专利名称：同时检测对虾白斑病毒和桃拉病毒的层析条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于免疫学与病毒学交叉技术领域，具体涉及ー种能够同时检测对虾白斑病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的层析条。
背景技术：
二十世纪80年代以来,世界沿海各国的对虾养殖业蓬勃发展，随着对虾养殖业的企业化发展，其病害也日益突出，特别是对虾病毒性的疫病已成为阻碍这ー产业发展的重要因素。对奸白斑综合症病毒(WSSV, White Spot Syndrome Virus)是一种没有包涵体的新型杆状病毒，毎年造成对虾大量死亡，给生产带来巨大损失，是迄今为止危害最为严重的一种对奸病毒。桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)是一种无囊膜的单链正股RNA病毒,属于双反病毒科，但尚未确定属。1992年对虾桃拉病首次在厄瓜多尔海湾Taura河流域的养殖场爆发，死亡率高达60% -90%，此后在拉丁美洲大流行，给对虾养殖业造成巨大损失， 2005年委内瑞拉因爆发TSV而造成对虾养殖损失高达10-13亿美元。随着对虾养殖与贸易的全球化，桃拉病也传人了中国。近年来的对虾白斑综合征病毒、桃拉综合症病毒等病毒性传染病在世界范围内的传播除给对虾养殖业带来严重经济损失之外，还对海洋资源的可持续发展造成巨大威胁， 因此对虾病毒病的研究已成为当前世界虾病研究领域的焦点之一。对虾病毒的传播途径主要有两种，一种是投喂被病毒污染饵料而经ロ感染，包括鲜活饵料和水体，摄食病虾尸体或病虾排泄物等。另ー种是接触感染，健康对虾在水体中与病虾接触易感染。此外，垂直传播在对虾病毒传播中也起重要的作用。目前对虾病毒尚无有效的药物治疗，因此避免与病毒病原体的接触是最有效的预防措施，因此借助早期诊断技术、及早预防，将有利于防止病毒的发生及传播。目前，已经有多种方法用来检测诊断对虾病毒，有显微镜观察法、生物学方法、免疫测定法、细胞培养法、生化检验法、分子生物学方法等。以上方法对于对虾养殖者来讲掌握难度大，难以推广，从而这些技术的应用和发展受到了限制。免疫胶体金技术是60年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫測定技木。胶体金免疫层析法是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。该方法最大特点是单份測定、简单快速、特异敏感，不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用观察实验結果。在应用胶体金免疫层析法检测对虾病毒方面，杜华华等的专利“一种检测对虾白斑综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法(申请号201010228584. X) ”，孟小林等的专利“检测对虾白斑综合症病毒的试纸条及其制备方法(200610124654. 0) ”，费荣梅等的专利“对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条(申请号201010189767. 5) ”，以往利用胶体金免疫层析技术的专利以表达的P28蛋白制备多克隆抗体或单克隆抗体为原料，只能单纯检测ー种对虾病毒，由于表达的p28単一蛋白制备多克隆抗体或单克隆抗体后出现假阳性的可性比较高。
实用新型内容为了解决上述问题，本实用新型的目的在于提供ー种可快速、准确、简便、以及同时检测出WSSV和TSV的层析条。为实现上述目的，本实用新型所采用技术方案如下ー种同时检测对虾白斑病毒和桃拉病的层析条，包括一基板，在所述基板上从左至右依次粘贴有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜、以及吸收垫。所述同时检测对虾白斑病毒和桃拉病的层析条，所述样品垫的长为2. 0厘米宽为
0.8厘米，所述胶体金标记垫的长为0. 4厘米宽为0. 8厘米，所述硝酸纤维素膜的长为2. 2 厘米宽为0. 8厘米，所述吸收垫的长为2. 8厘米宽为0. 8厘米。本实用新型中的胶体金标记垫，以胶体金来标记抗WSSV抗体和抗TSV抗体，来同时检测对虾体内的WSSV和TSV，此法方法方便、简单、快速，适合现场检测使用。本实用新型通过一次操作可同时检测出WSSV和TSV，无需专门设施和操作技木，适于普通养殖户池边检测。
[0013]此附图说明所提供的图片用来辅助对本实用新型的进ー步理解，构成本申请的ー部分，并不构成对本实用新型的不当限定，在附图中[0014]图I为本实用新型层析条的结构示意图；[0015]图2为检测结果中WSSV和TSV都呈阳性的示意图；[0016]图3为检测结果中WSSV呈阳性的示意图；[0017]图4为检测结果中TSV呈阳性的示意图；[0018]图5为检测结果呈阴性的示意图；[0019]图6为检测结果无效的示意图。[0020]图示[0021]I、样品垫 2、胶体金标记垫[0022]3、硝酸纤维素膜 4、吸收垫
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施方法来详细说明本实用新型，在本实用新型的示意性实施及说明用来解释本实用新型，但并不作为对本实用新型的限定。实施例I :如图I所示，本实用新型公开了ー种同时检测对虾白斑病毒和桃拉病的层析条， 包括一基板，在基板上从左至右依次粘贴有样品垫I、胶体金标记垫2、硝酸纤维素膜3、以及吸收垫4 ;其中，样品垫I选用滤油纸样品垫，其长为2. 0厘米宽为0. 8厘米；其中，胶体金标记垫2的抗WSSV抗体(购买于abeam公司)和抗TSV抗体(购买于abeam公司)，其长为0. 4厘米宽为0. 8厘米；其中，硝酸纤维素膜3，依次包被WSSV、TSV和羊抗兔IgG(购买于武汉博士德)，其上检测线成阶梯状交错分布，其长为2. 2厘米宽为0. 8厘米；其中，吸收垫4可选用棉浆板，其长为2. 8厘米宽为0. 8厘米，吸收垫4上有与硝酸纤维素膜3上的具体检测线相对应的标识区。ニ、本实用新型层析条的制备方法(I)对虾白斑综合病病毒和桃拉综合病病毒的制备采用蔗糖密度梯度超速离心法提取，步骤如下①分别收集感染白斑综合病病毒和桃拉综合病病毒的对虾腮和血淋巴液，用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液，经反复冻融3次后，置于_20°C冰箱中，备用。②先以5000g离心15min,取上清,然后再20000g高速离心30min后取上清过夜。 接着IOOOOOg超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。③先在超速离心管中加入5_8mL的第2步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 %，45 %，60 %的蔗糖，加的时候是用长针头从底部往上加的。I IOOOOg 离心2. 5h，发现在30%与45%以及与60%之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。④去蔗糖用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后IlOOOOg离心3h，用少量STE 缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。_20°C冻纯，用时可用分光光度计测定其病毒含量。得到了 WSSV病毒TSV病毒。(2)胶体金的制备取0. 01%氯金酸溶液100ml，加热煮沸，搅拌下快速加入I. Oml 的I %柠檬酸三钠溶液，直到溶液颜色稳定成酒红色，用0. lmol/L的K2C03溶液将胶体金溶液调PH值至8. 5，即得到胶体金溶液。(3)金标抗体制备搅拌下将抗WSSV抗体和抗TSV抗体5 U g/ml加入上述a步中胶体金溶液中混合，然后加入10%牛血清白蛋白(BSA)溶液10ml，将此标记好的胶体金结合物10000-14000r/min离心30-60分钟，弃上清，将沉淀用含I % BSA的磷酸盐(PBS)缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心，如此洗涤2-4次，最后将沉淀悬浮于1/10体积含I % BSA的 PBS缓冲液中。(4)载有金标抗体的结合垫的制备将(3)中制备的胶体金结合物溶液均匀涂在玻璃纤维上，冷冻干燥，密封备用。(5)检测反应区取硝酸纤维素膜(NC膜)贴在基板中间，将纯化的WSSV和TSV在 NC膜上依次划线，为抗体检测线T线，接着用羊抗兔IgG在NC膜下方划质控线(C线)，再用1%的牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜，将已喷好的硝酸纤维素膜真空干燥2小时，密封备用。(6)组装在底板上一端依次相互搭接地粘贴样品吸收垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜，另一端贴附吸收垫。三、检测方法首先取对虾腮，加入适量纯浄水充分捣碎制成待检样品。接着将试纸条的样品垫浸入待检样品中，5分钟后观察結果。如图2所示，WSSV与TSV阳性结果WSSV与TSV检测线处与质控线上下呈现三条红色的检测线，表示有WSSV与TSV感染。如图3所示，WSSV阳性结果WSSV检测线处与质控线上下呈现两条红色的检测线， 表示只有WSSV感染。[0041 ] 如图4所示，TSV阳性结果TSV检测线处与质控线上下呈现两条红色的检测线，表示只有TSV感染。如图5所示，阴性结果只有质控线呈现出一条红色的检测线，表示无WSSV与TSV 感染，或者WSSV与TSV含量极低。如图6所示，无效结果检测线与质控线均无红色线出现，表示检测结果无效。以上对本实用新型实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本实用新型实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本实用新型实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实用新型实施例，在具体实施方式
以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本实用新型的限制。
权利要求1.ー种同时检测对奸白斑病毒和桃拉病毒的层析条，包括一基板，其特征在于在所述基板上从左至右依次粘贴有样品垫(I)、胶体金标记垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、以及吸收垫⑷。
2.根据权利要求I所述的同时检测对虾白斑病毒和桃拉病毒的层析条，其特征在于 所述样品垫(I)的长为2. 0厘米宽为0. 8厘米，所述胶体金标记垫(2)的长为0. 4厘米宽为0. 8厘米，所述硝酸纤维素膜(3)的长为2. 2厘米宽为0. 8厘米，所述吸收垫(4)的长为2. 8厘米宽为0.8厘米。
专利摘要本实用新型属于免疫学与病毒学交叉技术领域，具体公开了一种同时检测对虾白斑病毒和桃拉病毒的层析条。该层析条，包括一基板，在所述基板上从左至右依次粘贴有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜、以及吸收垫。本实用新型中的胶体金标记垫，以胶体金来标记抗WSSV抗体和抗TSV抗体，来同时检测对虾体内的WSSV和TSV，此法方法方便、简单、快速，适合现场检测使用。本实用新型通过一次操作可同时检测出WSSV和TSV，无需专门设施和操作技术，适于普通养殖户池边检测。
文档编号G01N33/569GK202339344SQ20112026944
公开日2012年7月18日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者李健兴, 李月明, 温俊林, 王少沛, 赵肃清, 闫鸿鹏 申请人:广东工业大学, 广州清绿健康科技发展有限公司