专利名称：一种用于dna分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置的制作方法
技术领域：
本发明属于红外光谱技术领域，具体为一种用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置。
背景技术：
表面增强红外吸收光谱(Surface-Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy, SEIRAS)是一种研究界面分子结构信息的重要分析工具。配以衰减全反射(Attenuated Total Reflection, ATR)模式的表面增强红外吸收光谱(ATR-SEIRAS)， 具有表面信号强，传质不受阻和本体溶液干扰小等优点，结合表面选律便于开展DNA分子识别与杂交动力学过程研究。同时避免了传统外反射红外吸收光谱(IR Absorption Spectroscopy, IRAS)面临的问题，如表面信号不够强、传质补充滞后、溶液背景的干扰等。 采用内反射表面增强红外吸收光谱技术作为普通红外光谱的扩展，显著提高了红外光谱检测的精度，极大地扩展了红外光谱的研究范围，如界面小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖、类脂、噬菌体、病毒和细胞等生物分子及生物组织体的动态行为。用于构建内反射表面增强红外吸收光谱池的棱镜装置有Otto型和Kretschmarm 型两种。棱镜形状有多种可供选择，其中多以Kretschmarm半球型棱镜用于研究。半球形棱镜可保证任何角度入射光均与界面垂直，反射光损失小，而且进入棱镜后的角度不变。国际上以Osawa.和Ataka设计的液体流动光谱电化学池为应用主流。其他小组的光谱池装置均是在此基础上进行改装而成。Adzic小组提出了组合硒化锌柱体和硅片红外窗口的概念。Sudo等发展的微型衰减全反射表面增强红外光谱实验技术可以对物质表面亚毫米大小或纳米层厚度的细小物质进行分析。复旦大学蔡文斌研究小组根据“平面波的棱柱-膜耦合原理”(“the theory of prism-film coupler for plane wave”)，研制出一种简单易行的用于电化学内反射SEIRAS的辅助装置，此红外光谱辅助装置在2008年申请专利。长春应化所的姜秀娥教授结合定向组装和膜重组的方法创新性地构建了可用于模拟膜蛋白生理存在状态的平台，通过表面增强红外光谱原位监测膜蛋白在纳米界面的定向组装和膜重组过程，拓展了衰减全反射红外光谱在界面蛋白结构和功能方面的研究。以上均侧重于电极体系的拓展，制膜方法的改进，将表面增强红外光谱技术作为现场电化学的强有力辅助工具而不断得以完善。近几年来，脱氧核糖核酸(DNA)是解释多种生命现象的关键，已成为生命科学最重要的研究领域之一。基于DNA的生物传感器因其简便、快捷、灵敏、价低等特点， 在基因工程、医疗诊断、新药筛选、药物作用机理、环境监测、法医鉴定等领域得到广泛研究和应用。DNA传感技术将杂交的过程和结果以光、电等易于测量的物理信号表达出来，从而获取目标DNA分子的浓度、序列等信息，是当前DNA研究的重要手段。然而，国内外几乎无人关注于研制出简单易用的用于内反射表面增强红外吸收光谱的微量DNA分析检测装置。 另外，红外光谱能给出化合物的“指纹”特征，是分析DNA分子结构和空间取向的重要工具。 因此，开发出一套能够实现高灵敏度、高分辨率、器件微型化和低成本，并适于DNA分析检测的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助装置至关重要。
发明内容
本装置的发明目的是为了解决目前红外装置不适用于DNA杂交在线分析、制作难度大、检测灵敏度低、所需样品量大等问题而研制的一种制作简易，能够实现高灵敏度红外检测的表面增强红外光谱仪辅助光学装置。具有表面红外增强作用的岛状纳米贵金属膜为表面修饰、构建DNA传感器提供平台，能够避免背景水的干扰，对水溶液样品进行直接分析检测；可以原位研究功能表面的构造和性质，实时监测界面发生分子识别反应；能够保持待测分子的活性，实现分子反应动力学的研究。将红外光谱技术扩展到研究DNA杂交过程的应用中，实现实时、原位、在线地跟踪DNA识别和杂交过程。为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案—种用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，如图1所示，其特征在于所述的装置包括一个硅半球1，硅半球1平面的表面镀有红外增强效应的岛状纳米金膜2构成红外光窗，红外光窗硅半球平面表面上的岛状纳米金膜上密封固定有红外光谱池3，红外光谱池为一圆柱体，开有四个轴向的通透的孔，其中大孔为参比电极插口，内径 Φ4-5πιπι;三个小孔分别为样品进口、样品出口和对电极插口 ；内径均为Φ2-3πιπι，底部为微型柱状储液池，以金膜为工作电极，可应用于红外光谱电化学研究。上述用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，所述的红外光窗上密封固定红外光谱池，可以通过配件硅半球两侧的立柱4和硅半球底的光窗底托5、 固定环6、密封圈8和固定压管7将红外光窗、密封圈8、固定环6和固定压管7连结在一起， 红外光谱池用于固定可以是一带肩的圆柱体，所述的的立柱4有两根，立柱4是两端有螺孔的圆柱，所述的光窗底托5是一条状片，如图2所示，其中心有一带孔的圆盘，可以托住硅半球，两端有孔，与立柱4下端的螺孔相匹配，可以用螺钉固定在立柱下端，所述的固定环6为一圆环，内壁有螺纹，固定环6上有对称的两个螺钉孔，与立柱4上端的螺孔相匹配，可以固定在立柱上端，另有一固定压管7，它的内径与红外光谱池的柱体直径相匹配，固定压管7 的外壁有螺纹，与固定环6内壁的螺纹相匹配，如此，红外光窗与红外光谱池之间垫上密封圈8，将固定压管7旋入固定环6压紧，即构成用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置。上述用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，所述的岛状金膜的制备方法，是采用化学置换反应((Galvanic reaction)在硅半球平面表面制备均勻且具高增强效果的红外增强表面，它的具体操作方法参见Hiroto Miyake, Shen Ye, Masatoshi Osawa, Electroless deposition of gold thin films on silicon for surface-enhanced infrared spectroelectrochemistry, Electrochemistry Communications 4(2002)973-977.上述用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，所述的红外光谱池的材质为玻璃或聚四氟乙烯。上述用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，所述的密封圈8为聚二甲基硅氧烷(PDMS)环。
上述用于DNA分析的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，应用于DNA 分析与检测，是在金膜表面固定捕获DNA，当被测样品中存在目标DNA时，目标DNA的一端与捕获DNA杂交，另一端与信号DNA杂交，继而将同时负载信号DNA与红外探针对巯基苯甲酸的纳米金颗粒带到金膜表面，通过观察红外探针对巯基苯甲酸的红外信号，进而实现直观在线跟踪DNA的杂交过程。本发明的有益效果在于利用制备纳米岛状金薄膜的生物相容性，研究处于液态环境下原始状态的DNA生化性质，检测DNA分子在某特定界面上的空间取向及立体构象变化，获得表面信息与其反应活性之间的关联性，研究非生命固体表面与生命基本单元DNA的相互作用，获得生物分子DNA与固体表面作用的模型；利用加工的表面增红外光谱仪辅助光学装置研究DNA杂交过程。实时、直观地显示高可信度的检测结果，获得实时、在线的分析结果，结合观察、实验和科学假设，动态跟踪、等效或近似的人工模型模拟生命过程。本发明的用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，除红外光窗外，不需要其它任何专用设备，所有的其他零件均可自行加工，加工装置所需原料简单， 构造合理，安装简便易行，DNA分析过程所需样品量小，易于实时监控、成本低、其制作安装技术极易推广使用。
图1为用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置示意图。图2为图1红外光谱仪辅助光学装置各部件的示意图。图3为用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置光窗底托的结构剖析图。图4为用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置的固定环的结构剖析图。图5为用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置光谱液池的结构剖析图。图6为用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置红外窗上岛状纳米金膜扫描电镜图。图7衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置应用于三明治结构的DNA杂交实时检测实验机理图。图8为表面增强衰减全反射表面增强红外(SEIRA-ATR)光路系统示意图。图为9对照实验的表面增强红外光谱图无目标DNA，仅存在对巯基苯甲酸-金胶-信号DNA (a)；金胶-信号DNA，目标DNA同时存在(b)；金膜上自组装对巯基苯甲酸(c)； 目标DNA，对巯基苯甲酸-金胶-信号DNA同时存在形成三明治结构(d)。图10为不同杂交时间的衰减全反射表面增强红外光谱图。图11为1587CHT1，1666cm"1处吸收峰积分面积对杂交时间曲线。图12为基于衰减全反射表面增强红外光谱识别DNA杂交过程的重现性。图13为选择性实验的DNA杂交动力学曲线100nM目标DNA(a) ；IOOnM单碱基错配DNA(b)；空白缓冲溶液(c) ；IOOnM完全不匹配DNA⑷。
具体实施例方式实施例1红外光窗的制备取直径35mm的硅半球1，在硅半球平面上，镀上岛状纳米金薄膜2，岛状纳米金薄膜制备方法具体参见1. Hiroto Miyake, Shen Ye, Masatoshi Osawa, Electroless deposition of gold thin films on silicon for surface-enhanced infrared spectroe1ectrochemistry, Electrochemistry Communications 4(2002)973-977.实施例2通过配件硅半球两侧的立柱4和硅半球底的光窗底托5及固定环6、密封圈8和固定压管7将红外光窗、密封圈8、固定环6、红外光谱池3和固定压管7连结在一起，红外光谱池3是一带肩的圆柱体，材质为聚四氟乙烯，圆柱体直径为Φ^. 7mm，肩的直径为 Φ 37mm,肩厚4. 5mm,光谱池上有四个插口，其中参比电极插口内径Φ 4mm,对电极插口内径 Φ 2mm，以金膜为工作电极，可应用于红外光谱电化学研究；另外两个为液体样品进出口，内径为Φ 2mm,底部为微型柱状储液池，所述的立柱有两根，立柱是两端有螺孔的圆柱，直径 Φ 10mm，高21mm，所述的光窗底托5是一条状片，如图2所示，其中心有一带孔的圆盘，可以托住硅半球，两端有孔，中心孔距为50mm，与立柱4下端的螺孔相匹配，可以用螺钉固定在立柱下端，所述的固定环6为一圆环，内壁有螺纹，固定环6上有对称的两个螺钉孔，与立柱 4上端的螺孔相匹配，可以固定在立柱上上端，另有一固定压管7，它的内径与红外光谱池的柱体直径相匹配，内径cj^9mm，外径Φ 39mm，固定压管7的外壁有螺纹，与固定环内壁的螺纹相匹配，螺矩为3um，如此，红外光窗与红外光谱池之间垫上密封圈8，密封圈8内径为 Φ 10mm,外径Φ 35mm,厚2mm ；将固定压管7旋入固定环6压紧，即构成用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置。实施例3用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置按照衰减全反射表面增强红外光谱仪(ATR-SEIRA)光路系统示意图装配在ATR附件内。旋动固定环6可以调节光窗在ATR附件内的位置，同时，通过调节ATR附件内的两个反光镜的角度，改变红外光束的入射角度，使红外光束入射角大于临界角，此时红外光束在光窗内表面发生全反射现象。本实验中采用入射角大于70°C。ATR-SEIRAS实验中，ρ-偏振的红外光以大于70°C 的入射角进入光窗在光窗内表面发生全反射。傅里叶变换红外光谱仪Tensor 27(Bruke, Germany)用于红外光谱的采集，配备液氮冷却的碲化汞镉(MCT)检测器和KBr分束器。实施例4用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，应用于DNA检测，其步骤是在金膜表面固定捕获DNA，当被测样品中存在目标DNA时，目标DNA的一端与捕获 DNA杂交，另一端与信号DNA杂交，继而将同时负载信号DNA与红外探针对巯基苯甲酸的纳米金颗粒带到金膜表面，通过观察红外探针对巯基苯甲酸的红外信号，进而实现直观的在线的跟踪DNA杂交过程。其机理见图7.(1)实验使用的人工合成寡聚核苷酸(上海生工生物工程技术服务有限公司)的碱基序列如下所示
捕获DNA :5，-SH-(CH2) 6-TCG TAC GAT CGA TCC-3，信号DNA :5，-TAT CGT GTG AGC GGC TTT TTT TT-(CH2)6-SH_3，目标 DNA :5’ -GCC GCT CAC ACG ATA TTT TTT TTG GAT CGA TCG TAC GA-3’单碱基错配DNA5'-GCC GCT CAC ACG ATA TTT TTT TTG GAT CGA TGG TAC GA-3，完全不匹配DNA5'-ACA TGC TTG GAC TGC TTT TTT TTC AGG CTC ATC GTA CG-3，实验中使用溶液配方如下实验所用的寡聚核苷酸先溶于TE缓冲液中配制成IOOuM的储备液，分装成所需体积后，储存于_20°C的冰箱中备用。TE缓冲液10mM Tris-HCl，1. OmM EDTA(pH 8.0)；杂交缓冲液柠檬酸钠缓冲溶液 150mM, NaCl 溶液 750mM(pH 7. 0) ；DNA 固定缓冲液:50mM PBS (pH7. 0,0. 3M NaCl)。PBS 溶液由NaH2PO4和Na2HPO4配制。6-巯基己醇(Sigma)、对巯基苯甲酸(Sigma)、及其他试剂均为分析纯。实验所用水为超纯水(Milli-Q Millipore, USA) (2) Au胶纳米粒子的制备及单分子层生物条形码的修饰1)制备金纳米粒子方法参照文献2. Katherine C. Grabar，GrGrWith Freeman, Michael B. Hommer,Michael J. Natan,Preparation and Characterization of Au colloid Monolayers, Analytical Chemistry 67 (4) (1995),735 743.2)将20uL 1.0X KT4M的对巯基苯甲酸和5uL 1.0X KT4M的信号DNA加入到2mL 金胶溶液中，缓慢电磁搅拌16小时，并在4°C放置48小时。然后用50mM，的PBS (pH 7. 0， 0. 3MNaCl)离心洗涤三次，以除去未与金胶键合的物质，最后将修饰好单分子层生物条码的金胶分散在ImL的PBS (ρΗ7· 0,0. 3Μ NaCl)中，储存于4°C。(3)三明治结构DNA传感器的构建将沉积于Si光窗表面的岛状纳米金膜电极浸泡在1. OX 10、巯基修饰的捕获DNA 溶液(PBS，pH7.0，0. 3M NaCl)中组装M小时，组装完成后移去捕获DNA溶液并用大量超纯水冲洗。随后将电极浸入ImM的巯基己醇溶液(PBS，pH7.0，0. 3M NaCl)中反应30分钟，并用大量超纯水冲洗。固定了捕获DNA的岛状纳米金膜电极记作ssDNA/AuNps。第一次杂交过程将ssDNA/AuNps电极浸入含有1 X IO^7M目标DNA的杂交缓冲溶液中，杂交3小时，用大量杂交缓冲液冲洗三次，最后用PBS (pH7.0，0. 3M NaCl)缓冲溶液冲洗。第一次杂交后的岛状纳米金膜电极记作dsDNA/AuNps。随后将dsDNA/AuNps浸入带有生物条码的金胶溶液，而目标DNA的另一端多出来的碱基则与修饰在金胶纳米粒子表面的信号DNA杂交，即进行第二次杂交。第二次杂交过程采用ATR-SEIRA光谱进行实时监测。(4) ATR-SEIRA 光谱表征ATR-SEIRA光路的设置如图8，在dsDNA/AuNps电极表面加入PBS(pH7. 0，0. 3M NaCl)作为背景光谱。将带有生物条码的金胶溶液加入到光谱池中，并开始记录衰减全反射红外吸收光谱。光谱分辨率4CHT1，结果为扫描1 次的平均值。谱图采集过程中，仪器样品腔内通入除去(X)2的干燥压缩空气，以避免环境中水气与(X)2对背景信号的影响。所有实验均在室温下进行。(5) SEIRA-ATR 检测 DNA 杂交采用ATR-SEIRA技术监测目标DNA与金纳米粒子表面的信号DNA的杂交。以dsDNA/AuNps电极和PBS (pH7. 0,0. 3M NaCl)为背景，以生物条形码修饰的金纳米粒子的加入为起点采集金纳米粒子上固定的探针分子对巯基苯甲酸的红外信号。利用衰减全反射表面增强红外光谱技术使红外信号得到了几十倍的增强，基于DNA-生物条形码技术构建的 DNA传感器，对检测信号进行了二次放大，获得了较好的红外光谱信号。不同条件下的对照实验衰减全反射表面增强红外光谱结果(见图9)注入生物条形码修饰的金纳米粒子溶液而无目标DNA存在时，几乎观察不到对巯基苯甲酸的红外吸收峰(曲线a)；直接将对巯基苯甲酸组装在岛状纳米金膜表面(曲线c)产生了明显的归属于对巯基苯甲酸各种振动模式的表面增强红外吸收峰；比较a和c曲线可以看出岛状纳米金膜可以直接增强固定在金膜表面的对巯基苯甲酸分子的红外吸收而对水溶液中的对巯基苯甲酸没有响应。当目标DNA和生物条形码修饰的金纳米粒子共存时能够形成三明治结构，这种结构将生物条形码修饰的金纳米粒子带到金膜表面进而产生对巯基苯甲酸重要的表面增强红外吸收峰(曲线d).曲线d与曲线c的红外特征吸收峰位置相同。表明对巯基苯甲酸，信号DNA成功标记到金纳米颗粒上。当仅标记信号DNA的金纳米颗粒和目标DNA 共存时只表现出较弱的信号DNA表面增强红外吸收峰(曲线b)。不同杂交时间的衰减全反射表面增强红外吸收谱见图10。在1750CHT1 1250CHT1 波长范围内出现了多个红外吸收峰。随着杂交时间的增加，图中的红外吸收峰不断增强，直至达到平衡。图10中各吸收峰的归属列于表1。对1587CHT1，1666cm-1处的吸收峰进行积分，积分值能够用来表示固定在表面的对巯基苯甲酸的量进而间接反映DNA杂交的量。以积分值对时间作图得到图11。从图11可以看出，随着杂交时间的增加，表面上对巯基苯甲酸的量增加，说明固定在界面的金纳米粒子数量的增加。由于金纳米粒子的固定依靠的是目标DNA与信号DNA的杂交，对巯基苯甲酸量的增加反映杂交反应的进行，当对巯基苯甲酸不再变化时，说明杂交已经完成。图12为基于衰减全反射表面增强红外光谱识别DNA杂交过程的重现性。表1.表面增强红外光谱峰归属
峰位置归属1666 cm1C=O伸缩振动1636 cm"1COO不对称伸缩振动1587,1525,1484 cm"1C=C芳环伸缩振动1542 cm1COO-不对称伸缩振动1439 cm"1C-H弯曲振动1386 cm"1COO-对称伸缩振动1286 cm1C-O伸缩振动1311 cm1C-OH伸缩振动/C-O-H弯曲振动 基于衰减全反射表面增强红外光谱的DNA传感器在识别目标DNA方面能够表现出了良好的选择性和优良的检测能力，能够灵敏的识别DNA单碱基错配，并实现了实时对短链寡聚核苷酸DNA杂交过程的在线跟踪(见图13)。 本发明用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，不局限于上述实施例，依据不同DNA分析需求制备不同规格尺寸的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助装置；而对根据本发明所述方法构建的用于DNA分析的表面增强红外光谱仪辅助装置所有部件见附图1 6所示；应用于三明治结构的DNA杂交实时检测实验机理图见附图7所示。
权利要求
1.一种用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，其特征是它包括一个硅半球(1)，硅半球(1)平面的表面镀有红外增强效应的岛状纳米金膜(2)构成红外光窗，硅半球平面表面上的岛状纳米金膜红外光窗上密封固定有红外光谱池(3)，该红外光谱池为一圆柱体，开有四个轴向的通透的孔，一大三小，其中大孔为参比电极插口，内径 Φ4-5πιπι;三个小孔分别为样品进口、样品出口和对电极插口 ；内径均为Φ2-3πιπι，底部为微型柱状储液池，以金膜为工作电极，可应用于红外光谱电化学研究。
2.根据权利要求1所述的衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，其特征是 所述的红外光窗上密封固定红外光谱池，是通过配件硅半球两侧的立柱(4)和硅半球底的光窗底托(5)、固定环(6)、密封圈(8)和固定压管(7)将红外光窗、密封圈(8)、固定环(6) 和固定压管(7)连结在一起，红外光谱池是一带肩的圆柱体，所述的的立柱(4)有两根，立柱(4)是两端有螺孔的圆柱，所述的光窗底托(5)是一条状片，其中心有一带孔的圆盘，托住硅半球，两端有孔，与立柱(4)下端的螺孔相匹配，用螺钉固定在立柱下端，所述的固定环 (6)为一圆环，内壁有螺纹，固定环(6)上有对称的两个螺钉孔，与立柱(4)上端的螺孔相匹配，固定在立柱上端，另有一固定压管(7)，它的内径与红外光谱池的柱体直径相匹配，固定压管(7)的外壁有螺纹，与固定环(6)内壁的螺纹相匹配，如此，红外光窗与红外光谱池之间垫上密封圈(8)，将固定压管(7)旋入固定环(6)压紧，即构成用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置。
3.根据权利要求1或2所述的用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，其特征是所述的红外光谱池的材质为玻璃或聚四氟乙烯。
4.根据权利要求2所述的用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置，其特征是所述的密封圈(8)为聚二甲基硅氧烷环。
5.根据权利要求1所述的用于DNA分析衰减全反射表面增强红外光谱仪辅助光学装置在DNA分析与检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于DNA识别与杂交动力学分析的衰减全反射表面增强红外光学装置。该装置由硅半球表面镀有岛状纳米金膜的衰减全反射表面增强红外光学窗，光学台底座，固定支架区，红外光谱池，PDMS密封圈等单元构成。镀有金岛状薄膜的硅半球置于光学台底座上，光学窗的金膜面朝向红外光谱池，中间以PDMS密封圈密封；通过固定支架的外螺纹与光学台底座的上支架的内螺纹将光谱池、PDMS密封圈和硅半球光学窗旋进固定，构成用于DNA分析的表面增强红外光谱装置。该装置结构简单，操作方便，所需样品量小，可以较长时间稳定使用，能方便地进行实时在线检测1100cm-1-4000cm-1波段的红外光谱信号，可高灵敏分析DNA分子，实现DNA识别及杂交机理与动力学研究。
文档编号G01N21/01GK102507444SQ201110384109
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者包文晶, 夏兴华, 徐建云, 杨晨, 王康, 金波 申请人:南京大学