专利名称：一种准三维生物芯片的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种准三维生物芯片的制备方法，尤其是在生物芯片基底通过生长一维的杆状、纤维状或者管状材料的基础上再通过在片合成或者点样法固定传感敏感材料而制备准三维生物芯片。由于一维材料传感性能优良且生长易于控制，因此该方法具有操作简单，成本低廉及能够批量制备的特点，因此有助于平面微阵列生物芯片的进一步发展。
背景技术：
随着人类文明的进步，医疗卫生、生物工程、环保及食品安全等众多领域对高通量、低成本、方便可靠的多功能生物传感器件的需求越来越多、越来越迫切。为此，在上个世纪九十年代，人们开发了生物芯片。生物芯片技术的最初构想来源于美国Affymetrix公司的前身Affymax公司里的一次即兴的建议，Fodor组织半导体专家和分子生物学专家借助于Ed Southern提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交，于1993 1994年首先设计出了寡核苷酸生物芯片。生物芯片通过缩微技术， 根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅、玻璃或者高分子材料表面的微型生物化学分析系统中，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测，其检测效率是传统检测技术手段的成百上千倍。伴随着人类基因组计划(HGP)的发展，借助于电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学的融合，近十多年来生物芯片技术获得了长足的进展，并以其无可比拟的高信息量、高通量、微型化和自动化等优点应用在包括疾病诊断和治疗、药物筛选、食品卫生监督、环境检测、国防等领域，显示出了巨大的应用价值，因此受到世界各国学术界和工业界的瞩目，被公认将会给21世纪的生命与医学科学研究带来一场革命。
目前的生物芯片主要包括平面微阵列芯片及悬浮阵列芯片。其中平面微阵列芯片具有位置编码、能与微电子工艺相兼容且制备工艺成熟，因此是目前商业化应用程度较高的生物芯片。然而在应用过程中，含量较低物质检测对生物芯片灵敏度及检测精度的挑战却仍然有待人们进一步的探索与发展。为此人们开发了三维凝胶DNA芯片。人们的研究表明三维凝胶DNA芯片由于三维结构所具有的较高的固定容量而使得其检测灵敏度明显提高。而另一方面人们的研究还表明氧化锌纳米杆微阵列制备成传感器件同样具有较高的检测灵敏度。这些均表明具有三维或者准三维特性的材料在传感器件中具有一定的应用前景。然而目前的生物芯片除了三维凝胶DNA芯片外尚无其它类似的三维或者准三维生物芯片，为此本申请在国际上首次提出首先在基底上生长一维的杆状、纤维状或者管状材料阵列然后结合生物芯片的点样或者原位合成技术固定传感敏感材料以形成具有准三维特性的生物芯片。该技术具有操作简单，成本低廉及能够与现有平面微阵列生物芯片技术兼容的特点。发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种准三维生物芯片的制备方法，即在基底上首先生长一维的管状或者杆状微阵列，然后通过点样法或者在片合成法固定传感敏感材料以获取具有准三维特性的生物芯片。
技术方案为解决上述技术问题，本发明提供一种准三维生物芯片的制备方法， 该方法包括如下步骤a、在基底上生长一维材料的阵列以获得含有一维材料阵列的平面材料；b、在平面材料的一维材料阵列上不同区域分别固定不同传感敏感材料以获得准三维生物芯片。
优选的，所述一维材料为长度与直径之比大于2的材料。
优选的，固定所述传感敏感材料是指在一维材料阵列表面先固定连接材料再通过连接材料连接传感敏感材料。
优选的，所述的在一维材料的不同区域分别固定不同传感敏感材料的方法包括点样法及在片合成法。
优选的，所述的在基底上生长一维材料是指采用在基底面内均勻生长或者在基底上预先构建的点阵列上生长。
优选的，该方法包括对生长了一维材料阵列的平面材料进行切割、组装以构建准三维生物芯片。
所述准三维生物芯片通过与待检样品作用而用于检测。
有益效果本发明首次将检测基底上一维材料阵列的生长与平面微阵列生物芯片的点样法及在片合成法结合，即准三维生物芯片的制备与传统的平面微阵列生物芯片的制备兼容，因此所制备的生物芯片不仅具有准三维的特性，而且易于批量进行生产。
图1为一维材料生长法制备准三维生物芯片示意图。
1 基底；2基底生长了一维材料阵列的侧视图；3一维材料阵列上分别固定了传感敏感材料a、b及c的侧视图；4一维材料阵列上分别固定了传感敏感材料a、b及c的俯视图。
图2为先分区后生长一维材料阵列法制备准三维生物芯片示意图。
1，基底侧视图；2’分区涂布了一维材料生长催化材料的基底侧视图；’基底分区生长一维材料阵列侧视图；，生长一维材料阵列不同分区固定不同传感敏感材料A、B、及C的侧视图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明涉及一种准三维生物芯片的制备，尤其是在基底材料上生长一维材料阵列后再在其不同区域固定不同的传感敏感材料，该方法采用下述步骤制备a、在基底上生长一维材料的阵列以获得含有一维材料阵列的平面材料；b、在平面材料的一维材料阵列上不同区域分别固定不同传感敏感材料以获得准三维生物芯片。该方法首次将检测基底上一维材料阵列的生长与平面微阵列生物芯片的点样法及在片合成法结合，即准三维生物芯片的制备与传统的平面微阵列生物芯片的制备兼容，因此所制备的生物芯片不仅具有准三维的特性，而且易于批量进行生产。
本发明提供一种准三维生物芯片的制备方法，该方法包括如下步骤a、在基底上生长一维材料的阵列以获得含有一维材料阵列的平面材料；b、在平面材料的一维材料阵列上不同区域分别固定不同传感敏感材料以获得准三维生物芯片。
所述一维材料为长度与直径之比大于2的材料。
固定所述传感敏感材料是指在一维材料阵列表面先固定连接材料再通过连接材料连接传感敏感材料。
所述的在一维材料的不同区域分别固定不同传感敏感材料的方法包括点样法及在片合成法。
所述的在基底上生长一维材料是指采用在基底面内均勻生长或者在基底上预先构建的点阵列上生长。
该方法包括对生长了一维材料阵列的平面材料进行切割、组装以构建准三维生物-H-· I I心片。
所述准三维生物芯片通过与待检样品作用而用于检测。
实施例一首先制备4英寸的掩模板，上有边长为100微米且间距为100微米的方块形阵列。然后据此通过微电子工艺在硅片上制备边长为100微米，高度约为20微米，间隔为100微米的微坑阵列。
将由PDMS前体与固化剂按质量比10 1混勻，去除气泡后浇铸于上述具有微坑阵列的硅片模具中，置于烘箱加热固化。脱模后获得间距为100微米，高度约为20微米边长约为100微米的凸型方块阵列的PDMS模板。然后将其浸入含IOOmM的醋酸锌的含1% 二乙醇胺的乙醇溶液中，取出，待突出表面干燥后将其压于干净的载玻片上，然后将PDMS模板移走。将载玻片在80摄氏度下乙醇饱和蒸汽环境中处理30分钟。然后将其置于600摄氏度下处理30分钟后以10摄氏度/分钟冷却至室温。得到覆盖有氧化锌种子的载玻片。将该载玻片置于含30mmol十二烷基磺酸钠和3mmol的无水醋酸锌的100毫升二甲苯溶液中， 随后通过含20%乙醇的水合胼调节溶液的PH值至11. 3，于90摄氏度反应5小时后用去离子水清洗并在室温下干燥得到在间距为100微米边长为100微米的方块形阵列上生长有直径约为80至100纳米，而长度约为3微米的氧化锌纳米杆微阵列薄膜的载玻片。将该载玻片通过点样法依次用5% 3-氨丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液处理10分钟后乙醇清洗、 干燥。随后用PH为7. 4的5%戊二醛的PBS缓冲液室温处理2小时，用PBS缓冲液清洗后再用5 %乙醇胺的乙醇溶液处理2小时，随后用3M的硼氢化钠水溶液处理15分钟以使得氧化锌纳米杆表面含有羟基。随后通过喷墨原位合成技术将寡核苷酸原位合成的清洗液乙腈，偶联液即0. IM寡核苷酸单体及0. 5M四唑的乙腈溶液；封闭液即乙酸酐吡啶溶液及甲基咪唑四氢呋喃溶液；氧化液即0. IM碘的乙酸/乙酸酐/吡啶/四氢呋喃溶液及脱DMT液即 3%的三氯乙酸二氯甲烷溶液按照偶联、封闭、氧化和脱DMT的重复步骤在含羟基的氧化锌纳米杆阵列上在片合成寡核苷酸探针序列。设计的探针是为了定量研究肿瘤中甲基化的发生情况，即通过完全甲基化DNA和完全非甲基化DNA互补的两条探针组成的6组寡核苷酸探针与肿瘤样本抽提DNA文库进行杂交以了解重要生长抑制因子IGFBP7基因的甲基化状况。设计的探针分别为 5，- ACG CTC GTA CCC ACC TT_3，;5，- AAC ACT CAT ACC CAC CTT ΑΟΤ-β^δ' -CTA AAC CGA ACG ACG ΟΑ-β^δ' - CTA AAC CAA ACA ACA CAA ΑΑΤ-β^δ' -CGT CGA ΑΤΑ TAC CCT TCG-3' ；5' - CCC ATC AAA TAT ACC CTT CA-3' ；5' - AAA CCG CCG CGA ACG-3' ；5' - AAC AAA ACC ACC ACA AAC AC-3' ；5' - ATA AAC AAC GCG AAA CG-3' ；5'-AAT AAA CAA CAC AAA ACA AAA C_3，；5，- ACC CGC GAA AAA ATC G_3，；5，- AAA ATA CCC ACA AAA AAA TCA-3，。
另外进行待测样品的检测准备。首先通过超声打断所提取的基因获得400bp至 500bp的DNA片段，然后通过甲基化DNA免疫共沉淀、DNA片段线性扩增及荧光标记即获得可用于杂交的待测样品。将上述荧光标记过的待测样品与上述制备好的基因芯片在42摄氏度进行杂交3小时，随后用IOmM Tris及ImM EDTA组成的TE缓冲液彻底清洗并用氮气吹干后立即用扫描仪进行成像。根据微柱阵列不同探针区域荧光的有无及强弱即可判断所检测样品中IGFBP7基因的甲基化状况。
实施例二 首先制备方块形边长为200微米间隔为200微米的约10微米高的PDMS印章，然后在 PDMS印章表面涂布0. l%w/v的聚赖氨酸水溶液并用氮气轻轻吹干，然后将其压印在干净的硅片表面30秒钟，随后用l%w/v的40纳米银胶水溶液再处理30分钟，并用氮气轻轻吹干。 将该硅片放置在管式炉中距离位于炉中心以2比1混合的石墨与氧化锌粉混合物下游约6 英寸处，然后以100立方毫米每分钟的速度通入氩气，并在900摄氏度反应1小时得到在硅片上200微米间隔区域内均勻覆盖氧化锌纳米杆阵列的硅片。将该硅片通过5% 3-氨丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液浸泡5分钟并用乙醚、丙酮及乙醇清洗后用5%戊二醛的PH 为7. 4的PBS缓冲液室温反应2小时后，随后用PBS缓冲液清洗三次。然后通过点样法将含1毫克/毫升的PBS缓冲液的50种常见致病细菌微生物的抗体滴加在硅片上不同氧化锌纳米杆阵列区域，在4摄氏度反应12小时。用PBS缓冲液彻底清洗后，未反应的戊二醛用1%的BSA的PBS缓冲溶液反应2小时进行阻塞。随后用PBS缓冲液彻底清洗，在37摄氏度与待测样品在振荡器中以ISOrpm速度孵育2小时，然后用PBST缓冲溶液清洗三次。加入由50种4微克/毫升的CY3标记致病细菌微生物抗体的混合PBS缓冲溶液，在37摄氏度以60RPM的速度孵育1小时，随后用PBS清洗三次并在荧光显微镜下观察，根据不同氧化锌纳米杆阵列区域荧光的有无及强弱即可判断所测定样品中是否含有50种常见致病细菌微生物。
实施例三配制2mM的醋酸锌的含1% 二乙醇胺的乙醇溶液，将载玻片浸入其中并取出在80摄氏度处理5分钟。重复6次后在600摄氏度处理30分钟。上述过程重复三次以保证载玻片全部且均勻地覆盖上氧化锌种子。另外在50毫升二甲苯中加入15mmol十二烷基磺酸钠和 1. 5mmol的无水醋酸锌并通过含20%乙醇的水合胼调节溶液的PH值至10. 6，然后将上述覆盖了氧化锌种子的载玻片置于其中，于90摄氏度反应5小时后用去离子水清洗并在室温下干燥得到上有直径约为60纳米，而长度约为2微米的氧化锌纳米杆阵列。将该载玻片依次通过5% 3-氨丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液浸泡5分钟、5%戊二醛的PH为7. 4的PBS 缓冲液室温反应2小时后，随后用PBS缓冲液10分钟清洗三次。然后分别用0. 2mg/ml的甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的PBS缓冲溶液通过点样仪在载玻片氧化锌纳米杆微阵列的不同区域进行点样并在4摄氏度反应12小时。用PBS缓冲液彻底清洗后，未反应的戊二醛用1%的BSA的PBS缓冲溶液反应2小时进行阻塞。PBS缓冲液清洗后将其与待测样品混合并在37摄氏度于振荡器中以ISOrpm速度孵育2小时，然后用PBST缓冲溶液清洗三次。加入4微克/毫升的CY3标记甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体PBS缓冲溶液，在37摄氏度以 60RPM的速度孵育1小时，随后用PBS清洗三次并在荧光显微镜下观察载玻片上氧化锌纳米杆阵列的不同区域的荧光即可判断待测样品中甲肝病毒、乙肝病毒及丙肝病毒的有无。
实施例四首先制备方块形的边长为50微米，间距为50微米的约20微米高的PDMS印章，然后在 PDMS印章表面涂布0. l%w/v的聚赖氨酸水溶液并用氮气轻轻吹干，然后将其压印在干净的 7. 5厘米X2. 5厘米的硅片表面30秒钟。随后用l%w/v的50纳米胶体金水溶液处理聚赖氨酸处理过的硅片10分钟并用氮气轻轻地吹干。将该硅片放入化学气相沉积反应器中。将化学气相沉积反应器的气压控制在小于lmTorr并在氩气以20立方毫米每分钟的速度及氢气以60立方毫米每分钟的速度的气氛下加热至550摄氏度，并保温1小时。然后控制气压至70ΤΟΠ·并以3立方毫米每分钟的速度引入含10%氩气的SiH4反应20分钟，得到硅纳米杆阵列的硅片。随后将生长了硅纳米杆阵列的硅片置于氧气流速为SOOml/min功率为40W 的等离子发生器中用氧等离子处理2分钟以使暴露的微柱表面连接上羟基。其后将该硅片通过5% 3-氨丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液浸泡5分钟并用乙醚、丙酮及乙醇清洗后用5%戊二醛的PH为7. 4的PBS缓冲液室温反应2小时后，随后用PBS缓冲液清洗三次。随后将其置于5%乙醇胺的乙醇溶液中反应2小时并用乙醇清洗三次后再用3M的硼氢化钠水溶液还原15分钟，随后去离子水清洗，得到可用于在片寡核苷酸合成的羟基修饰硅纳米杆阵列的硅片。
随后根据针对人的基因根据每个基因设计3-5个探针的原则设计长度为50mer的可用于检测人全基因组表达谱的160000个探针。随后通过Agilent喷墨原位合成技术根据偶联、封闭、氧化、脱DMT的步骤在上述羟基修饰硅纳米杆阵列硅片上进行在片合成160000 个探针从而得到人全基因组表达谱基因芯片。
另外提取IO7个在镍钛记忆合金表面生长的从人体胎盘提取的内皮细胞，然后通过RNA提取、aRNA合成与荧光标记及片段化步骤后获得可与基因芯片杂交的荧光标记探针。随后将荧光标记探针与上述人全基因组表达谱基因芯片杂交并通过基因芯片扫描仪进行荧光图像扫描即可获得在镍钛记忆合金表面生长的内皮细胞的基因表达情况。随后的生物信息学分析可以帮助人们获得探究镍钛记忆合金表面对人内皮细胞在基因表达方面的影响，从而为相关心血管器件的研制提供参考借鉴依据。
实施例五首先制备方块形的边长为50微米，间距为50微米的约20微米高的PDMS印章，然后在 PDMS印章表面涂布0. l%w/v的聚赖氨酸水溶液并用氮气轻轻吹干，然后将其压印在干净的 7. 5厘米X2. 5厘米的硅片表面30秒钟。随后用l%w/v的50纳米胶体金水溶液处理聚赖氨酸处理过的硅片10分钟并用氮气轻轻地吹干。将该硅片放入化学气相沉积反应器中。将该硅片放置在水平石英炉中距离位于炉中心放置以1比2混合的石墨与氧化锡粉混合物下游约5厘米处，然后以200立方毫米每分钟的速度通入氩气，并在900摄氏度反应1小时得到在硅片上含催化剂胶体金的方块形的边长为50微米，间距为50微米间隔区域的氧化锡纳米杆阵列薄膜。其后将该硅片通过5% 3-氨丙基三甲氧基硅烷的二氯甲烷溶液浸泡5分钟并用乙醚、丙酮及乙醇清洗后用5%戊二醛的PH为7. 4的PBS缓冲液室温反应2小时后， 随后用PBS缓冲液清洗三次。然后通过点样法将与I型糖尿病相关的抗原的抗体以0. 2mg/ ml的浓度的PBS缓冲溶液在硅片上氧化锡纳米杆微阵列的不同区域进行点样并在4摄氏度反应12小时。
I型糖尿病相关的抗原包括腮腺炎病毒抗原、柯萨奇病毒B4抗原、风疹病毒抗原、人肠道孤病毒抗原、甲状腺球蛋白抗原、甲状腺过氧化物酶抗原、甲状腺素受体抗原、甲状球微粒体抗原，ICAs、IAAs、GADAs、IA 一 2As抗原，胰岛细胞表面抗原、胰岛素受体抗原、羧肽酶一 H，IA — Zp、’肾小球基底膜抗体抗原。
用PBS缓冲液彻底清洗后，未反应的戊二醛用1%的BSA的PBS缓冲溶液反应2小时进行阻塞。PBS缓冲液清洗后将其与待测样品混合并在37摄氏度于振荡器中以ISOrpm 速度孵育2小时，然后用PBST缓冲溶液清洗三次。加入4微克/毫升的CY3标记的相关二抗PBS缓冲溶液，在37摄氏度以60RPM的速度孵育1小时，随后用PBS清洗三次并在荧光显微镜下观察硅片上氧化锡纳米杆阵列的不同区域的荧光即可判断待测样品的患者是否患有I型糖尿病。
权利要求
1.一种准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤a、在基底上生长一维材料的阵列以获得含有一维材料阵列的平面材料；b、在平面材料的一维材料阵列上不同区域分别固定不同传感敏感材料以获得准三维生物芯片。
2.根据权利要求1所述的准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，所述一维材料为长度与直径之比大于2的材料。
3.根据权利要求1所述的准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，固定所述传感敏感材料是指在一维材料阵列表面先固定连接材料再通过连接材料连接传感敏感材料。
4.根据权利要求1所述的准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，所述的在一维材料的不同区域分别固定不同传感敏感材料的方法包括点样法及在片合成法。
5.根据权利要求1所述的准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，所述的在基底上生长一维材料是指采用在基底面内均勻生长或者在基底上预先构建的点阵列上生长。
6.根据权利要求1所述的准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括对生长了一维材料阵列的平面材料进行切割、组装以构建准三维生物芯片。
全文摘要
本发明涉及一种准三维生物芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤a、在基底上生长一维材料的阵列以获得含有一维材料阵列的平面材料；b、在平面材料的一维材料阵列上不同区域分别固定不同传感敏感材料以获得准三维生物芯片。所述一维材料为长度与直径之比大于2的材料。该方法首次将检测基底上一维材料阵列的生长与平面微阵列生物芯片的点样法及在片合成法结合，即准三维生物芯片的制备与传统的平面微阵列生物芯片的制备兼容，因此所制备的生物芯片不仅具有准三维的特性，而且易于批量进行生产。
文档编号G01N33/569GK102520151SQ20111040802
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者张继中 申请人:东南大学