鉴别i群禽腺病毒感染的elisa检测方法

专利名称：鉴别i群禽腺病毒感染的elisa检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域,特别涉及一种利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的动物与经免疫接种I群禽腺病毒灭活疫苗的动物的间接ELISA方法。
背景技术：
I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I,以下简称FAVI)归于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，基于hexon基因序列，分为5个不同的种(A-E)，基于中和试验结果，细分为12个血清型。FAVI在世界范围内普遍存在,宿主较多在鸡、鸭、鹅体内，可从健康和发病的家禽中分离出。该病既可经排泄物水平传播，也可经卵垂直传播,污染鸡胚。近年来，由FAVI引起的包涵体肝炎、心包积液肝炎综合征和砂囊糜烂等疾病,对肉鸡的生产及种鸡的培育带来一定的威胁，因而引起养殖业对该病的预防和控制。FAVI较多的是在体内 复制而不发病，动物感染该病毒后，呈隐性感染，与其他病原共同作用于家禽。FAVI的灭活苗免疫后,如能建立一种区分FAVI:免疫动物和感染动物的间接ELISA方法,对防控、净化和消灭该病具有至关重要的作用。目前，检测FAVI的血清学方法主要有琼脂免疫扩散、中和试验、免疫荧光、对流免疫电泳、间接血凝反应和Southern杂交等。这些方法耗时、费力，不适合大批量的检测血清样品,而且使用的抗原较多为全病毒,存在散毒的危险。100K是FAVI的非结构蛋白，是FAVI感染后期中含量最丰富的蛋白质,能与最新合成的最主要结构蛋白hexon结合,使后者发生卷曲并折叠成同源三聚体，同时能使hexon从细胞浆内质网转运到细胞核进行装配。100K还能与腺病毒晚期mRNA结合，以促进病毒蛋白的合成，同时抑制宿主蛋白的合成。本发明所述100K重组蛋白的间接ELISA鉴别诊断方法建立的基本原理是病毒非结构蛋白只在病毒复制增殖过程中表达，刺激机体产生非结构蛋白抗体。目前在疫病防制中采用的灭活疫苗，在制备过程中破坏了绝大多数非结构蛋白，因此用灭活苗免疫动物，理论上动物体内就只有结构蛋白抗体而极少有甚至用现有方法检测不到的非结构蛋白抗体。而动物感染野毒后，病毒在体内复制、增殖的过程中就有非结构蛋白的表达,因此可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分感染动物和灭活苗免疫动物。大量研究表明，利用病毒非结构蛋白建立的ELISA方法能区分感染与灭活苗免疫产生的抗体，如Raue R等利用牛病毒性腹泻NS基因建立商品化ELISA试剂盒，以区分感染和灭活苗免疫产生的抗体；我国台湾学者Shu PY等利用乙型脑炎非结构蛋白NSl建立区分感染和免疫抗体的间接ELISA方法；Bruderer U等利用重组蛋白3ABC建立区分口蹄疫自然感染和疫苗免疫的抗体的ELISA方法；Makkay AM等利用新城疫NP基因建立区分自然感染和HN基因亚单位疫苗鸡抗体的ELISA方法；LaviadaMD等构建非洲马病NS3基因重组菌,区分自然感染和灭活苗免疫的方法。但是，目前尚无利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法的研究报道。

发明内容
本发明是针对上述领域中的不足,提供了一种利用100K重组蛋白鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，该方法特异性强，操作简单,耗时短,成本低,可大批量检测样品ο本发明是通过以下技术方案实现的一种鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法,是以FAVI 100K重组蛋白为包被抗原，鸡血清为检测样品,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗来检测I群禽腺病毒感染产生的抗体。所述包被抗原是经如下步骤制备(I)FAVI 100K重组蛋白的原核表达以FAVI CELO毒株的DNA为模板，用特异性引物 PCR 扩增 100K (GenBank U46933 :23671-24732nt)目的基因，目的基因克隆于 pGEX- 4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌M5 a感受态细胞。根据氨苄青霉素抗性提取克隆,快速提取转化子的质粒DNA,双酶切鉴定,得到与目的片段分子量一致的片段,判为阳性结果,命名为IOOK-PGExo阳性质粒送大连宝生物公司测序,结果表明FAVI 100K重组蛋白目的基因序列已正确连入pGEX-4T-1，大小为1062bp,推算蛋白质分子量为38. 9ku，pGEX_4T_l载体本身表达的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的分子质量为25. 6ku,因此，FAVI 100K重组蛋白的分子量为64. 5ku, 100K基因部分序列扩增的引物如下上游引物5’ -CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3 ’，插入 EcoR I 酶切位点；下游引物5’ -ATTTGCGGCCGC CCCGAGACGCCATTTAGGTA-3 ’，插入 Not I 酶切位点；(2)对FAVI: 100K重组蛋白鉴定将目的基因的重组质粒100K-pGEX转化大肠杆菌DH5 α ,经IPTG诱导后,菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示,与空菌体相比，在约64. 5ku处有一条浓染的新增蛋白条带。经western-blot鉴定，能与FAVI阳性血清发生反应，而空菌体不反应，表明FAVI 100K重组蛋白具有较强的反应原性；(8)将鉴定后的FAVI 100K重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖树脂吸附、洗涤、洗脱的亲和层析方法,获得纯化的ΙΟΟΚ-pGEX重组蛋白，即包被抗原。所述鸡血清包括FAVI阴性血清、实验感染血清和灭活苗免疫血清。鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，包括如下步骤(I)包被用包被液将包被抗原稀释至I 20 μ g/mL,包被96孔酶标板，每孔100 μ L,于37°C温育Ih后，置于4°C 12 16h, PBST洗板3次,拍干；(2)封闭每孔加入封闭液200 μ L, 37°C孵育,封闭lh, PBST洗板3次,拍千；(3)与血清结合加入检测样品，100 μ L/孔，设阴性标准品和阳性标准品为对照，于37。。孵育Ih后，PBST洗板3次，拍干；(4)与酶标二抗结合将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG用稀释液以I 1000 I : 8000倍稀释，每孔加入100 μ L,置于37°C孵育Ih后，PBST洗板3次,拍干;(5)显色:每孔加入IOOuL底物显色液,于37°C避光作用IOrain ；(6)终止每孔加入50uL终止液,终止反应；(7)结果判定在酶标仪读取450nm波长处吸光值，即0D450值；计算FAVI阴性血清的0D450平均值X和标准差SD,根据统计学原则，FAVI阴性血清的X+3SD作为阴阳性临界值,FAVI阴性血清样品至少要30份以上才达到统计要求,若检测样品0D450值>阴阳性临界值，判为阳性；若样品0D450值<阴阳性临界值，判为阴性。其中，所述包被液为碳酸盐缓冲液=Na2CO3 I. 59g, NaIICO3 2. 93g,加蒸馏水定容至IOOOmL,调 pH 值到 9. 6 ；所述PBST为含有O. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液NaCl 8. 0g, KCl O. 2g,KH2PO4O. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g,吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至 IOOOmL,调 pH 值到 7. 4 ；所述封闭液为5%脱脂奶，即5g脱脂奶用PBST定容至IOOmL ；所述稀释液为I % BSA,即I g牛血清白蛋白BSA用PBST定容至IOOmL ；所述底物显色液为TMB缓冲液IOmL, TMB溶液O. 5mL, H2O2 32uL ；所述终止液为2M H2SO4,即21. 7mL浓硫酸缓慢加入178. 3mL蒸馏水中。 所述阴性标准品为以SPF鸡胚孵育所产2 5日龄雏鸡的血清。所述阳性标准品包括灭活苗阳性标准品和实验感染阳性标准品；灭活苗阳性标准品为经I群禽腺病毒灭活苗两次皮下免疫后的SPF鸡血清；实验感染阳性标准品为经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清。本发明的有益效果是I.本发明选取FAVI CELO株的100K基因部分序列,通过克隆表达，以原核表达的100K重组蛋白作为鉴别诊断抗原,采用间接ELISA模式,研制出FAVI非结构蛋白抗体检测试剂盒，为我国消灭FAVI提供一种有实际价值的诊断工具。该法操作简单，耗时短，成本低，可大批量检测。2.本发明选取FAVI抗原性较强的100K重组蛋白的部分序列，通过分析,选择其中的抗原表位和亲水性较好的区域,采用基因重组技术,原核表达,亲和层析后获得一种新的100K重组蛋白。经过改造过得100K重组蛋白既保留了其抗原性，又提高了 100K重组蛋白的原核表达量。该重组蛋白作为抗原不仅具有高特异性，且具有高纯度和高稳定性，在提取纯化后,包板作为检测方法中的重要组分。与全病毒抗原相比,该重组抗原可规模化、标准化生产,更安全、经济。3.本发明针对我国畜牧兽医业领域实际使用的疫苗生产工艺及动物免疫情况，确定了判定标准。FAVI经灭活苗免疫接种后，由于非结构蛋白在疫苗的生产过程中已破坏,不产生非结构蛋白的抗体,但在FAVI感染过程中,产生非结构蛋白的抗体。因此，本发明利用FAVI 100K非结构蛋白，构建100K重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法，能检测到FAVI感染产生的抗体，而不能检出灭活苗免疫的抗体，从而能够有效区分区分I群禽腺病毒感染动物与I群禽腺病毒灭活苗免疫动物。


图I : 100K重组蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白质分子标准pGEX-4T-l 空菌体；2. ΙΟΟΚ-pGEX 未诱导；3. ΙΟΟΚ-pGEX 诱
导的表达产物。图2 100K重组蛋白的western-blot分析M.蛋白质分子量标准；1.空对照；2. 100K重组蛋白。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。实施I ^一、100K基因的克隆I. I群禽腺病毒DNA的提取使用天根生化科技血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,直接从购自中国兽医药品监察所的鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)的种毒传代的尿囊液中提取DNA,操作按试剂盒说明书进行，具体步骤如下(I)取尿囊液180uL,加上20uLGA, 20uL蛋白酶K混匀，56°C 4h消化。 (2)加入200uL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟,溶液应变清亮，简短尚J\J·以去除管盖内壁的水珠。(3)加入200uL无水乙醇,充分振荡混匀15秒,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpin离心30秒，倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。(5)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD, 12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。(6)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW,12000rpm离心30秒，倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW, 12000rpm离心30秒,倒掉废液。(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50uL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管,_20°C保存或立即进行PCR扩增。2. PCR 扩增以上述步骤I中所得的DNA为模板，用上游引物5’ -CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3，和下游引物5，-ATTTGCGGCCGC CCCGAGACGCCATTTAGGTA-3 ’ 进行 PCR 扩增。反应体系lOOuL，如下:天根生化公司PCR MasterMix 50uL,上游引物(IOuM) 2uL,下游引物(I OuM) 2uL,模板DNA2uL,灭菌水44uL。瞬间离心混匀后，PCR扩增的反应程序如下94 V Smin预变性,94 V Imin,550C lmin，72°C lmin, 35 个循环，72°C 8min 延伸。PCR 产物经 1%琼脂糖电泳(100-120V),扩增产物片段与预期的目的片段大小一致，可用于下游试验。3.目的DNA片段的纯化将PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳50min后,在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶块置于I. SmL离心管中。按AXYGEN公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行试验,具体步骤如下
(I)计算凝胶重量(提前记录I. 5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如IOOmg = IOOuL 体积)(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均匀后于75V加热,间断混合(每2-3min),直至凝胶块完全熔化(约6-8min)(3)加 O. 5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B,混合均勻。(4)吸取步骤3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2mL (试剂盒内提供)离心管)中，12000Xg离心lmin。弃滤液。(5)将制备管置回2mL离心管,加500uL Buffer Wl，12000 X g离心30s,弃滤液。(6)将制备管置回2mL离心管,加700uL Buffer WZ, 12000 Xg离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700uL Buffer W2洗涤一次12000Xg离心lmin。

(7)将制备管置回2mL离心管中，12000 X g离心lmin。(8)将制备管置于洁净的I. 5mL离心管中，在制备膜中央加30uL去离心水,室温静置 lmin。12000 Xg 离心 Imin 洗脱 DNA。4.目的DNA片段与pGEX-4T_l载体连接目的DNA和pGEX-4T-1质粒均用EcoR I和Xho I双酶切,酶切体系均为20uL，分别如下目的 DNA(O. 5-IugAaU IuL, EcoR I IuL, Xho I IuL, IOXbuffer 2uL, dH20 15uL ；PGEX-4T-1 质粒(O. 5-lug/uL) IuL, EcoR I IuL, Xho I IuL, IOXbuffer 2uL, dH20 ISuL037°C消化3h。将两者的双酶切产物跑胶纯化后，用大连宝生物DNA连接试剂盒连接，将pGEX-4T-1质粒载体DNA与插入DNA片段混合制备成体积为5-IOuL的DNA溶液(TE溶液或水溶液),载体DNA和插入DNA的摩尔数比一般为(). 03pmol O. 1-0. 3pmo !。向上述DNA溶液中加入等体积(5_20uL)的Solution I,充分混勻。16°C反应30分钟。反应液可直接用于细菌转化。5.感受态细胞的制备(I)取出保存在-70 0C大肠杆菌Μ5 α菌种,接种到LB平板上,37 °C培养16h左右。(2)挑取菌落到LB培养过夜,次日，以I 100比例转接到50mL LB的培养瓶中，37。。培养2. 5-3h左右，监视菌液OD值,待0D600 = O. 35时，停止培养。(3)将菌液SOmL倒入离心管中，冰浴IOmin0(4) O0C 3000 X g 离心 Smin。(5)将培养液倒净,倒置离心管在吸水纸上lmin,使最后^-滴倒净。(6)菌液与CaCl2以5 : 3比例加入CaCl2,即加30mL CaCl2 (提前预冷)至菌体沉淀，将沉淀重悬。(7)0°C 3000Xg 离心 IOmin,沉淀菌体。(8)重复步骤(5)。(9)用2mL预冷CaCl2溶液重悬沉淀，并加入20%甘油，混勻，以每管200uL分装于I. 5mL离心管中，放置-70°C保存。6.感受态细胞的转化(I)取出-70°C保存的感受态细胞200uL,融化后加入10_20uL连接产物,轻柔混勻，冰浴30min。(2)置于42°C水浴热应激90s,取出冰浴热休克2_3min。
(3)加入800uL LB培养液,37°C摇床培养45min,使细胞复苏。(4)用移液枪把培养好的菌液缓慢地打在平板培养基表面,然后用手摇晃下平板，使菌液充分涂布平板。(5)吹干后,倒置于37°C恒温箱培养。7.挑斑在超净生物安全柜用消毒的牙签从平板上挑取单个菌落,接种于ImL LB培养基(含50ug/mL氨苄青霉素)中,37°C振荡培养16h小时左右。8.质粒的提取与酶切鉴定按照天根生化公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组载体菌的质粒，步骤如下

(I)取SmL过夜培养的菌液,加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心I分钟，尽量吸除上清。(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250uL溶液Pl,彻底悬浮细菌沉淀。(3)向离心管中加入250uL溶液P2,温和地上下翻转6_8次使菌体充分裂解。(4)向离心管中加入350uL溶液P3,立即温和地上F翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm离心IOmin,此时在离心管底部形成沉淀。(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸到沉淀。12000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。(6)向吸附柱CP3中加入600uL漂洗液PW, 12000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。(7)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpin离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的
漂洗液去除。(8)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100UL洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。用EcoRI 和 Xho I 双酶切提取的 1.00K-pGEX 质粒，20uL 体系如下EcoRI IuL, XhoI IuL, ΙΟΟΚ-pGEX质粒5uL,加灭菌水至20uL。37°C消化3h。经I %琼脂糖电泳跑酶切鉴定图。(9)重组质粒的测序鉴定将PCR扩增鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，过夜培养扩增,送上海英骏公司测序。鉴定正确的重组质粒命名为100K-pGEX。所得编码100K片段的核苷酸序列如下:TCATCGAAAATGGCAGACAAGATTACCCGAGAGGAAAAAACCATAGCGACGCTGGACCTCGTGTTACGCGTGGTCGTCGATGCTGGTAACTGGGACGTGTTCTCGAAACGTTTGGTTCGCTACACACGCGAACAGTACGGAATCGAGCTGCCCGAAGATATCGG(；GACTTACCGGACACATCTGAGGTCTCGAAAGTGCTGTTGAGTCATTTGGGGGAAGACAAGGCGGTACTGTCCGCGTACCGAATCGCGGAACTGACGCAACCTTCCGAAATGGACCGCGCTAAGGTCACAGAGGGAGGCCTGGCCGTACTTAACGCGAGTCGCGATGAAAGCGAAGCTCAGAACCCCTCGAACCCCGAACCCGAGAGCATCGAGAGCGACGCCGTAGA(；GATCTCGGCGTTGCAGCAGAGAGCGACCCTAGCGATGACGAACCCGACCCAGAACCCGAGTATGACCATCGAGAGGCGGATCATGACTCTGATGCGGATAGCGGATACTATTCGGCAGATGGGGGACGACCTGGAACACCAGTGGACGAGGAGCCCCAGGACGATTCTCCCTCTTCCGAGGAGACCGCATC
CACTGTCATCGAAGAAGCGCAGACTAGCGCTAGCAACGATTCTCATGACGACGACACTCACCGCGACGACGGCAGTGCTTCTGAAGAGGATCTCGAGCGGGACGCCCTCGTGGCCCCGGCCGATCCTTTTCCCAACTTGCGGAAGTGTTTCGAGCGCCAAGCCATGATGCTGACCGGGGCGTTAAAAGACGCCGCGGACACGGCTGATCCGCCAGAAACGCTCTCCGTCGACAGCGTGCAAAGGCAGCTCGAACGCTTCGTCTTTAACCCCGACCGCCGCGTGCCCGCCGAACACTTGGAGGTACGCTACAATTTCTACCCTCCTTTCCTCACCCCCAAGGCCATCGCGAGCTATCACATCTTTGCCGTCACCGCTTCCATCCCTCTAAGCTGCAAAGCCAACCGCAGCGGCAGCGACCTTCTAGCCAAAGCAAAAGAGAGCACTTTCTTCAAACGCTTACCTAAATCiGCG
二、重组表达质粒的诱导表达将经过序列分析正确的重组菌SOuL接种至5mL含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB培养液中，37°C振荡过夜。次日，取过夜培养物以I : 100接种至含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB培养液中，37 V振荡至0D600为O. 55-0. 65时,加入IPTG至终浓度lmmol/L, 37°C诱导表达5h，进行SDS-PAGE和western-blot分析，检测表达产物。同时设pGEX_4T_l空菌体和未诱导的菌液作为阴性对照。三、表达产物的检测按伯乐公司制备SDS-PAGE胶的说明书，制备蛋白胶。将诱导后的菌液12000rpm离心5min，用原菌液的1/10的PBS悬浮菌体沉淀，加入4X SDS上样buffer,混匀，水浴煮沸5min,在蛋白胶的样品孔上样，IOuL/孔，先用90V电压电泳25min,把电压提到120V,继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。用考马斯亮蓝染色液染色和脱色液脱色,见附图I。结果显示，经诱导的100K重组蛋白得到良好的表达,在约64. 5ku处出现特异的表达条带,而PGEX-4T-1空菌体和未诱导的100K重组蛋白无此表达条带。四、100K重组蛋白的大量制备与纯化将ΙΟΟΚ-pGEX表达产物反复冻融3次,超声波裂解，12000 Xg离心IOmin,取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定ΙΟΟΚ-pGEX重组蛋白主要表达在上清还是沉淀。利用亲和层析的方法，先用谷胱甘肽琼脂糖树脂吸附重组蛋白，再用PBS反复清洗几遍，除去DNA、RNA和杂蛋白,最后用还原型谷胱甘肽缓冲液把ΙΟΟΚ-pGEX重组蛋白洗脱。五、western-blot.分析纯化好的100K重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离后,用上海英骏公司Western-blot千转仪，将蛋白条带转到硝酸纤维素膜(NC膜)上，同时设空菌体对照。NC膜用5%脱脂奶封闭37°C Ih，用PBST洗涤3次，每次5min，加入I : 50稀释的FAVI阳性血清,37°C孵育Ih后,再用PBST洗涤3次,加入I 500稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgG，37°C孵育lh, PBST洗膜3次后,用DAB显色,观察结果。六、100K间接 ELISA 建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法，具体的步骤如下(I)包被以包被液将FAVI 100K重组蛋白稀释至工作浓度20ug/mL,加入96孔酶标板,每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于40C 16h, PBST洗板3次,拍干；(2)封闭每孔加入200uL 5%的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次，拍干；(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOiiL/孔,设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 2000倍稀释),每孔加入100 μ L,置于37。。孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(5)显色:每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长F读取光吸收值(0D450nm值)，见表I,计算阴性平均值(X)与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时,判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时,判定为阳性。表I 100K-ELISA检测FAVI阴性血清50份的0D450值

_ FAVI阴"t血清
0.278 0.233 0.169 0.154 0.257 0.108 0.241 0.266 0.239 0.1780.202 0.178 0.134 0.183 0.146 0.170 0.225 0.243 0.205 0.24100450 0.195 0.186 0.192 0.151 0.189 0.194 0.165 0.178 0.248 0.2530.241 0.149 0.144 0.205 0.218 0.275 0.189 0.297 0.228 0.2710.219 0.282 0.172 0.127 0.135 0.148 0.169 0.282 0.127 0.183七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清,包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果显示如表2、表3所示。表2 100K-ELISA检测实验感染动物血清50份的0D450值
__实验感染动物血清__参照值
1.356 0.879 0.963 0.278 1.244 1.027 1.133 1.287 1.045 0.8471.263 1.045 1.564 1.033 1.248 1.071 0.754 0.832 0.967 0.8990D450 1.251 1.164 1.234 1.058 1.377 1.421 1.045 1.074 0.953 1.047 0.3450.988 1.256 1.254 0.984 1.025 1.038 0.984 0.845 0.977 0.963_ 1.574 1.042 0.972 1.025 0.841 0.332 0.745 1.471 0.825 0.941 _表3 100K-ELISA检测灭活苗免疫血清50份的0D450值
灭活曲免疫血清参照俏
0.2780.2020.1970.1280.1750.1450.2330.2180.2460.196
0.3780.1740.1420.1890.1760.180 0.2370.2260.2760,279
0D450 0.2010.1950.1870.1940.2790.260 0.2540.2360.2070.179 0.345
0.2530.2490.2350.1890.1790.204 0.1780.1450.1890.201
0.2170.2960.1080.1230.1400.1530.1480.1900.1760.152
由表2和表3可知,96%感染动物血清为阳性,而98%灭活苗免疫动物为阴性,表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例2: 按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度Iug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 12h, PBST洗板3次，拍干；(2)封闭每孔加入200uL 5%的脱脂奶,37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍干；

(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 1000倍稀释)，每孔加入100 μ L,置于37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(5)显色:每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值⑴与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时,判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时，判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清,包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96 %感染动物血清为阳性，而98 %灭活苗免疫动物为阴性,表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例3:按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法，具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度IOug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 15h, PBST洗板3次,拍干；(2)封闭每孔加入200uL 5%的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次，拍干；(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOiiL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 8000倍稀释)，每孔加入100 μ L，置于37°C孵育lh, PBST洗板3次，拍千；(5)显色每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ；(6)终止:每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值(X)与标准差(SD)，根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时,判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时,判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清，包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96%感染动物血清为阳性,而98%灭活苗免疫动物为阴性,表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例4 按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下

(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度15ug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 14h, PBST洗板3次，拍干；(2)封闭:每孔加入200uL 5%的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍干;(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次，拍千；(4)与酶标二抗结合用1% BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 3000倍稀释),每孔加入100 μ L,置于37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(5)显色每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值⑴与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时，判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时，判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELI SA方法检测了 100份血清,包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96%感染动物血清为阳性,而98%灭活苗免疫动物为阴性,表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例5:按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度5ug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 13h, PBST洗板3次，拍干；(2)封闭每孔加入200uL 5%的脱脂奶,37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍干；(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 4000倍稀释)，每孔加入100 μ L,置于37°C孵育lh, PBST洗板3次，拍干；(5)显色:每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。
(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值(X)与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时，判定为阴性;当待检样品0D450 > O. 345时，判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物
用100K-ELISA方法检测了 100份血清，包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96 %感染动物血清为阳性,而98 %灭活苗免疫动物为阴性，表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例6 按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立

以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度16ug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 12h，PBST洗板3次，拍千；(2)封闭每孔加入200uL 5%的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍干；(8)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 5000倍稀释),每孔加入100 μ L,置于37。。孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(5)显色:每孔加入IOOuL TMB底物显色液,37°C避光作用IOmin ； (6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应,酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长F读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值⑴与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时,判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时,判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清，包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96%感染动物血清为阳性,而98%灭活苗免疫动物为阴性,表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。实施例7:按照实施例I中的步骤一至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度18ug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 16h, PBST洗板3次，拍干；(2)封闭:每孔加入200uL 5%的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍干;(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板3次，拍千；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I : 6000倍稀释),每孔加入100 μ L,置于37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干；(5)显色每孔加入IOOuL TMB底物显色液，37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M II2SO4终止反应，酶标仪测定0D450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI:的阴性血清，用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值⑴与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为:当待检样品0D450 < O. 345时，判定为阴性；当待检样品0D450 > O. 345时，判定为阳性。七、100K间接EL.I.SA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清,包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96 %感染动物血清为阳性，而98 %灭活苗免疫动物为阴性，表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。
实施例8 按照实施例I中的步骤^-至五制备100K重组蛋白六、100K间接ELISA检测方法的建立以纯化后的100K重组蛋白作为抗原建立间接ELISA方法,具体的步骤如下(I)包被以包被液将由原核表达的I:群禽腺病毒100K蛋白稀释至工作浓度9ug/mL,加入96孔酶标板，每孔IOOuL, 37°C温育Ih,置于4°C 13h, PBST洗板3次,拍干；(2)封闭每孔加入200uL 5 %的脱脂奶，37°C封闭lh, PBST洗板3次,拍千；(3)与血清结合加入待检血清样品，IOOuL/孔，设阳性和阴性标准品为对照，37°C孵育lh, PBST洗板8次，拍干；(4)与酶标二抗结合用I % BSA稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG至工作浓度(I 7000倍稀释),每孔加入100 μ L,置于37°C孵育lh, PBST洗板3次,拍干·；(5)显色每孔加入IOOuL TMB底物显色液，37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应，酶标仪测定01)450值。(7)用建立的ELISA方法检测50份FAVI的阴性血清,用酶标仪在0D450nm波长下读取光吸收值(0D450nm值)，计算阴性平均值(X)与标准差(SD),根据统计学原则，X+3SD为该检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义样品检测的判定标准为当待检样品0D450 < O. 345时，判定为阴性;当待检样品0D450 > O. 345时，判定为阳性。七、100K间接ELISA方法区分I群禽腺病毒感染的动物与灭活疫苗接种的动物用100K-ELISA方法检测了 100份血清，包括实验感染动物血清50份和灭活苗免疫血清50份。结果96 %感染动物血清为阳性,而98 %灭活苗免疫动物为阴性，表明本发明可区分FAVI感染的动物与灭活疫苗接种的动物。核苷酸序列表<110>广西壮族自治区兽医研究所<120>利用100K蛋白鉴别诊断I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法〈210> I<211>23<212>DNA〈213〉人工序列(上游引物)
〈400〉tcatcgaaaa tggcagacaa gat23<210>2<211>20<212>DNA〈213〉人工序列(F游引物)〈400〉cccgagacgccatttaggta20
<210>3<211)1062<212>DNA<213>I 群禽腺病毒 IOOK〈400〉tcatcgaaaa tggcagacaa gattacccga gaggaaaaaa ccatagcgac gctggacctc 60gtgttacgcg tggtcgtcga tgctggtaac tgggacgtgt tctcgaaacg tttggttcgc 120tacacacgcg aacagtacgg aatcgagctg cccgaagata tcggggactt accggacaca 180tctgaggtctcgaaagtgct gttgagtcat ttgggggaag acaaggcggt actgtccgcg 240taccgaatcg cggaactgac gcaaccttcc gaaatggacc gcgctaaggt cacagaggga 300ggcctggccg tacttaacgc gagtcgcgat gaaagcgaag ctcagaaccc ctcgaacccc 360gaacccgaga gcatcgagag cgacgccgta gaggatctcg gcgttgcagc agagagcgac 420cctagcgatg acgaacccga cccagaaccc gagtatgacc atcgagaggc ggatcatgac 480tctgatgcgg atagcggata ctattcggca gatgggggac gacctggaac accagtggac 540gaggagccccaggacgattc tccctcttcc gaggagaccg catccactgt catcgaagaa 600gcgcagacta gcgctagcaa cgattctcat gacgacgaca ctcaccgcga cgacggcagt 660gcttctgaagaggatctcga gcgggacgcc ctcgtggccc cggccgatcc ttttcccaac 720ttgcggaagtgtttcgagcg ccaagccatg atgctgaccg gggcgttaaa agacgccgcg 780gacacggctgatccgccaga aacgctctcc gtcgacagcg tgcaaaggca gctcgaacgc 840ttcgtctttaaccccgaccg ccgcgtgccc gccgaacact tggaggtacg ctacaatttc 900taccctcctttcctcacccc caaggccatc gcgagctatc acatctttgc cgtcaccgct 960tccatccctctaagctgcaa agccaaccgc agcggcagcg accttctagc caaagcaaaa 1020gagagcactttcttcaaacg cttacctaaa tggcgtctcg gg106权利要求
1.一种鉴别I:群禽腺病毒感染的ELISA检测方法,其特征在于以FAVI IOOK重组蛋白为包被抗原,鸡血清为检测样品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗来检测I群禽腺病毒感染产生的抗体。
2.根据权利要求I所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于所述包被抗原是经如下步骤制备 (1)FAVI 100K重组蛋白的原核表达以FAVI CELO毒株的DNA为模板,扩增100K基因前段核苷酸序列GenBank:U46933:23671-24732nt，克隆至pGEX_4T_l原核表达载体中，在大肠杆囷DH5a中表达，100K基因部分序列$增的引物如下 上游引物5’ -CCGGAATTCTCATCGAAAATGGCAGACAAGAT-3’，插入 EcoR I 酶切位点； 下游引物5’ -ATTTGCGGCCGC CCCGAGACGCCATTTAGGTA-3’，插入 Not. I 酶切位点； (2)对FAVI100K重组蛋白反应原性的鉴定； (3)将鉴定后的FAVI100K重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖树脂吸附、洗涤、洗脱的亲和层析方法,获得纯化的lOOK-pGEX重组蛋白，即包被抗原。
3.根据权利要求I所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法,其特征在于所述鸡血清包括FAVI阴性血清、实验感染血清和灭活苗免疫血清。
4.根据权利要求I或2或3所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)包被用包被液将包被抗原稀释至1^20u g/mL,包被96孔酶标板,每孔100 u L,于37°C温育Ih后，置于40C 12 16h, PBST洗板3次,拍干.； (2)封闭每孔加入封闭液200u L，37°C孵育,封闭lh，PBST洗板3次，拍干； (3)与血清结合加入检测样品，100u L/孔,设阴性标准品和阳性标准品为对照，于37°C孵育Ih后，PBST洗板3次,拍干； (4)与酶标二抗结合将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG用稀释液以l:100(Tl:8000倍稀释，每孔加入100 u L,置于37°C鮮育Ih后，PBST洗板3次,拍干； (5)显色:每孔加入IOOuL底物显色液,于37°C避光作用IOrain; (6)终止每孔加入50uL终止液,终止反应； (7)结果判定在酶标仪读取450nm波长处吸光值，即0D450值； 计算FAVI阴性血清的0D450平均值X和标准差SD, FAVI阴性血清的X+3SD作为阴阳性临界值，若检测样品0D450值 > 阴阳性临界值，判为阳性；若样品01)450值〈阴阳性临界值,判为阴性。
5.根据权利要求4所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于 (I)所述包被液为碳酸盐缓冲液:Na2C03 I. 59g, NaIICO3 2. 93g，加蒸馏水定容至IOOOmL,调 pH 值到 9. 6 ； (2 )所述PBST为含有0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, KH2PO40. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g,吐温-20 500uL,加蒸馏水定容至 1000mL，调 pH 值到 7. 4 ； (3)所述封闭液为5%脱脂奶，即5g脱脂奶用PBST定容至IOOmL； (4)所述稀释液为1%BSA,即Ig牛血清白蛋白BSA用PBST定容至IOOmL; (5)所述底物显色液为=TMB缓冲液IOmL,TMB溶液0. 5 mL, H2O2 32uL ； (6)所述终止液为2MH2SO4,即21. 7mL浓硫酸缓慢加入178. 3mL蒸馏水中。
6.根据权利要求4所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法,其特征在于所述阴性标准品为以SPF鸡胚孵育所产2 5日龄雏鸡的血清。
7.根据权利要求4所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，其特征在于所述阳性标准品包括灭活苗阳性标准品和实验感染阳性标准品。
8.根据权利要求7所述的鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法,其特征在于 所述灭活苗阳性标准品为经I群禽腺病毒灭活苗两次皮下免疫后的SPF鸡血清； 所述实验感染阳性标准品为经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别I群禽腺病毒感染的ELISA检测方法，是以FAVI100K重组蛋白为包被抗原，鸡血清为检测样品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗来检测I群禽腺病毒感染产生的抗体。本发明特异性强，操作简单，耗时短，成本低，可大批量检测，能有效的排除I群禽腺病毒灭活疫苗免疫的干扰，特异性的检测I群禽腺病毒感染，从而能区分FAVI感染动物与接种FAVI灭活疫苗动物，为我国消灭FAVI提供一种有实际价值的诊断工具。
文档编号G01N33/543GK102680699SQ201110347288
公开日2012年9月19日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者刘加波, 庞耀珊, 彭宜, 罗思思, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所