量之间呈二次指数衰减关系^ = exp (-aD-bD2)，相关系数为0. 978，能很好地反映辐射损伤效应。
该新方法操作简单、快速、经济、检测指标直观、检测结果准确。
权利要求
1. 一种检测电离辐射剂量的生物学方法，其特征在于具体步骤如下(1)、取辐射敏感性细胞株，分为低剂量和高剂量照射组，照射剂量小于IOcGy的为低剂量照射组，照射剂量大于40cGy为高剂量照射组；(2)、松胞素B处理照射后，立即向细胞培养液内加入松胞素B，终浓度为2-6yg/ml， 37 °C温箱继续培养；(3)、低渗处理细胞离心弃上清后，每管细胞加入5-10ml0. 075M KCl混勻，室温低渗 10-20min ；(4)、固定液固定采用两步固定法，低渗后加入固定液，按质量比，固定液低渗液=1 5-8，滴管混勻后立即离心，弃上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液为甲醇和冰醋酸混合溶液，按质量比为甲醇冰醋酸=7-9 1 ；(5)、双核和四核细胞的判断除产生正常的双核细胞外，对于一大一小的两个细胞核， 如果小核的大小超过细胞核的1/3，将此类细胞也记为双核细胞；对于四核细胞的判断标准为，所有大于3个核的细胞均记为四核细胞；每个样品，统计细胞数不少于1000 ；(6)、通过统计细胞四核率，对低剂量辐射进行定量，通过统计细胞双核率，对高剂量辐射进行定量；双核率=双核细胞数/N，四核率=四核细胞数/N，N为统计细胞数，N不少于 1000。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，具体为一种检测电离辐射剂量的生物学方法。根据电离辐射可以干扰细胞周期以及松胞素B可以阻滞细胞分裂而不阻滞细胞核分裂的原理，以不同剂量的r-射线对淋巴细胞照射后，加入一定量松胞素B处理，检测不同剂量照射后淋巴细胞的四核率和双核率。实验结果显示，在0—6.4cGy的低剂量范围内，受照淋巴细胞的四核率与受照剂量呈线性剂量-效应关系，相关系数为0.957，表现出辐射兴奋性效应；在0.4—20Gy的高剂量范围内，受照细胞的双核率与受照剂量之间呈指数方程剂量-效应关系，相关系数为0.978，能很好的反映辐射损伤效应。本发明方法检测指标直观、操作简单、快速、经济，检测结果准确。
文档编号G01T1/02GK102508283SQ20111033381
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者叶爽, 张江虹, 潘燕, 白杨, 袁德晓, 邵春林 申请人:复旦大学