用于组织保存的产品和方法

专利名称：用于组织保存的产品和方法
用于组织保存的产品和方法交叉引用
本申请要求于2010年4月12日提交的美国临时申请号61/323，185的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。技术领域
本发明总体上涉及例如在用于病理学分析或用于组织研究应用的组织处理过程中稳定大分子或保持组织完整性。本发明提供了一组用于组织保存的小分子或溶质。
背景技术：
甲醛水溶液(福尔马林)组织固定是目前医学病理学的黄金标准。在20世纪早期，福尔马林固定技术经高度优化得以支持染料和金属染色剂的使用。20世纪中期，由于大部分蛋白质表位稳定并且尺寸小，发现同样的福尔马林固定技术支持抗体在免疫组织化学中的应用。
病理学中的固体组织固定(FFPE)标准是10%的磷酸盐缓冲的福尔马林，在25°C 下温育8-24小时，然后在乙醇中脱水，将溶剂更换成二甲苯，然后用熔化温度(Tm)约为 56°C的石蜡聚合物共混物包埋。该过程提供高度可重现的染料染色，但产生已断裂的并且被化学损伤内部修饰的DNA和RNA互补物。
在完全脱水、石蜡包埋的组织中，DNA和RNA在长储存期内并不稳定。数据让人想起所有核酸在环境温度下在诸如滤纸的基质中干燥储存时所见的情况。这种时间依赖性的核酸损伤可能是由于残余水污染所造成的(缓慢)水解，或者甚至更可能地，是由于核酸与已经渗透进FFPE组织块的分子氧的扩散相互作用所造成的核酸碱基(尤其是G)的缓慢氧化。
在甲醛水溶液处理过程中导致的并发核酸损伤，由于核酸的不稳定性和基因组测试所需要的大片段核酸靶标-通常至少500个碱基，极大地限制了基因组学的应用。已经证明，如果通过使用有机溶剂混合物来完全取代福尔马林进行固定，能够获得高度稳定的DNA 和RNA。然而，这些“非福尔马林”方法尚未被病理学界接受，因为它们产生的组织形态学变化虽然少但非常显著，并且基于溶剂的固定剂需要对一个世纪以来的实验室标准操作程序进行显著的改变。发明内容
本发明提供在样品固定过程中使用降解抑制剂来增加/维持样品内容物(例如， 样品核酸、蛋白质等)的完整性。例如，在一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制蛋白质的翻译后磷酸化修饰(即磷_蛋白质)的完整性的损失。在另一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制以下材料的降解或维持其完整性 纯化或未纯化的多核苷酸，包括例如DNA (dsDNA和ssDNA)、甲基化DNA、线粒体DNA、叶绿体 DNA、DNA-RNA杂合体、RNA、mRNA、rRNA或其混合物，例如微生物如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类的生物材料的基因、染色体、质粒和基因组及其片段。因此，降解抑制剂可以是多核苷酸降解抑制剂或蛋白质降解抑制剂。
可以进一步分析此处所述的样品以用于体外诊断应用或研究应用。在一些实例中，采用核酸分析法分析此处所述的样品。
可以在根据本发明的方法固定后对样品核酸进行的核酸分析的例子包括但不限于扩增，如单链扩增、指数式扩增、PCR、数字PCR、定量PCR、实时PCR，测序，包括焦磷酸测序、单链延伸测序、单分子测序、连接测序、杂交测序，RFLP, SNP分析,微阵列分析等。
可以进一步分析此处固定的样品以检测或诊断病症，包括但不限于癌症、胎儿异常、自身免疫病和其他遗传性疾病。
核酸降解抑制剂的例子包括，例如核酸酶抑制剂。优选地，本发明使用的核酸降解抑制剂是具有透过细胞或组织的能力的小分子。与不存在抑制剂的条件下的降解相比，核酸降解抑制剂优选地抑制多核苷酸降解达至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 99.5%。所用的抑制剂的浓度可以变化。在一些实例中，可以加入此处所述的抑制剂以达到< O. 05、O. lmM、0. 5mM、或IOmM的单独或最终集合浓度。
在一些实例中，核酸降解抑制剂是DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。
在一些实例中，在“固定”过程中将多种组织渗透性的、广谱核酸酶抑制剂加入固定剂(如福尔马林)中。固定步骤中广谱核酸酶抑制剂的加入导致更好的DNA和/或RNA 完整性。例如，采用本发明的方法，DNA可以保持大于约I. 0,5. O或IOkb的长度超过一周、 一个月、一年或十年。同样地，采用本发明的方法，RNA可以保持大于约O. 1、0.5、1.0或IOkb 的长度超过一周、一个月、一年或十年。
表I在此描述了示例性的核酸酶抑制剂。
表2描述了示例性的ROS清除剂。
在一些实施方式中，降解抑制剂是磷酰基转移酶超家族的抑制剂。
在一些实施方式中，降解抑制剂是小分子。然而，它也可以是酶或抗体或其他化合物。优选地，抑制剂具有高组织渗透性。例如，本发明的抑制剂可以以> lmm/hr、5mm/hr、 10mm/hr>20mm/hr> 100mm/hr的速率渗透组织。在一些实例中，本发明的降解抑制剂以50% 的抑制剂在4小时、3小时、2小时、I小时、30分钟、20分钟、10分钟或I分钟内渗透组织的速率渗透组织。
在一些实例中，降解抑制剂包含螯合剂。螯合剂可以是Mg2+螯合剂，或更优选 EDTA。在一些方面，螯合剂与RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂联合使用。
优选地，降解抑制剂小到足以容易地扩散到直径小于40nm的孔内。
降解抑制剂可以单独使用或联合使用。在一些实例中，在固定步骤中至少加入2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸降解抑制剂，例如通过加入到固定剂中或乙醇的醇清洗液中。例如，核酸酶抑制剂、ROS清除剂和/或磷酰基转移酶超家族抑制剂的组合可以一起加入。
如上面所提供的，抑制剂可以加入到固定剂中。或者备选地或额外地，它们也可以加入到醇清洗液(例如，在组织处理过程中使用的第一水_乙醇清洗液)中。
因此，在一些实例中，本发明涉及含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂的组合物，这些降解抑制剂或者都在一个容器中或者在不同的容器中但在一个试剂盒中。在一些实例中，本发明涉及含有固定剂(如福尔马林)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂。在又一实施方式中，本发明涉及含有醇清洗液(如乙醇清洗液)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 种不同的降解抑制剂。因此，在一个实施方式中，本发明涉及含有福尔马林和降解抑制剂的溶液。优选地，降解抑制剂是分离的或合成的。优选地，降解抑制剂是小分子。溶液可以进一步含有样品。在一些实施方式中，溶液由或基本由福尔马林或其他固定剂和降解抑制剂组成。
降解抑制剂优选地在37°C下一个月后在福尔马林固定的组织中以下述水平保持不受损伤的DNA链长度和不受损伤的RNA链长度，其与完成固定后立即获得的水平相当或与该水平相差在 90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,5%,3%^； 1% 内。
可在福尔马林固定过程之前或期间加入核酸降解抑制剂。
因此，本发明提供包含以下成分、由以下成分组成或基本由以下成分组成的组合物(i) 一种或多种降解抑制剂，和(ii)福尔马林或醇清洗液。
在本发明的任何实施方式中，福尔马林可以是磷酸盐缓冲的1-37质量％的福尔马林。
本发明的任何组合物可进一步含有生物样品。该生物样品优选地是组织样品。该样品优选地来自哺乳动物或人类。援引并入
所有在本说明书中提到的出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度等同于具体且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。
具体实施方式
本文所用的术语“样品”或“生物样品”是指组织样品、器官样品、个体细胞或以上任意一种的一部分。优选的样品的例子包括组织样品，如用于检测癌症突变(如与独特的预后或治疗选择有关的EGFR或HER2突变)或癌症基因异常表达的活检组织。样品的其他例子包括含有颊内细胞、口颊细胞、毛发样品、血液样品和粘液样品的颊拭子。
本文所用的术语“抑制”和“抑制剂”也指活性降低或降低活性的化合物，例如，其中降低至少50%、40%、30%、20%的活性。进旦冃月^
本发明提供用于在保存期间，例如，在用于病理学分析或用于组织研究应用的组织处理期间，稳定大分子的试剂、方法和试剂盒。特别地，本发明涉及向福尔马林溶液中或向与福尔马林溶液接触之前的样品中加入降解抑制剂，优选核酸酶抑制剂，以提高样品中生物分子(如DNA、RNA或蛋白质)的完整性。
甲醛是一种气体，其在水中饱和时水合，形成在组织渗透过程中为活性剂的甲二醇(也称作“福尔马林”)。水合是缓慢可逆的，并且产生的游离coh2(在平衡状态下可得到)造成所观察到的蛋白质和核酸的化学修饰。在水合的COH2和组织之间所期望的化学反应是蛋白质上非常紧密间隔排列的胺基团的交联，从而形成所谓的甲醛交联或 (-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中，例如,R1和R2可以是在相邻蛋白质上或在同一蛋白质内紧密相间排列的赖氨酸或天冬酰胺侧链。如果两个反应物在O. 1-0. 2nm内，以平均时间算，这样的交联非常迅速地发生，而且与相对较小的、正的生成焓有关(即，甚至在低温下该过程也能迅速进行)。这些迅速形成的甲醛交联是为显微镜检查提供所期望的组织形态学稳定性的化学连接。正如所预期的，所生成的双_烷基-氨基交联对于酸或碱中的水解是非常稳定的。在没有胺基因接近时，反应停止于单氨基加成物(-R1-NH-CH2-OH)的形成，该加成物在低温下也容易形成，但是在酸和碱中容易逆转。不受理论的约束，本发明的一些实施方式阻止或限制多核苷酸的降解，同时对交联没有或只有有限的影响。
福尔马林和核酸之间的相应反应纯粹是组织副反应，对于组织保存来说是不希望的。稳定的反应产物伴随环外碱性胺，大致反应性顺序为A>C>G。至于蛋白质-蛋白质交联，将要形成的唯一稳定的复合物为(-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中最常见地，R1是环外胺且R2是染色体蛋白质(对于DNA)或RNP (对于RNA)。在不存在这种双官能连接时，单官能 (-R1-NH-CH2-OH)加成物在接近中性时容易逆转，尤其是在加热至约70°C时。在单纯的核酸溶液中，单官能产物或交联产物都不会诱导DNA或RNA链断裂。在染色质免疫沉淀(Chip) 技术领域中，在大鼠肝脏模型中，Masuda等人针对RNA以及Tokuda等人针对DNA都已经证实了这一发现。因此，在固体组织的福尔马林固定期间观察到的核酸断裂并不是由于甲醛化学。相反，这是组织浸泡在磷酸缓冲液中几个小时期间内源性组织核酸酶活性的结果。因此，不受理论的束缚，本发明的实施方式旨在在组织浸泡在磷酸缓冲液中几个小时期间防止内源性组织核酸酶活性。
降解抑制剂及其应用
本发明涉及减少样品固定期间的多核苷酸降解和/或蛋白质降解的方法。虽然通常采用福尔马林进行固定，但本发明考虑使用降解抑制剂加上任意固定剂。非福尔马林固定剂的例子包括但不限于醛类、汞制剂、醇类、氧化剂、苦味酸盐和醇固定剂。不受理论的束缚，内源性组织核酸酶活性可能是由于样品中水的存在引起的。在一个实施方式中，本发明进一步提供了用于在初始固定步骤中消除水以便消除内源性组织核酸酶活性的试剂和方法。例如，醇固定剂或用醇-氯仿或醇-PEG固定可以用来消除样品中的水并产生高分子量组织补充物的保留。
无论使用哪种固定剂，本发明考虑向样品和/或固定剂中加入一种或多种降解抑制剂。例如，降解抑制剂可以是多核苷酸降解抑制剂和/或蛋白质降解抑制剂。优选地，固定剂是福尔马林且降解抑制剂不是福尔马林。降解抑制剂可以是分离的、天然存在的试剂或非天然存在的试剂。
降解抑制剂可以包括任何减少或抑制核酸或蛋白质降解或断裂的化合物。因此， 术语“抑制”或“抑制剂”或“将...抑制”分别与“减少”、“减少剂”或“使...减少”同义。 涉及降解时，减少优选地是在一段时间内与不存在抑制剂时的降解相比，至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%或99%的减少。然而，任何核酸降解的减少或完整性都被认为是降解的抑制。
降解抑制剂包括但不限于磷酰基转移酶超家族的抑制剂，如螯合剂、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂，以及活性氧(ROS)的清除剂或抑制剂。在一些情况下，降解抑制剂是酶。 在一些情况下，降解抑制剂是小分子。优选地，它是水溶性的。优选地，它难溶于醇或二甲苯，因此在组织转移至无水溶剂时，它永久性地嵌入脱水的组织块基质中。
螯合剂可用作磷酰基转移酶超家族的抑制剂。螯合剂的非限制性例子包括: (2-羟丙基)-β -环糊精溶液；一水合2，3- 二巯基-I-丙磺酸钠盐；3_羟基-2- (5-羟基戊基)苯并吡喃-4-酮；(+)-(18-冠-6)-2，3，11，12-四甲酸；氨基己酸次氮基三乙酸；α -环糊精；氨基己酸次氮基三乙酸三叔丁酯；酒石酸二铵；ΒΑΡΤΑ-四甲酯；ΒΑΡΤΑ，游离酸；甲磺酸去铁胺；丁二酮肟；DMSA(间-2，3- 二巯基琥珀酸);EDTA 二钠盐二水合物；EGTA ；EGTA/ AM;乙二胺四(亚甲基膦酸)；SC-300682;乙二胺四乙酸二铵盐；乙二胺四乙酸二钠盐溶液；FLUO 3，五铵盐；HBED;七(6-0叔丁基二甲基甲硅烷基-2，3-二-O-乙酰基)-β -环糊精；IND0 I五钾盐；铁DOTA钠盐；MAPTAM ;N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰基甲基)亚氨基二乙酸；N，N-二甲基癸胺N-氧化物；N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物；Ν4，Να，Να，Ν ε， N ε _[五(羧甲基)]-Ν4-(羧甲基)-2，6_ 二氨基_4_氮杂己酸酰肼；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；亚苯基乙烯三胺五乙酸；植酸六钡盐；吡哆醛异烟酰腙；柠檬酸二氢钾；D_酒石酸二氢钾；一水合草酸钾；四水合酒石酸钠钾；二水合四草酸钾；外消旋(溴乙酰氨基苯基甲基)乙二胺四酸；RH0D 2三铵盐；RH0D2/AM ； [S-甲硫代磺酰基半胱胺基]乙二胺-N，N， N'，N'-四乙酸；(S)-l-(对-溴乙酰氨基苄基)乙二胺四乙酸；一水合酒石酸氢钠；酒石酸二钠溶液；柠檬酸钠；叔-Boc-氨基己酸次氮基三乙酸；四乙酰氧甲基双(2-氨基乙基) 醚N,N,N' ,N'-四乙酸；X-206 ;Zinpyr-l ;或Zinpyr-4。不受理论所束缚,可以认为，由于 DNA酶需要游离Mg2+以实现其功能，因此二价阳离子螯合剂，特别是Mg2+螯合剂，例如EDTA， 在抑制DNA酶方面有效。
RNA酶抑制剂的例子包括但不限于核糖核酸酶抑制因子(RI)。RI是一种大的(约 450个残基，约49kDa)、酸性的(PI约4. 7)、富含亮氨酸的重复蛋白质，它与某些核糖核酸酶形成极其紧密的复合体。RI对氧化作用敏感。在一些实施方式中，ROS清除剂可以用来保护RI免于氧化。在这样的实施方式中，RI和ROS清除剂在共同溶液中使用。有几种市售的RI形式可以在本发明的方法、组合物和试剂盒中使用。它们的非穷尽的清单包括: SUPERase · In 、RNA 酶 cure 、Ambion .⑧ RNAlater 、RNAlater ⑩-ICE、核糖核昔-氧钥； 基络合物、RNasin㊣+RNA酶抑制剂和RNAlater⑩。抗氧化的核糖核酸酶抑制剂(在US 7，650，248中描述)是可在本发明中使用的RNA酶抑制剂的另一个例子。
DNA酶抑制剂的例子包括但不限于脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶的抑制剂。DNA酶的非限制性例子包括N 2-巯基乙醇；2_硝基-5-氰硫基苯甲酸;肌动蛋白;黄曲霉毒素B2a、G2、G2a和Ml (非竞争性)；Ca2+ ；EGTA和EDTA ;十二烷基硫酸钠；小牛脾抑制剂蛋白质；和碳二亚胺和胆固醇硫酸盐。其他的核酸酶抑制剂包括美国 2005/0214839中公开的化合物，其通过引用并入本文。
表I总结了几种磷酸盐拮抗剂。表I.用于固体组织的广谱核酸酶抑制剂
权利要求
1.一种组合物，其包含a.降解抑制剂，和b.福尔马林。
2.权利要求1的组合物，其中所述福尔马林在1-37质量％之间用磷酸盐缓冲。
3.权利要求1的组合物，其进一步包含固体组织样品。
4.权利要求3的组合物，其中所述降解抑制剂小到足以容易地扩散到小于40nm的孔内。
5.权利要求1的组合物，其中所述降解抑制剂包含磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂为RNA酶活性抑制剂。
7.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂为DNA酶活性抑制剂。
8.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
9.权利要求5的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括Mg2+螯合剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述Mg2+螯合剂为EDTA。
11.权利要求5的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括水溶性活性氧清除剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
13.权利要求1的组合物，其中所述降解抑制剂为活性氧清除剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
15.权利要求12的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括Mg2+螯合剂。
16.权利要求15的组合物，其中所述螯合剂为EDTA。
17.一种组合物，其包含a.磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂，和b.活性氧清除剂。
18.权利要求16的组合物，其中所述小分子抑制剂包括表1，并且其中所述活性氧清除 剂为表2。
19.权利要求17的组合物，其进一步包含螯合剂。
20.权利要求18的组合物，其中所述螯合剂为EDTA。
21.—种用于保存生物样品中的多核苷酸的方法，该方法包括a.使所述生物样品与福尔马林接触，b.使所述生物样品与降解抑制剂接触。
22.权利要求21的方法，其中所述生物样品与福尔马林的接触在1°C与6°C之间的温度 或室温下进行。
23.权利要求21的方法，其中所述福尔马林具有在3-10范围内的pH。
24.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
25.权利要求24的方法，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
26.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括水溶性活性氧清除剂。
27.权利要求26的方法，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2)中的一种或多种。
28.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂和水溶性活性氧清除剂。
29.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂包括表I中的一种或多种，并且其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
30.一种用于分析多核苷酸的方法,包括a.获得生物样品，其中该样品已经与福尔马林溶液接触、与降解抑制剂接触、脱水、包埋并储存；b.纯化所述多核苷酸，和c.分析所述多核苷酸。
31.权利要求30的方法，其中所述分析包括进行扩增反应、测序反应、微阵列分析或表达分析。
32.权利要求31的方法，其中所述小分子抑制剂包括表I中的一种或多种。
33.权利要求30的方法，其中所述降解抑制剂包括活性氧清除剂。
34.权利要求33的方法，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
35.权利要求30的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂和活性氧清除剂。
36.权利要求35的方法，其中所述小分子抑制剂包括表I中的一种或多种，并且所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
37.权利要求21或30的方法，其中在降解抑制剂在福尔马林溶液中时进行生物样品与降解抑制剂的接触。
38.权利要求21或30的方法，其中在降解抑制剂在乙醇-水清洗液中时进行生物样品与降解抑制剂的接触。
39.权利要求38的方法，其中所述降解抑制剂是水溶性活性氧清除剂。权利要求39的方法，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。一种用于储存生物样品的试剂盒，包括福尔马林溶液和降解抑制剂。权利要求41的试剂盒，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑
40.
41.
42. 制剂。
43.
44.
45.
46.权利要求42的试剂盒，其中所述小分子抑制剂包括表I中的一种或多种。权利要求41的试剂盒，其中所述降解抑制剂包括水溶性活性氧清除剂。权利要求44的试剂盒，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。一种含有多种多核苷酸的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织，其中至少5%的多核苷酸链为超过300个碱基对。
47.一种从固定的组织中回收的多核苷酸a.其中所述多核苷酸链为至少300个碱基对，b.其中所述组织在福尔马林中固定，c.其中所述福尔马林包含降解抑制剂，d.其中所述固定的组织包埋在石蜡中。
48.权利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
49.权利要求48的多核苷酸,其中所述小分子抑制剂包括表I中的一种或多种。
50.权利要求48的多核苷酸，其中所述小分子抑制剂进一步包括水溶性活性氧清除剂。
51.权利要求50的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
52.权利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制剂包括活性氧清除剂。
53.权利要求52的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
54.—种从固定的组织中回收的多核苷酸a.其中所述多核苷酸链为至少300个碱基对，b.其中所述组织在福尔马林中固定，c.其中在含有水溶性活性氧清除剂的乙醇_水清洗液中清洗所述组织，且d.其中所述固定的组织包埋在石蜡中。
55.权利要求54的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
全文摘要
本申请涉及用于提高福尔马林固定的、任选地石蜡包埋的生物材料的稳定性的方法。在一个实例中，在固定时或之前不久，将DNA酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂与生物材料或福尔马林合并。
文档编号G01N33/48GK102939525SQ201180018483
公开日2013年2月20日 申请日期2011年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者M·霍甘 申请人:金沃特公司