专利名称：使用微珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测的制作方法
技术领域：
描述了用于检测流体样品中分析物分子或颗粒，并在一些情况下用于确定所述流体样品中分子或颗粒的浓度的量度的系统和方法。相关申请本发明是Duffy等人于2010年3月24日提交的美国专利申请序列号12/731，130，名称为“使用微珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”的部分继续申请案，其要求了 Duffy等人于2010年3月I日提交的美国临时专利申请序列号61/309，141，名称为“使用微珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”的权益。上文提到的各申请都通过引用并入本文。
背景技术：
能够快速精确地检测并在特定情况下定量样品中的靶标分析物的方法和系统是现代分析测量法的基石。在许多领域中采用了这些系统和/或方法，如学术和工业研究、环境评估、食品安全、医学诊断及对化学、生物及/或放射性战剂的分析。这些技术的优势特征可包括特异性、快速性及灵敏性。目前大多数用于定量样品中低水平的分析物分子的技术使用了扩增步骤以增加报告子分子的数量以能够提供可量度的信号。例如，这些已知的方法包括在基于抗体的测定中用于增强信号的酶联免疫吸附测定(ELISA)，以及在基于DNA的测定中用于扩增靶标DNA链的多聚酶链式反应(PCR)。一种更灵敏但间接的蛋白质靶向扩增技术(称为免疫PCR)(见 Sano, T. ; Smith, C. L. ; Cantor, C. R. Sciencel992, 258，120-122)利用了寡核苷酸标记物，可在随后对其进行PCR扩增并使用DNA杂交测定进行检测(见Nam, J. M. ; Thaxton, C.S. ;MirkinjC. A. Science 2003;301，1884-1886;NiemeyerjC. Μ. ;Adlerj Μ. ;Pignatarο, B. ; Lenhertj S. ; Gaoj S. ; Chij L. F. ; Fuchs, H. ; Blohmj D. Nucleic Acids Research1999，27，4553-4561; and Zhou, H. ; Fisher, R. J. ; Papas, T. S. Nucleic Acids Research1993，21，6038-6039)。免疫-PCR法虽然使得能够进行超低量蛋白质的检测，但其是复杂的测定方法，且容易产生假阳性信号(见Niemeyer, C. M. ; Adler, M. ;ffacker, R. Trends inBiotechnology 2005,23, 208-216)。用于检测或定量溶液中低浓度的特定分析物的已知典型方法和/或系统的一个特征在于其是基于集合的响应，其中许多分析物分子产生测量的信号。许多检测步骤要求集合中存在大量分子以产生检测阈值以上的累积信号。这项要求限制了大多数检测技术的灵敏度以及动态范围(即，能检测到的浓度范围)。许多的已知方法和技术有非特异性结合的问题，即要检测的分析物分子或颗粒或者报告子类非特异性地结合于预期位点之外的位点。这导致背景信号的增加，因此限制了可精确地或可再现地检测到的最低浓度。因此，有对改进方法的需要，尤其是在这些分子或颗粒以非常低的浓度存在的情况下，用于检测及可选地定量流体样品中分析物分子或颗粒。发明概述本文描述了用于检测流体样品中分析物分子或颗粒，并在一些情况下用于确定所述流体样品中分子或颗粒的浓度的量度的系统和方法，本发明的主题在一些情况下涉及相关产品、对特定问题的备选解决方案和/或一种或多种系统和/或物品的多重或不同的用途。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括使大量各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触，使分析物分子或颗粒固定化于所述的大量捕获物，使得至少一些捕获物与单个分析物分子或颗粒相结合，而统计学显著比例的捕获物不与任何分析物分子或颗粒相结合，将至少一部分经过了固定化步骤的捕获物在空间上划分入大量分隔的位置，指认至少一部分经过了空间划分步骤的所述大量位置并确定含有单个分析物分子或颗粒的所述位置的数量，以及至少部分地基于确定含有分析物分子或颗粒的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法 包括将大量各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物与与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触以形成包含至少一个固定化分析物分子或颗粒的捕获物，将接触步骤中制备的捕获物与大量结合配体相混合以使至少一些捕获物中与单一结合配体相结合，而统计学显著比例的捕获物不与任何结合配体相结合，将至少一部分经过了混合步骤的捕获物在空间上划分入大量分隔的位置，指认至少一部分经过了空间划分步骤的所述大量位置并确定含有结合配体的所述位置的数量，以及至少部分地基于确定含有结合配体的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括提供包含大量位置(其中至少一部分位置含有微珠)的基底，其中存在于基底上的微珠总数中，包含至少一个分析物分子或颗粒的微珠相对不包含分析物分子或颗粒的微珠的比例为大约8:1-大约1:10, 000, 000,指认至少一部分所述大量位置，其中在指认步骤中的所述大量位置中对至少两个是至少部分同时指认的；在各个指认的位置中检测微珠是否存在，如果存在，检测所述微珠是否包含任何分析物分子或颗粒；以及至少部分地通过确定含有包含至少一个分析物分子或颗粒的微珠的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括提供包含大量位置(其中至少一部分位置含有微珠)的基底，其中存在于基底上的微珠总数中，包含至少一个结合于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠相对不包含结合于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠的比例为大约8:1-大约1:10，000，000，指认至少一部分的所述大量位置，其中在指认步骤中的所述大量位置中对至少两个是至少部分同时地指认的；在各个指认的位置检测微珠是否存在，如果存在，检测所述微珠是否包含任何结合于结合配体的分析物分子或颗粒；以及至少部分地通过确定含有包含至少一个结合于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，物品或试剂盒包含平均直径为大约O. I微米-大约100微米的大量微珠，和含有大量反应容器的基底，其中反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 5倍，反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括将大量各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获分子与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触，其中至少一些捕获物变成结合于至少一个分析物分子或颗粒；将接触步骤中制备的大量捕获物与包含酶组分的大量结合配体相混合，使得统计学显著比例的结合至少一个分析物分子或颗粒的捕获物结合至单个结合配体；将至少一部分经过混合步骤的捕获物在空间上划分入大量分隔的位置；至少部分地通过指认至少一部分的经过空间划分步骤的大量位置以确定酶组分或涉及酶组分的反应产物的存在情况而确定流体样品中分析物分子或颗粒浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括将大量分析物分子或颗粒固定化于大量微珠；将至少一部分的所述大量微珠在空间上划分入大量分隔的位置，并指认所述大量位置中的至少一些并确定含有微珠的位置数量；·再进一步确定含有微珠及分析物分子或颗粒的所述位置数量，并至少部分地基于含有微珠以及分析物分子和颗粒的位置数量相对含有微珠的位置数量的比率而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括将大量分析物分子或颗粒固定化于大量微珠；将至少一部分所述大量微珠在空间上划分入大量分隔的位置，以及指认所述大量位置中至少一些并确定含有微珠的位置数量；再进一步确定含有微珠及分析物分子或颗粒的所述位置数量，并至少部分地基于含有微珠以及分析物分子和颗粒的位置数量相对含有微珠但不含任何分析物分子或颗粒的位置数量的比率而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。在一些实施方式中，用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法包括提供大量各自结合于单个分析物分子或颗粒或者不结合任何分析物分子或颗粒的捕获物，单个地指认至少一部分捕获物并确定结合分析物分子或颗粒的所述捕获物数量，并至少部分地基于经过指认步骤确定结合了分析物分子或颗粒的捕获物的数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。附图简述在下文的详述中结合附图考虑时，本发明的其他方面、实施方式和特征会将会清楚。附图为示意性的，并非按比例绘制。为清楚起见，不是每种组分在每张图中都有标记，在本领域技术人员不需要说明就能理解本发明的地方没有必要显示本发明的每个实施方式的每种组分。文中所提到的所有专利申请和专利都以其全文通过引用并入本文。在本说明书中包含的说明与通过引用并入的文献之间有冲突的情况下，以本发明(包括定义)为主。图I为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的步骤(A-D)的一个实施方式；图2为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的步骤(A-D)的一个实施方式；图3为示意性流程图，描述了本发明方法的一部分的一个实施方式；图4A为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的步骤(A-D)的一个实施方式；图4B为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的步骤(A-D)的一个实施方式；图4C为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的一个实施方式；图5为示意性流程图，描述了施行本发明示例性方法的步骤(A-C)的一个实施方式；图6为示意性流程图，描述了通过将基底和密封组分匹配而形成大量反应容器的方法(步骤A-D)的实施方式，并描述了与在基底上的密封组分的尺寸大小(E、F)的实例；图7描述了根据本发明的一个实施方式，用于光检测的实验设置；图8显示了根据一个实施方式由密封组分密封的光纤阵列；图9A显示了示意流程图，描述了根据一些实施方式，间接检测结合于捕获物的分析物分子的方法；图9B显示了示意流程图，描述了根据一些方式，使用结合配体间接检测固定化于捕获物的分析物分子的方法；图IOA和IOB显示了示意流程图，描述了用于根据本发明的一些方法将结合配体交联于分析物分子的步骤的一些实施方式；图IlA和IlB显示了采用根据一些实施方式的本发明的光学检测系统的一些系统的非限制性实例；
图12为示意性方框图，显示了根据本发明的一个实施方式，采用了装配有光学检测系统和光纤装置的系统；图13显示了示意性校准曲线的图，所述曲线可用于根据本发明的一些实施方式确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度；图14显示了根据一个示例性实施方式，对确定结合包含A)PSA，B) TNF-α、或C)DNA的分析物分子的捕获物比例对比流体样品中分析物分子浓度的作图；图15显示了根据一个示例性实施方式，确定结合有分析物分子的捕获物部分的对数对比流体样品中分析物分子浓度的对数的作图；图16显示了根据一个非限制性实施方式，包含微珠的反应容器数对比反应容器中提供的微珠总数的图；图17A-17C显示了包含大量反应容器的阵列中含有的微珠的非限制性图像；图18A显示了含有微珠的阵列的非限制性荧光图像，图18B显示了图18A的放大图像；图19A和19B显示了根据特定实施方式，确定含有分析物分子的反应容器数对比流体样品中分析物分子浓度的图；图19C显示了根据一个示例性实施方式，总的荧光读数对比流体样品中分析物分子浓度的图；图20显示了三次测量中图19B的实验数据的泊松噪音％对实验偏差的作图。图21显示了根据一个示例性实施方式，在两种分析物分子浓度下，确定结合有分析物分子的捕获物比例对比所提供的结合配体浓度的作图；图22显示了根据一个示例性实施方式，在两种分析物分子浓度下，确定结合有分析物分子的捕获物比例对比为每个捕获物所提供的结合配体浓度的作图；图23显示了根据一个示例性实施方式，在两种分析物分子浓度下，确定结合有分析物分子的捕获物比例对比所提供的结合配体浓度的作图；图24显示了根据一个示例性实施方式，总化学发光对比所提供的结合配体浓度的作图；图25A和25B显示了示 意流程图，描述了用于进行本发明的一个方法的步骤的一个实施方式；图25C显示了根据一个示例性实施方式，包含在大量反应容器内的微珠的图像；图2 显了根据一个例性实施方式，包含大量微珠(其中有一些在施行本发明的方法之后结合于分析物分子)的阵列的荧光图像；图26显示了根据一个示例性实施方式，光学密度对比TNF-α浓度的作图；图27显示了对大量人类受试者确定的PSA浓度的作图；图28显示了根据本发明一个实施方式，一个测定法中反应容器的平均荧光强度的直方图；图29Α显示了在第一个波长获取的含有微珠的反应容器阵列的一部分的荧光图像；图29Β是在第一个波长获取的含有微珠的反应容器阵列的一部分的荧光图像，其中微珠与突光实体相结合；图29C是在第二个波长获取的来自图29Β的阵列的一部分的荧光图像；图29D显示了在不同分析物分子浓度下对(i)微珠以及(ii)与荧光实体相结合的微珠的作图；图30A和30B显示了根据一些实施方式的免疫复合物随时间的解离情况的作图；图31显示了根据一些实施方式，每个微珠的平均分析物分子数量对比分析物分子浓度的作图。发明详述本文描述的是可在特定实施方式中用于检测和/或定量样品中的分析物分子、颗粒(如细胞、细胞器和其他生物学或非生物学微粒)等等的系统和方法。本发明的主题内容在一些情况下涉及相关产品、对特定问题的备选解决方案以及/或一种或多种系统和/或物品的大量不同用途。要理解的是，尽管下文的讨论中大部分针对的是分析物分子，但是这仅仅是通过实例的方式，也可检测和/或定量其他材料例如微粒形式的分析物。一些示例性分析物分子和颗粒在本文有所描述。与用于进行类似测定的一般的常规系统和方法相比，在特定情况下，本发明的系统和方法可帮助减少非特异性结合对检测灵敏度的负面效应。非特异性结合是在测定法中一种组分与测定中另一种不希望与其相互作用的组分以非特异性的形式的结合或连接。例如，与其具有结合特异性的分析物分子或颗粒相反，结合配体与基底或测定材料产生了连接、结合或固定化。非特异性结合可导致假阳性信号。非特异性结合可以不仅影响测定量度的精确性，还限制了检测的最低水平。因此，本发明的特定方法和/或系统提供了非特异性结合水平上的改善，这可使得其与一般的常规技术相比能够检测/或定量样品中的分析物分子时有更低的最低检测限水平。此外，本发明的特定方法和/或系统还可使得能够在先前由于这些分析物分子存在浓度很低而未检测到或无法定量的特定样品中检测和/或定量分析物分子。本发明的特定方法可用于鉴定样品中的分析物分子。在一些情况下，这些方法可用于检测和/或定量疑似含有至少一种类型的分析物分子的流体样品中分析物分子，因为如下文详细说明的，本发明的测定法是这样设计的，使得所拾取(interrogate)的包含含有分析物分子的捕获物(例如，提供了捕获表面的微珠、表面，等等)的位置(例如，孔、反应点、表面上的区域等等)的数量(或等同地，比例)，或更一般地为包含分析物分子的总拾取群体的拾取捕获物的数量或比例与流体样品中分析物分子的浓度相关。因此本发明的特定实施方式提供了至少部分基于例如基底上的包含结合分析物分子的捕获物的位置的数量或比例的流体样品中分析物分子浓度的量度。在一些情况中，所述数量/比例可与包含捕获物(例如，具有或不具有相结合的分析物分子或标记试剂)的位置总数和/或与所拾取的位置总数相关。如何使用本发明的实施方式定量流体样品中分析物分子的具体方法和计算在下文有更多的讨论。在特定实施方式中，用于检测和/或定量样品中分析物分子(或颗粒)的方法包括使大量分析物分子固定化于各自包括对至少一种类型的分析物分子(或颗粒)有亲和力的结合表面的大量捕获物。例如，捕获物可包括大量的微珠，其包含大量的捕获组分(例如，对目的分析物分子有特异性亲和力的抗体，等等)。至少一些捕获物(例如，与至少一个分析物分子结合的至少一些捕获物)可在空间上划分/分离入大量位置，这些位置中至少有一些可以被指认/拾取。对流体样品中分析物分子的浓度的量度可基于指认这些位置时获得的信息而确定。在一些情况下，对浓度的量度至少部分地基于确定含有捕获物或与至少一个分析物分子相结合的位置的数量。在其他情况下及/或在不同的条件下，对浓度的量度可至少部分地基于一个或多个所指认的位置处的至少一种表示大量分析物分子和/或与分析物分子相结合的捕获物存在的信号的强度水平。在一些实施方式中，也可确定含有捕获物但不含有分析物分子的位置的数量/比例，且/或也可确定不含有任何捕获物的位置的数量/比例。在这些实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度可至少部分地基于确定含有与分析物分子结合的捕获物的位置数量相对确定含有不与分析物分子结合的捕获物的位置总数的比率，且/或流体样品中分 析物分子浓度的量度可至少部分地基于确定含有与分析物分子结合的捕获物的位置数量相对确定不含有任何捕获物的位置数量的比率。在其他实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度可至少部分地基于确定含有捕获物及分析物分子的位置数量相对所指认和/或分析的位置总数的比率。在一些实施方式中，可将至少一些捕获物(例如，至少一些与至少一个分析物分子结合的捕获物)在空间上划分/分离入大量位置，例如，阵列形式中的大量反应容器。所述大量反应容器可形成于任何合适材料之中、之上和/或以其制造形成，在一些情况下，反应容器可被密封或在基底与密封组分匹配时形成，在下文有详细讨论。在特定实施方式中，尤其是在需要对结合至少一个分析物分子的捕获物进行定量时，对捕获物的分区可以这样进行，使得至少一些(例如，统计学显著比例)的反应容器包含至少一个或在特定情况下只有一个与至少一个分析物分子相结合的捕获物，且至少一些(例如，统计学显著比例)的反应容器包含不与任何分析物分子相结合的捕获物。可在特定实施方式中对与至少一种分析物分子相结合的捕获物进行定量，这样使得能够通过本文详述的技术对流体样品中的分析物分子进行检测和/或定量。图I中示例说明了本发明的测定法的一个示例性实施方式。提供了大量的捕获物2(步骤(八))。在此具体实施方式
中，所述大量捕获物包含大量的微珠。这些微珠与含有大量分析物分子3的流体样品相接触(例如,微珠2与分析物分子3 —同孵育)。将至少一些分析物分子固定化于微珠。在此实施例中，分析物分子是以这样的方式(例如以某个浓度)提供的，使得统计学显著比例的微珠与单个分析物分子结合且统计学显著比例的微珠不结合与任何分析物分子。例如，如步骤(B)中所示，将分析物分子4固定化于微珠5上，由此形成复合物6，而一些微珠7不与任何分析物分子相结合。要理解的是，如本文所描述的，在一些实施方式中，超过一种分析物分子与至少一些微珠相结合。所述大量微珠中至少有一些(例如，与单个分析物分子结合或不结合与任何分析物分子的那些微珠)可以随后在空间上被划分/分离为大量位置。如步骤(C)中所示，所述大量位置示例显示为包含大量孔/反应容器9的基底8。在此实施例中，各反应容器包含零个或一个微珠。然后(例如，光学地或通过其他检测方式)指认至少一些反应容器以确定包含分析物分子的位置数量。例如， 如步骤(D)中所显示的，用光源15对大量反应容器进行光拾取，其中每个反应容器都接触电磁辐射(由箭头10表示)。用检测器15 (在此实施例中，其与光源15装配在相同的系统中)确定从各个反应容器发射的光(由箭头11表示)。基于从反应容器中检测到的光确定含有分析物分子的反应容器(例如，反应容器12)数量。在一些情况下，还确定了含有不结合与任何分析物分子的微珠的反应容器(例如，反应容器13)的数量、不含微珠的孔(例如，反应容器14)的数量和/或所指认的孔的总数。然后可使用这些结果确定流体样品中分析物分子的浓度的量度。统计学显著比例的含有至少一个分析物分子(或不含分析物分子)的捕获物一般可使用具体的检测系统再现性地检测和定量，且一般在背景噪音(例如，非特异性结合)之上，背景噪音是在用不含任何分析物分子的样品进行测定时确定的，除以所指认的捕获物(或位置)的总数。如本文用于本实施方式的“统计学显著比例”可根据公式I进行估算n >(公式 I)其中η为就选定类别的事件中确定的事件数量。即，当事件的数量大于事件数量平方根的三倍时为统计学显著的比例。例如，为确定不结合任何分析物分子或颗粒的捕获物的统计学显著比例，η为所检测到的不结合任何分析物分子或颗粒的捕获物数量。另一个实例中，为确定结合至少一个分析物分子或颗粒的捕获物的统计学显著比例，η为所检测到的确定与分析物分子结合的捕获物数量。在一些实施方式中，统计学显著比例的结合至少一个分析物分子(或在一些情况下为单个分析物分子，其中捕获物对分析物分子的混合比率在统计学上导致只有零个或一个分析物分子结合每个捕获物)捕获物(例如，微珠)相对捕获物(例如，微珠)的总数的比率低于大约1:2、低于大约1:3、低于大约1:4、低于大约2:5、低于大约1:5、低于大约1:10、低于大约1:20、低于大约1:100、低于大约1:200或低于大约1:500。因此，在这些实施方式中，不结合任何分析物分子的捕获物(例如，微珠)相对捕获物(例如，微珠)的总数的比率至少为大约1:100、大约1:50、大约1:20、大约1:10、大约1:5、大约1:4、大约1:3、大约1:2、大约I: I、大约2: I、大约3: I、大约4: I、大约5: I、大约10: I、大约20: I、大约50: I、大约100:1,
在一些实施方式中，结合至少一个分析物分子(或在一些情况下为单个分析物分子，其中捕获物对分析物分子的混合比率在统计学上导致只有零个或一个分析物分子结合于每个捕获物)捕获物(例如，微珠)的百分比为捕获物总数的低于大约50%、低于大约40%、低于大约30%、低于大约20%、低于大约10%、低于大约5%、低于大约2%、低于大约1%、低于大约O. 5%、低于大约O. 01%，等等。在一些实施方式中，不结合分析物分子的捕获物(例如，微珠)占捕获物(例如，微珠)总数的百分比为捕获物总数的至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约98%等等。在一些实施方式中，在空间划分大量捕获物之前可将捕获物与大量对至少一种类型的分析物分子(或颗粒)具有亲和力的结合配体相接触。如本文所使用的，“结合配体”为特异性结合或特异性连接于分析物分子并帮助检测分析物分子的任何分子、颗粒，等等。在其中至少一些捕获物连接超过一个分析物分子(例如，两个、三个、四个、五个或更多分析物分子)的实施方式中，结合配体尤其有用。在一些情况下，结合配体可以这样的方式(例如以某种浓度水平)提供，使得统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的捕获物与至少一个结合配体结合(或在一些情况下为单个结合配体)，且统计学显著比例的捕获物(例如，与至少一个分析物分子结合或不结合与任何分析物分子的捕获物)不结合任何结合配体。统计学显著比例的包含连接于至少一个分析物分子和单个结合配体的捕获物(例如，微珠)的位置大于或等于能够用特定检测系统再现地确定(即，对于多个基本上一致的含有连接于分析物分子和/或结合配体的捕获物的流体样品得到几乎类似的结果)含有连接单个结合配体的捕获物(例如，微珠)的位置的最小数量，其高于背景噪音(例如，非特异性结合)，背景噪音是在用不含任何分析物分子和/或结合配体的样品进行测定时确定的，除以位置的总数。可根据公式I确定统计学显著比例的包含结合至少一个分析物分子及单个结合配体的捕获物的位置。可以以基本上所有捕获物都连接零个或单一分析物分子的方式提供捕获物数量相对分析物分子和/或结合配体的比率，可如本文所描述的方法，使用泊松分布调整计算此比率。在一些实施方式中，连接于至少一个分析物分子及至少一个结合配体的捕获物(例如，微珠)相对捕获物(例如，微珠)的总数的统计学显著的比例低于大约1:2、低于大约1:3、低于大约1:4。低于大约2:5、低于大约1:5、低于大约1:10、低于大约1:20、低于大约1:100、低于大约1:200，或低于大约1:500。在一些情况下，不连接任何结合配体的捕获物(例如，微珠)相对捕获物总数的统计学显著的比例为至少大约1:100、大约1:50、大约1:20、大约1:10、大约1:5、大约1:4、大约1:3、大约1:2、大约I: I、大约2: I、大约3: I、大约4:1、大约5: I、大约10: I、大约20: I、大约50: I、大约100:1，等等。在一些实施方式中，连接于至少一个分析物分子及至少一个结合配体的捕获物(例如，微珠)相对捕获物(例如，微珠)总数的百分比为低于大约50%、低于大约40%、低于大约30%、低于大约20%、低于大约10%、低于大约5%、低于大约2%、低于大约1%、低于大约
O.5%、低于大约O. 01%,或更低。在一些实施方式中，不连接任何结合配体的捕获物(例如，微珠)相对捕获物总数的百分比为至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约98%，或更高。
在图2中示例说明了捕获物连接超过一个分析物分子的实施方式的一个非限制性实例。提供了大量捕获物20(步骤(A))。在此实施例中，所述大量捕获物包含大量微珠。所述大量微珠与含有大量分析物分子21的流体样品相接触(例如，微珠20与分析物分子21一同孵育)。将至少一些的分析物分子固定化于微珠。例如，如步骤(B)中所示，将分析物分子22固定化于微珠24，由此形成复合物26。还示例说明的是包含固定化于三个分析物分子的微珠的复合物30，以及包含固定化于两个分析物分子的微珠的复合物32。此外，在一些情况下，一些微珠可以不连接任何分析物分子(例如，微珠28)。将来自步骤(B)的大量微珠与大量结合配体31接触。如步骤(C)中所示，将配体与固定化于微珠的一些分析物分子连接。例如，复合物40包含微珠34、分析物分子36和结合配体38。结合配体是以这样的方式提供的，以使统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的微珠与至少一个结合配体(例如，一个、两个、三个，等等)连接，且统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的微珠(即，如上文公式I所得)不与任何结合配体连接。然后将来自步骤(C)的大量微珠中的至少一部分在空间上划分到大量位置。如步骤(D)中所示，在此实例中，这些位置包含位于基底42上的大量反应容器41。所述大量反应容器可与来自步骤(C)的大量微珠接触，使得各个反应容器包含零个或一个微珠。然后可对基底进行分析以确定包含结合配体的反应容器(例如，反应容器43)数量，其中数量可以与流体样品中分析物分子的浓度的量度相关。在·量、不包含微珠的反应容器(例如，反应容器45)的数量、和/或所指认/分析的反应容器总数。然后可用这些结果确定流体样品中分析物分子的浓度的量度。前述示例性方法可使用本发明不同实施方式的大量不同测定方式、不同反应条件和/或检测系统而进行，下文描述了这些方式的几个实施例。在本发明的范围内可使用另外的组分和/或方法步骤作为本文描述的示例性方法及组分的替代，及/或与其组合使用。应当理解的是，本文特定的讨论聚焦于基底中包含大量孔/反应容器的大量位置，然而这决不是限制性的，而且其他材料可用于将捕获物/分子空间划分入大量空间上不同的位置(例如，水合胶中/上的区域，平面基底表面上的点/区域，等等)。再如，尽管本文的大量讨论都聚焦于包含大量微珠的大量捕获物，然而这决不是限制性的，在其他实施方式中捕获物可以采取其他物理形式(例如，纳米管、盘片、环、微流滴，等等)。示例性测定形式本发明的测定法可根据非常广泛的多种基本操作流程和形式进行。所选择的特定形式可基于分析物分子的性质、含有分析物分子的流体样品的性质以及分析物的连接伴侣的可及性和特性以及其他因素。前文中在对图1-2进行讨论的上下文中对几个示例性基本形式有所讨论。本公开提供的教义的益处会使本领域技术人员明白，本发明可备选地根据未在发明详述中阐述的具体的、示例性实施方式中的具体描述的操作流程/形式而进行，但这些操作流程/形式在实践时不需要不当负担或试验。如上文所描述的，一种示例性的基础测定形式/操作流程包括使大量构造为捕获分析物分子或颗粒的捕获物(例如，微珠)与含有或疑似含有这些分析物分子(或颗粒)的样品相接触。这些分析物分子中至少有一些会固定化于捕获物之。所述大量捕获物可各自包括对至少一种类型的分析物分子具有亲和力的结合表面。然后将至少一部分的捕获物在空间上分隔入大量的位置(例如，反应容器/孔)。至少部分地基于对包含含有至少一个分析物分子的捕获物的位置数量的确定，可确定对分析物分子浓度的量度。现在将讨论此基础测定形式的多个其他方面，包括大量有关材料、浓度、溶液、步骤等方面的考虑因素。在特定实施方式中，将大量捕获物与含有或疑似含有至少一种类型的分析物分子的样品相接触，其中所述大量捕获物包含对所述至少一种类型的分析物分子具有亲和力的结合表面。在一些情况下，结合表面可包含大量捕获组分。如本文所使用的，“捕获组分”为任何置于固体支持物上的分子、其他化学/生物学实体或固体支持物修饰物，其能够用于特异性附着、结合或捕获靶标分子或颗粒(例如，分析物分子)，而使得靶标分子/颗粒固定化于捕获组分和支持物。如本文所描述的，固定化可由分析物分子与捕获物表面上的捕获组分的连接引起。如本文所使用的，“固定化的”指的是捕获、附着、结合或粘贴以防止靶标分子/颗粒的解离或丢失，但不要求绝对地固定化于捕获分子或捕获物。固定化于捕获物的分析物分子的数量可取决于样品中分析物分子总数相对所提供的捕获物的捕获组分的总数、大小和/或表面密度中至少一项的比率。在一些实施方式中，固定化于单个捕获物的分子或颗粒的数量可以遵循标准泊松分布。在一些情况下， 统计学显著数量的捕获物连接于单个分析物分子而统计学显著数量的捕获物不连接于分析物分子。所提供的捕获物总数可为大约10，000-大约10，000, 000、大约50，000-大约5，000, 000、或大约100，000-大约1，000, 000。在一些情况下，所提供的捕获物总数为至少大约10，000、至少大约50，000、至少大约100，000、至少大约1，000，000、至少大约5，000, 000、或至少大约10，000, 000。在一些情况下，流体样品中分析物的数量相对所提供的捕获物的比率为大约10:1-大约1:10，000，000、大约8:1-大约1:10，000，000、大约10:1-大约2:1、大约2:1-大约1:10、或低于大约1:10(例如，大约1:20、大约1:30等等)。流体样品中分析物的数量相对所提供的捕获物的比率可影响为确定流体样品中分析物分子浓度的量度而进行的测定步骤和/或分析，如本文的定量一节中描述的。在一些情况下，几乎所有样品中所提供的分析物分子会固定化于捕获物。S卩，样品中超过大约90%、超过大约95%、超过大约97%、超过大约98%或超过大约99%的分析物分子会固定化于捕获物。然而在一些情况下，样品中只有一部分分析物分子会固定化于捕获物。即，在一些情况下，样品中所提供的大约1%_大约90%、大约10%-大约90%、大约20%-大约80%或大约30%-大约70%的分析物分子固定化于捕获物分子。在一些实施方式中，至少大约10%、大约20%、大约30%、大约40%、大约50%、大约60%、大约70%、大约80%或大约90%、或大约95%的分析物分子固定化于捕获物分子。在测定的一些形式中，固定化后可将大量捕获物(例如，至少一些连接于至少一个分析物分子的捕获物)与大量结合配体接触。至少一些固定化于捕获物的分析物分子可连接于结合配体。(例如，通过分析物分子)连接捕获物的结合配体数可取决于固定化于单个捕获物的分析物分子总数相对接触捕获物的结合配体总数的比率。例如，在基本上所有捕获物都连接零个或一个分析物分子的实施方式中，可选择条件以使基本上所有分析物分子都连接单个结合配体，这样每个连接于单个分析物分子的捕获物会(例如通过分析物分子)与单个结合配体连接。因此，含有单个分析物分子的位置(如反应容器)的数量可通过确定包含结合配体的位置(例如，反应容器)的数量而确定。在这些实施方式(例如，其中零个或至少一个分析物分子与各捕获物连接)中，(例如在混合步骤中)所提供的结合配体与固定化于捕获物的分析物分子总数的比率可为大约20: I、大约10: I、大约5: I、大约2:1或大约1:1。然而，在一些实施方式中，单个捕获物可以连接于零个、一个或超过一个(例如，两个、三个、四个，等等)分析物分子。在这些实施方式中，所提供的结合配体的浓度可使得统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的捕获物只与单个结合配体连接，且统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的捕获物不与任何结合配体连接。然而，在其他实施方式中，所提供的结合配体的浓度可使得统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的捕获物与至少一个(例如，两个、三个、四个，等等)结合配体连接，且统计学显著比例的包含至少一个分析物分子的捕获物不与任何结合配体连接。然后可确定流体样品中分析物分子的浓度，可使用至少部分基于含有与结合配体连接的捕获物的位置数量的分析(例如，通过将流体样品中分析物分子浓度与包含结合配体的位置数量相关)，还/或可使用至少部分基于指示了所指认位置处结合配体数量的信号的读取强度的分析(例如，如本文所描述的，在其中至少一些捕获物包含超过一个分析物分子和/或超过一个结合配体的实施方式中的情况)。在这些实施方式中(例如，其中超过一个分析物分子可固定化于各个捕获物)，溶液中所提供的结合配体数量相对固定化于捕获物的分析物分子数量的比率可以为大约1:50、大约1:40、大约1:30、大约1:20、大约1:10、大约1:5、大约1:3、大约1:2、大约1: 1，等等。在一些情况下，溶液中提供的结合配体数量的比率可基于所提供的捕获物数量而计算。在一 些情况下，所提供的结合配体相对于捕获物数量的比率为大约1:50、大约1:40、大约1:30、大约1:20、大约1:10、大约1:5、大约1:3、大约1:2、大约1:1，等等。在其他情况下，捕获物数量相对所提供的捕获物数量的比率为大约1:50、大约1:40、大约1:30、大约1:20、大约1:10、大约1:5、大约1:3、大约1:2，等等。在一些实施方式中，如本文所描述的，定量确定可包含泊松分布调整。在一些实施方式中，可选择测定中所使用的结合配体浓度以最小化结合配体过量存在时发生的特定事件，例如，结合配体的非特异性连接。在一些情况下，如果结合配体的浓度太高，可以会由于非特异性相互作用(例如，与捕获物、反应容器等相互作用)产生背景读数增加。在一些情况下，可选择结合配体浓度(在分析物分子浓度未知的情况下为估计)以使仅仅一部分固定化于捕获物的分析物分子与结合配体连接(例如，大约O. 1%、大约1%、大约2%、大约3%、大约4%、大约5%、大约10%、大约20%、大约30%、大约40%、大约50%或更高)。这在其中连接于至少一个分析物分子的捕获物的百分比相对高的实施方式中尤其有用(例如，超过大约20%、超过大约30%、超过大约40%、超过大约50%、超过大约60%、超过大约70%、超过大约80%、超过大约90%，或更多)。在一些情况下，通过提供较低浓度的结合配体，使得并非每个固定化于捕获物的分析物分子都与结合配体连接，这对于定量是有利的，例如，当检测需要结合配体的存在时，尤其是当使用数字/ 二进制读取技术时。例如，如果连接于分析物分子的捕获物的百分比为大约50%或更高，可提供数量减少的结合配体，这样不会所有的固定化的分析物分子都连接于结合配体。在其他情况下，可通过降低与分析物分子一同孵育的时间而减少连接于分析物分子的结合配体百分比，例如，限制接触的时间以使只有一部分的固定化的分析物分子与分析物分子连接。溶液中分析物分子/结合配体/捕获物/等等的总数可通过使用已知的溶液中分析物分子/结合配体/捕获物/等等的浓度进行计算而确定。例如，溶液中结合配体的总数可根据公式2进行确定
#结合配体的数量=NaX [结合配体]X体积(公式2)其中Na为阿伏伽德罗数(6. 022xl023mor1)，[结合配体]为溶液中结合配体的浓度(摩尔/升)，体积为所使用的溶液总体积(升)。可对其他组分(例如(如校准样品中的)分析物分子、捕获物等等)进行类似的计算。在大量分析物分子固定化于大量捕获物后，且在一些情况下结合配体连接至至少一些所述的固定化分析物分子，至少一部分的捕获物可在空间上划分入大量位置。空间上划分入大量位置的捕获物的百分比会随着大量因素影响而变动，包括但不限于捕获物数量相对位置总数的比率、空间划分捕获物的方法，和/或捕获物接触这些位置的时间长度。在一些情况下，至少大约O. 5%、至少大约1%、至少大约2%、至少大约5%、至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约 80%、至少超过90%或更多的捕获物在空间上划分入大量位置。在一些情况下，大约O. 1%-大约50%、大约O. 1%-大约30%,大约O. 5%-大约20%,大约O. 5%-大约10%,大约O. 5%-大约5%,大约1%-大约10%、或大约O. 5%、大约1%、大约2%、大约4%、大约5%、大约10%、大约20%、大约30%、大约50%、大约70%或大约90%的捕获物在空间上被划分入大量位置中。在将至少一部分的捕获物划分入大量位置中后，可指认至少一部分的位置。所指认的位置数量可为位置总数的大约O. 5%、大约1%、大约2%、大约3%、大约5%、大约10%、大约20%、大约30%、大约40%、大约50%、大约60%、大约70%、大约80%、大约90%、大约95%或更多。可指认一部分的位置以确定含有分析物分子，或在一些情况下含有结合配体的位置数量。在一些情况下，也可确定含有不连接于分析物分子(或结合配体)的捕获物的位置数量、含有及/或不含有捕获物的位置数量，及/或所分析/确定的位置总数。可至少部分基于确定含有分析物分子(或结合配体)的位置数量而确定流体样品中分析物分子的浓度的量度。在一些情况下，可至少部分地基于含有连接于分析物分子的捕获物的位置数量相对所指认的位置总数或所指认的含有捕获物的位置总数的比率而确定流体样品中分析物分子的浓度的量度。在其他情况下，可至少部分地基于含有连接于分析物分子的捕获物的位置数量相对含有不连接于分析物分子的捕获物的位置数量的比率而确定流体样品中分析物分子的浓度的量度。可用于确定流体样品中分析物分子的浓度的量度的具体方法和计算在下文有详细讨论。本文描述的有关第一种组分对第二种组分(例如，分析物分子/捕获物、结合配体/捕获物、结合配体/分析物分子、捕获物/位置、前体标记试剂/结合配体，等等)的数量/量/比率的比率、百分比和其他参数可根据需要而调整，以产生想要的每个捕获物所捕获的分析物分子/结合配体比率，且/或可在本说明书提供的教义和指导下使用常规试验方法、计算(在一些情况下，包括采用泊松分布)、筛选测试等等进行控制或确定。例如，已知如果所提供的捕获物数量(如，使用等式I中类似的公式确定)，可根据所需要的捕获物相对结合配体的比率确定需要提供的结合配体数量，由此可确定应当提供的结合配体的摩尔数。另一个例子是，在未知分析物分子浓度的情况下，如果第一种测定法显示有显著数量的捕获物包含超过一个分析物分子(例如，所有或显著数量的位置确定为含有分析物分子或少于统计学显著数量的微珠确定为不连接于分析物分子)，则可将流体样品稀释且/或可增加捕获物数量以使包含至少一个分析物分子的捕获物的数量可以降低。现在将详细讨论测定的其他方面。应当理解的是，在本文描述的特定示例性测定形式中，以下步骤中的一部分或全部步骤可至少进行一次。可进行但未描述的其他步骤的非限制性实例包括但不限于，洗涤和/或接触另外的结合配体、前体标记试剂和/或标记试
齐Li，等等。在一些实施方式中，可在空间上将大量捕获物中的至少一些划分入大量位置之前、同时和/或之后，将大量捕获物(例如，其中至少有一些与至少一个分析物分子连接)与至少一种其他的反应组分相接触。在一些情况下，捕获物可接触大量结合配体。在特定实施方式中，可将结合配体调整为直接进行检测(例如，结合配体包含可检测的分子或部分)或可调整为间接检测(例如，包括能将前体标记试剂转化为标记试剂的组分)，下文进行更详细的讨论。在任何测定法中，都可采用超过一种类型的连接方式，例如，第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体。在一个实例中，第一种类型的结合配体能够与第一种类 型的分析物分子连接，而第二种类型的结合配体能够与第一种类型的分析物分子连接。在另一个实例中，第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体都可与单个分析物分子的相同或不同表位连接，在下文有所描述。特定的结合配体可包含能够直接或间接地帮助检测的组分。在其中组分包含可测量特性(例如，荧光发射、显色，等等)的实施方式中可采用直接检测组分。所述组分可通过例如将前体标记试剂转化为标记试剂(例如，在测定中进行检测的试剂)而帮助直接检测。“前体标记试剂”为任何可在接触合适的转化试剂(例如，酶组分)时被转化为标记试剂的分子、颗粒等等。“标记试剂”为任何在使用选定的检测技术时作为检测实体而帮助检测的分子、颗粒等等。在一些实施方式中，至少有一个结合配体包含酶组分。在一些实施方式中，分析物分子可包含酶组分。酶组分可将前体标记试剂(例如，酶底物)转化为标记试剂(例如，可检测产物)。然后至少部分地基于确定含有标记试剂的位置数量而确定流体样品中分析物分子浓度的量度(例如，通过将含有标记试剂的位置数量与含有分析物分子的位置数量相关)。酶或酶组分的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。用于检测的系统或方法的其他非限制性实例包括其中核酸前体被复制成多个拷贝或转化为能容易检测的核酸的实施方式，如聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接、环介导等温扩增(LAMP)等。这些系统和方法对本领域一般技术人员已知，例如在“DNAAmpIifixation:Current Technologies and Applications, , Vadim Demidov等人，2004 中有描述。如图3所示的包括使用前体标记试剂的测定法的一个实例中，所提供的基底100包含大量位置，其中位置包含反应容器。在反应容器101 (例如，位置)中，分析物分子102固定化于微珠103 (例如，捕获物)。结合配体104与分析物分子102连接。结合配体包含酶组分(未显示)。前体标记试剂106 (在接触酶组分时)转换为标记试剂108。使用本文描述的方法检测标记试剂108。相反,反应容器111含有固定化于微珠110的分析物分子112。在这个反应容器中，分析物分子112不与包含酶组分的结合配体连接。因此，在反应容器中，前体标记试剂114不会转化为标记试剂。因此，与其中前体标记试剂转化为标记试剂的反应容器101相比，这个反应容器会给出不同的信号。在一些情况下，还可以有含有不连接于分析物分子的微珠的反应容器，例如，反应容器121含有微珠116。另外，反应容器中的一些可以不包含任何微珠，例如，反应容器123。与反应容器101相比，反应容器121和123可以给出不同信号，因为其中可以不存在标记试剂。然而，反应容器121和123可以含有前体标记试剂117。在任何给定的反应容器中都可以存在超过一种前体标记试剂。在特定实施方式中，可采用溶解的或重悬的前体标记试剂，其中前体标记试剂转化为不可溶于液体和/或在此位置中/附近(例如，在标记试剂形成的反应容器中)固定化的标记试剂。这些前体标记试剂和标记试剂及其用途描述于Duffy等人提交于2008年9月23日的共有美国专利申请序列号12/236，484,题名为“High Sensitivity Determinationof the Concentration of Analyte molecules in a Fluid Sample, ”,其通过弓I用并入本文。在一些实施方式中，在测定过程中至少会进行一次洗涤步骤。在一个例子中，可在捕获物接触一种或多种包含分析物分子、结合配体、前体标记试剂等的溶液之后洗涤大量捕获物。例如，在分析物分子固定化于大量捕获物后，大量捕获物可经历洗涤步骤，由此移除任何非特异性固定化于捕获物的分析物分子。在特定实施方式中，选择洗涤溶液使得其 不引起捕获物分子和/或分析物分子的构象的显著变化并/或不破坏测定中至少两种组分(如，捕获组分和分析物分子)之间的特异性连接相互作用。在其他情况下，可选择化学上于一种或多种测定组分相互作用的洗涤溶液。如本领域一般技术人员所理解的，洗涤步骤可在本发明的方法中的任何合适时间点进行。在一些实施方式中，所实施的测定法不包括使用包含用于至少一种类型的分析物分子的结合表面的大量捕获物和/或这些捕获物空间划分入其中的大量位置。例如，在特定实施方式中根据本发明的测定可使用任何适当的方法，其能够分离单个分析物分子和/或连接一个或多个分析物分子的捕获物，使得它们能够被单独指认用于检测。例如，测定法可以包括提供大量捕获物，其各自连接于单个分析物分子或不连接任何分析物分子。至少一部分的捕获物可进行单独指认以确定连接于分析物分子或颗粒的捕获物数量。至少部分地基于确定连接于分析物分子的捕获物的数量，可确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。图4A示例说明了一个非限制性实施方式，其中单个分析物分子被空间划分入大量液滴中。在图4A中，提供了大量分析物分子70，如步骤(A)所示。在此实施例中，能够对分析物分子70进行光学检测(例如，可使用光拾取直接检测分析物分子)。这些大量分析物分子70中至少有一些是包含在液滴72之内的(例如，使用微流体技术)，液滴72包括流体71，如步骤(B)中所示。另外，可以存在一些不含有任何分析物分子的微滴(例如，包含流体71的微滴74)。大量微滴75基本上由流体73包围，而后者几乎与流体71不相溶。通过将微滴注入柱子74使得每个微滴单列通过光学检测系统(例如，包含光源76和检测器78)的形式而对大量的微滴75进行光拾取，如步骤(C)所示。在光学信号有变化(例如，由于微滴中存在分析物分子引起的光学信号变化)时，可确定微滴各自含有分析物分子。如图4B中示例说明的另一个实施例中，提供了大量分析物分子80，如步骤(A)所示。在此实施例中，分析物分子70不能进行光学检测，必须进行间接检测(如本文所描述的)。将大量分析物分子80与大量结合配体82相接触，使至少一种结合配体连接显著比例的分析物分子，如步骤(B )中所示，形成复合物83，如步骤(B )中所示。在此实施例中，每个结合配体82都包含酶组分84。至少一部分的复合物83可包含在微滴85之内(例如，使用微流体技术)，如步骤(C)中所示，其包含液体79。此外，可以存在不含任何复合物的一些微滴(例如，包含流体79的微滴86)。大量微滴91基本上都由流体87包围，而后者几乎与流体79不相溶。液滴85和86可另外包含前体标记试剂86，其在接触酶组分84时会转化为标记试剂88，如箭头87所示。通过将大量微滴注入柱子89使得每个微滴单列通过光学检测系统(例如，包含光源90和检测器92)式而对大量的微滴91进行光拾取，如步骤(D)所不。在光学信号有变化(例如，由于微滴中存在标记试剂引起的光学信号变化)时，可确定微滴各自含有分析物分子。作为另一个实例，图4C示例说明了一个实施方式，其中单个分析物分子282通过捕获组分274与目标280连接。此外，在此实例中，固定化的分析物分子连接于结合配体284。通过将微滴注入柱子287使得每个微滴单列通过光学检测系统(例如，包含光源286和检测器288)而对这些微滴进行光拾取。 在光学信号有变化(例如，由于微滴中存在结合配体引起的光学信号变化)时，可确定微滴各自含有结合配体。以下章节提供了和可用于实践上文描述的测定法的方法步骤、材料和参数有关的其他息。捕获物和用于捕获物分隔的空间位置在一些实施方式中，本发明的方法和系统采用了大量捕获物，其各自包括对至少一种类型的分析物分子具有亲和力的结合表面。所述大量捕获物可构造为能够在空间上彼此分隔，即，捕获物可以这样的形式提供，使得捕获物能够在空间上划分入大量位置。例如，大量捕获物可包含大量微珠(可以为任何形状，例如，球状、盘状、环状、立方体状等等)、微粒的分散液或悬液(例如，在液体中重悬的大量颗粒)、纳米管，等等。在一些实施方式中，大量捕获物在测定使用的溶剂或溶液中不可溶或几乎不可溶。在一些情况下，捕获物为固态或几乎是固态的(例如，基本上没有孔)，然而，在一些情况下，大量的捕获物可以为多孔的或基本上多孔的、空心或部分空心的，等等。大量的捕获物可以为非吸收性的、基本上吸收性的或吸收性的。在一些情况下，所述大量捕获物可包含磁性材料，其在本文有所描述，可以有助于测定的特定方面(例如，洗涤步骤)。在一些情况下，捕获物表面还可以包含保护性或钝化层，这些能够减少或最小化非特异性连接事件(例如，分析物分子、结合配体等等)。在一些实施方式中，捕获物各自包括对至少一种类型的目的分析物分子具有亲和力的结合表面。可根据捕获物的物理形状/特征或特性(例如，大小，形状)和测定的形式来选择或构造包含结合表面的部分捕获物。在一些实施方式中，基本上所有的捕获物的外表面都形成结合表面。可通过将大量捕获组分与捕获物连接而形成对至少一种类型的分析物分子具有亲和力的结合表面。在一些情况下，分析物分子可通过形成至少一种化学键及/或通过物理吸附或二者的组合而连接(例如，固定化于)捕获组分。化学键的类型的非限制性实例包括离子键、共价键(例如，碳-碳、碳-氧、氧-硅、硫-硫、磷-氮、碳-氮、金属-氧或其他共价键)、氢键(例如，在羟基，胺基，羧基，巯基，和/或类似的功能基团之间)、配位键(例如，金属离子和单配位键或多配位键配体之间形成的复合或螯合)、范德华相互作用，等等。用于或可能用于实践本发明特定方面和实施方式的捕获组分在下文有更详细的讨论。至少一些分析物分子在接触包含大量捕获组分的大量捕获物时会固定化于捕获组分。在特定实施方式中，基本上所测试的流体中所有的大量分析物分子会固定化于捕获组分(并由此固定化于捕获物)。不希望受任何理论的约束，相比于其中分析物自身被分隔开进行检测而不需接触并固定化于捕获物的测定，本发明特定实施方式中捕获步骤的使用有助于增加检测和定量样品中分析物浓度的速度和/或效率，其中具有大的结合表面的大量捕获物接触含有分析物或颗粒的流体样品，使得分析物分子/颗粒固定化于捕获物。如果搅拌(例如，搅动)所述溶液(大量分析物分子和捕获物在其中孵育以进行捕获)以增加大量捕获物(例如，微珠)和分析物分子的碰撞频率和传质速率(例如，在与包含静态表面的基底(例如，微量滴定板)对撞时)，所述结合速率和效率上的增加可得到进一步增强。用于分析物捕获的大量捕获物可以为任何合适的大小或形状。合适的形状的非限制性实例包括球体、立方体、椭圆体、管状、层状等等。在特定实施方式中，捕获物的平均直径(如果基本上是球体)或平均最大横截面尺寸(对于其他形状)可超过大约O. Ium(微米)、超过大约lum、超过大约10um、超过大约lOOum、超过大约Imm等等。在其他实施方式中,捕获物平均直径或捕获物的最大尺寸在一维方向上可以为大约O. Ium-大约lOOum，大约Ium-大约IOOum,大约IOum-大约IOOum,大约O. Ium-大约Imm,大约Ium-大约IOmm,大约O. Ium-大约10um，等等。如本文所使用的，大量捕获物的“平均直径”或“平均最大横截面尺寸”是捕获物的直径/最大横截面尺寸的算术平均值。本领域一般技术人员能够确定捕获物群体的 平均直径/最大横截面尺寸，例如，使用激光光散射，显微镜检查，筛分析或其他已知技术。例如，在一些情况下，可使用库尔特计数器以确定大量微珠的平均直径。用于分析物捕获的捕获物可由一种或多种适当的材料进行制作，例如，塑料或合成的多聚物(例如，聚乙烯、聚丙烯，聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、酚醛聚合物或硝酸纤维素等)、天然衍生多聚物(胶乳橡胶、多糖、多肽等)、复合材料、陶瓷、硅或硅基材料、碳、金属或金属化合物(例如，包括金、银、钢、铝、铜等)、无机玻璃、硅土、以及各种各样的其他合适的材料。可能合适的构造的非限制性实例包括微珠(例如磁珠)、管(例如，纳米管)、板、盘片、试纸，或诸如此类。在一些情况下，可选择捕获物以使捕获物自身能够被系统检测。这一点可用于其中要确定连接一个分析物分子的捕获物比例或百分比的实施方式中(例如，当所拾取和检测的捕获物总数被用于确定连接于分析物分子的捕获物的比例时)。例如，捕获物的特征在于其具有的发射或吸收光谱，可以用于检测，以便捕获物可被拾取而确定哪个空间位置包含捕获物。可以这样选择发射光谱的性质(例如，(多个)波长、强度等)，使得捕获物所产生的发射光不会显著改变和/或干扰在测定中使用的组分的任何其他发射光(例如，任何用于确定分析物分子存在或不存在的标签的发射光)。在一些情况下，可使用存在于捕获物表面上的结合配体，将染料分子与捕获物连接(例如，染料分子可通过键或相互作用与捕获组分连接)。在一些情况下，有大约I-大约50，000、或大约1000-大约50. 000、或大约1000-大约20. 000、或大约10，000-大约20，000、或大约1，000-大约10，000、或大约10，000-大约30，000、或大约I-大约10，000个染料分子(例如，荧光染料分子)与每个捕获物连接。见例如，实施例21。在一些情况下，在结合配体附着于捕获物之前，染料分子可以首先与捕获物连接。这种方法减少了染料分子附着降低结合配体亲和力的几率。在一些情况下，染料分子附着于惰性的“封闭”蛋白质(例如，牛血清白蛋白)，在结合配体附着于捕获物后，将染料标记的惰性蛋白质用于封闭微珠。应当理解的是，在一些情况下，可使用白光检测和定量捕获物(如本文所描述的，例如使用明场，暗场和/或相差成像)。在一些实施方式中，对于分析物捕获可使用超过一种类型的捕获物。在一些情况下，每种类型的捕获物可包括具有不同结合特异性的表面。在这些实施方式中，在单次的复合测定法中可以定量和/或检测超过一种类型的分析物分子。例如，用于分析物捕获的大量捕获物可包括大量的第一种类型的捕获物(包含对第一种类型的分析物分子的亲和力的结合表面)以及大量的第二种类型的捕获物(包含对第二种类型的分析物分子的亲和力的结合表面)。在接触含有第一种类型的分析物分子及第二种类型的分析物分子的样品时，第一种类型的分析物分子会固定化于第一种类型的捕获物而第二种类型的分析物分子会固定化于第二种类型的捕获物。可以通过包括差异化的检测特性编码第一种类型的捕获物和第二种类型的捕获物以在彼此间进行区分(例如，有助于检测时的分化)。例如，每种类型的捕获物可具有差异化的荧光发射、光谱反射率、形状、光谱吸收或FTIR发射或吸收。在一个具体的实施方式中，每种类型的捕获物可包含一种或多种染料化合物(例如，荧光染料)，但是其为不同的浓度水平，这样每种类型的捕获物就具有可区分的信号(例如，基于荧光发射的强度)。在捕获步骤后将捕获物空间划分入大量位置用于检测时，可通过差异化特性的检测将包含连接第一种类型分析物分子的第一种类型的捕获物的位置可与包含连接第二种类型分析物分子的第二种类型的捕获物的位置相区分。可以确定包含每种类型的捕获物的 位置数量和/或连接于分析物分子的捕获物数量，使得能够至少部分地基于这些数量而确定流体样品中第一种类型的分析物分子和第二种类型的分析物分子的浓度的量度。例如，如图5中所示例说明的，步骤(A)大量的第一种类型的捕获物132 (包含第一种类型的捕获组分134)和大量的第二种类型的捕获物136 (包含第二种类型的捕获组分138)。将所述大量捕获物与包含大量第一种类型分析物分子140和第二种类型分析物分子142的流体样品相接触。如步骤(B)中所示，至少一些第一种类型的分析物分子140可通过捕获组分134连接于第一种类型捕获物132，而至少一些第二种类型的分析物分子142可通过捕获组分138连接于第二种类型捕获物136。有一些第一种类型的捕获物和第二种类型捕获物可以不连接任何第一种类型或第二种类型的分析物分子。来自步骤(B)的大量捕获物中至少有一些空间划分入大量位置(由基底146中形成的反应容器142表示，如步骤(C)中所示)。一些反应容器可以不包含任何捕获物。然后，可分析所述大量的反应容器(例如，如图I的步骤(D)中所阐述)以确定含有连接第一种类型的分析物分子的第一种类型的捕获物的反应容器数量(例如，反应容器144)和含有连接第二种类型的分析物分子的第二种类型的捕获物的反应容器数量(例如，反应容器145)。此外，还可确定含有不连接任何分析物分子的第一种类型的捕获物或第二种类型捕获物的位置数量。可至少部分地基于所检测的第一种类型(或第二种类型)的分析物分子的数量而确定对第一种类型(或第二种类型)的分析物分子的浓度的度量。备选地，流体样品中第一种类型(或第二种类型)的分析物分子的浓度的度量可基于包含连接第一种类型(或第二种类型)的分析物分子的第一种类型(或第二种类型)的捕获物的反应容器数量相对包含不连接任何分析物分子的第一种类型(或第二种类型)的捕获物的反应容器数量的比率。另外的用于确定流体样品中第一种类型和/或第二种类型的分析物分子的浓度的方法可使用类似于本文描述的方法而进行，用于包含单一类型的分析物分子的样品。使用光学检测时，第一种类型的捕获物可以在第一个波长处具有最大发射波长而第二种类型的捕获物可以在第二个波长处具有最大发射波长，因此使得含有第一种类型捕获物的反应容器可与含有第二种类型捕获物的反应容器相区分。
备选地或组合地，如上文所描述的，在一些复用的测定中使用编码的捕获物用于复用，可使用类似的捕获物类型，其在特定情况下可以各自包括特异于多种类型分析物的捕获组分。在特定的这些测定中，第一种类型的结合配体(如，对第一种分析物分子类型具有亲和力)和第二、第三等等类型的结合配体(分别对第二、第三等等类型的分析物分子具有亲和力并被构造为能可检测地相互区分(如通过使用差异化的检测标记物、酶组分和/或标记试剂，等等))可与测定法相结合而使用，而对不同类型结合配体的检测/定量可与流体样品中不同类型分析物分子的存在情况/浓度相关联。在一个特定的实施方式中，用于分析物捕获的大量捕获物包 含大量微珠。这些微珠可以各自包含大量捕获组分，大量分析物分子可通过这些组分固定化。所述大量捕获物组分可存在于微珠表面。在一些实施方式中，微珠可以为磁珠。微珠的磁学特性可以帮助将微珠从溶液中(例如，包含大量未连接的分析物分子)和/或在(例如，移除多余流体样品、标记试剂等等的)洗涤步骤中分离。潜在的合适的微珠(包括磁珠)可获自大量供应商。如上所述，有很多其他用于分析物捕获的潜在的合适捕获物的实例，包括纳米管(如碳纳米管)、微流体微滴(如，基本上由第二种液体包围的第一种液体的微滴)，等等。本领域一般技术人员会知晓用于将大量捕获物与含有或疑似含有分析物分子的流体样品相接触用于初步分析物捕获的方法和技术。例如，可直接向流体样品中加入大量捕获物(例如，以固体形式、以溶液形式)。作为另一个例子，可向(如溶液形式，固体形式的)大量捕获物加入流体样品。在一些例子中，可对溶液进行搅拌(例如，搅动、摇动，等等)。在分析物分子固定化于大量捕获物之后，捕获物可经历至少一次洗涤步骤。洗涤步骤可帮助从溶液中移除任何未连接的分子(例如，分析物分子或其他反应组分)。例如，参考图1，在分析物分子4固定化于微珠6之后，如步骤(B)所示，可进行洗涤步骤以移除未固定化于分析物分子的任何未结合的分析物分子。作为另一个实例，参考图2，在将配体31与分析物36连接后，如步骤(C)所示，可进行洗涤步骤以移除任何未结合的结合配体。洗涤步骤可使用本领域一般技术人员已知的任何合适的技术而进行，例如，通过将捕获物与洗涤溶液一同孵育，随后对包含捕获物的溶液进行离心，弃去液体，或通过使用过滤技术。在其中大量捕获物包含大量磁珠的实施方式中，可在磁铁的作用下将微珠从总溶液中分离。可在将大量捕获物空间划分入大量位置用于检测之前，将捕获步骤后的大量捕获物(例如，至少有一些连接于至少一个分析物分子)与一种或多种另外的反应剂相接触。例如，如前所述，捕获物可接触大量结合配体，其中至少有一些连接于固定化的分析物分子。如上所述，这些捕获物可接触超过一种类型的结合配体(例如，第一种类型的结合配体和第二、第三等等类型的结合配体)。结合配体与固定化的分析物分子的连接有助于对分析物分子的检测，如本文所描述的。在一些实施方式中，除了用于分析物捕获的大量捕获物之外，还可提供和/或采用大量对照物。对照物可用于多种目的，包括但不限于，(例如在大量位置以反应点阵列、反应容器等等形式形成的情况下)鉴别大量位置的方向以帮助确定测定的质量，且/或帮助校准检测系统(例如，光拾取系统)，如下文所描述的。应当理解的是，在任何测定形式中可存在超过一种类型的对照物(例如，第一种类型的对照物以确定测定的质量而第二种类型的对照物作为位置标记物)，或单一类型的对照物可具有超过一种的上述功能。在一些情况下，对照物是用于识别阵列上大量位置(例如，反应容器、位点等等)的方向(例如，作为阵列的位置标记物)。例如，对照物可在阵列上随机或特异分布，并可提供一个或多个参考位置用于确定阵列的方向/位置。这一特征可以在比较多个不同时间间隔的阵列的部分图像时有作用。也就是，阵列中对照物的位置可用于登记这些图像。在一些情况下，在其中组合大量小的重叠区域的图像形成较大图像的实施方式中，对照物可用于提供参考位置。在测定中的对照物的存在情况可提供关于测定质量的信息。例如，如果发现一个位置含有包含酶组分的对照物而不存在标记试剂时(例如，在包含酶组分的对照物接触前体标记试剂时会出现其产物)，这表示测定的一些方面可以没有正常运行。例如，反应剂的质量可以有损害(例如，前体标记试剂浓度太低、前体标记试剂降解，等等)，且/或可以不是全部的位置都接触到了前体标记试剂。在一些实施方式中，对照物可用于校准检测系统。例如，对照物可输出光学信号，以用于校准光学检测系统。在一些实施方式中，可定性对照物并检验其具体的特征(例如，荧光、颜色、光吸收等等)，这些特征可作为检测系统性能的质量控制检查。 在一些情况下，对照物可用于标准化或归一化系统，以考虑到不同系统组分(例如，检测系统、阵列、反应剂等等)在不同测定中、在一段时间内等等，在测试中所使用的阵列不同部分之间和/或两个不同阵列之间在性能和/或特征上的变动的影响。例如，实验设置、参数和/或变化可导致在不同时间点产生自单个阵列、或在同时或不同时间点在至少两个阵列之间的信号(例如，荧光信号)强度的变化。此外，在单个阵列中，阵列的不同部分可以产生不同的背景信号。这些变化可导致阵列之间、阵列的不同部分之间或多个时间处的校准信号(例如，对平均微珠信号的确定)的变化，这可导致一些情况下产生不准确的结果。可引起变化的非限制性实例包括标记试剂浓度、温度、聚焦、检测光强度、阵列中位置的深度和/或尺寸，等等。考虑到这些变动中的一些或全部的效应，在一些实施方式中，可使用大量对照物。在特定的例子中，这些对照物基本上不连接于分析物分子或颗粒。在特定实施方式中，低于大约20%、大约10%、大约5%、大约1%等等的对照物连接于分析物分子或颗粒。对照物可与捕获物相区分(例如，其可分别产生可区分的信号)，且系统可配置为任何连接对照物的分析物分子不计在对分析物分子的浓度确定之内。来自对照物的信号可用于将不同阵列之间或单个阵列不同区域之间的拾取值进行归一化。例如，因为来自对照物的信号应当在阵列之间和/或对于单个阵列为近似相等的，所以对照物信号可归一化至一个恰当的值，而非对照物(例如，连接于分析物分子的捕获物)的信号也作相应的调整。在接触含有分析物分子的流体样品之前，可与用于分析物捕获的大量捕获物一起提供对照物，或可在测定中的另一个时间点加入对照物(例如，在接触大量分析物分子和/或结合配体之后，和/或在将大量捕获物空间划分入大量位置之前)。可使用本领域一般技术人员已知的技术将对照物和捕获物相区分。例如，在一些实施方式中，对照物相比于含有对分析物分子的结合表面的捕获物可包含独特的属性(例如，有编码)。例如，与捕获物相t匕，对照物可具有不同的荧光发射、光谱反射率、形状、光谱吸收或者FTIR发射或吸收。测定中的对照物对物质(例如，捕获物和对照物)总数的百分比为大约O. 0001%、大约O. 0005%、大约O. 001%、大约O. 005%、大约O. 01%、大约O. 05%、大约O. 1%、大约O. 5%、大约1%、大约5%,
坐坐寸寸ο在一些实施方式中，将对照物配置为阴性结合对照，可以与用于固定化分析物分子的捕获物有类似的形状和尺寸，然而，对照物可以缺少用于分析物分子的结合表面(例如，大量捕获组分)。例如，对照物可包含大量微珠，而用于固定化分析物分子的捕获物可以包含相同或类似的微珠，并另外包含至少一种包含大量捕获组分的表面。在一个实施方式中，对照物可包含阳性对照并包括酶组分。前体标记试剂可在接触酶组分时转化为标记试剂。在一些情况下，酶组分可与用于检测流体样品中分析物分子的酶组分(例如，包含在测定的另一种组分中，例如，包含在结合配体、分析物分子中的酶组分，等等)相同。在这些实施方式中，对照物可与捕获物相区分，这样可以分析具有阳性信号的反应容器以确定所述反应容器是否包含对照物(例如，具有第一种可检测信号)或捕获物(例如，具有可区分于第一种可检测信号的第二种可检测信号)。在其他情况下，酶组分可以与用于检测流体样品中分析物分子的酶组分(例如，包含在测定的另一种组分中，例如，包含在结合配体、分析物分子中的酶组分，等等)不同。在此实施方式中，对照物可以可区分于捕获物，也可以不可区分于捕获物。可向反应容器中提供第一种类型和第二种类型的前体标记试剂，且第一种类型的前体标记试剂可在接触连接于对照微珠的酶组分时转化为第一种类型的标记试剂，而第二种类型的前体标记试剂可在接触连接于另一种酶组分(例如，包含在结合配体/分析物分子/等等之内)时转化为第二种类型的标记试剂。含有第一种类 型的标记试剂的反应容器对应含有对照物的反应容器而含有第二种类型的标记试剂的反应容器对应含有结合配体/分析物分子/等等的反应容器。可观察含有对照微珠的大量位置以分析例如酶转化反应的效率。多种方法可用于制备对照物，例如，本发明描述的与用于捕获物(例如包含大量捕获组分的微珠)的类似方法。在一些情况下，一些对照物可包含酶组分。对照物可以这样的方式制备，使得I)大多数对照物各自包含至少一种(例如，一种、两种、三种、四种，等等)酶组分或2) —些对照物包含单一的酶组分，而其余的对照物不包含任何酶组分。在第一种情况下，对照物的形成过程中，溶液中提供的酶组分相对对照物的比率超过I: I、超过大约2:1、超过大约5:1、超过大约10:1等等。在这些情况下，可以预期，在将对照物在基底上分区之后，每个包含对照物的位置会在接触到前体标记试剂时给出阳性信号。在第二种情况下，对照物的形成过程中，溶液中提供的酶组分相对对照物的比率低于1:5、低于大约1:10、低于大约1:20、低于大约1:50等等。在这些情况下，可以预期，包含对照物并给出阳性信号的位置数量相对包含对照物而不给出阳性信号的位置数量的比率近似地类似于对照物形成过程中酶组分相对对照物的比率，且/或可遵循泊松分布。如上文所描述的，在分析物捕获步骤中大量分析物分子固定化于大量捕获物之后，可将至少一部分的捕获物空间划分入例如在基底上的大量位置。例如，进行空间划分的捕获物部分中的各捕获物可定位于且/或连接在一个位置(例如，在基底表面和/或体内的点、区域、孔等等)中，这些位置在空间上与其他各捕获物所定位的位置相区分，这样捕获物和位置都可通过用于指认这些位置的分析检测系统单个地进行解析。作为一个实例，捕获物的一部分中每个都可空间划分入基底上的反应容器阵列，这样在统计学上只有零个或一个捕获物定位在至少一些反应容器中，在特定情况下，在几乎每个反应容器中。每个位置相对于其他位置可单独地被指认。此外，这些位置的排列方式可以使得大量位置基本上同时被指认，如本文所描述的，而同时仍然保留解析单个位置和捕获物的能力。应当理解的是，尽管本文多数讨论都聚焦于含有单个捕获物的位置，然而这决不是限制性的，在一些实施方式中，在单一位置可以含有超过一个捕获物。在这些实施方式中，捕获物对分析物分子的比率可为使得大量捕获物空间划分入大量位置之后，统计学显著比例的位置不含分析物分子，且统计学显著比例的位置含有至少一个分析物分子。也就是说，尽管单个位置可以含有大量捕获物，然而在一些情况下，这些捕获物都不连接任何分析物分子，而且所指认的位置中只有单一的捕获物连接于至少一个分析物分子。如上所述，在一些实施方式中，大量位置包含基底上的大量反应容器/孔。在特定实施方式中，反应容器可配置为只接收并含有单个用于分析物捕获的捕获物。在一些情况下，所述大量捕获物可通过大量这种(例如，配置为基底上的反应容器阵列的)反应容器而分区，这有助于通过在下文和实施例中有进一步详细讨论的方法对流体样品中分析物分子浓度的度量的确定。在本发明的一些实施方式中，可在例如弓I入用于分析物捕获的捕获物之后密封所述大量反应容器，例如通过将第二种基底和密封组分进行匹配。反应容器的密封可以使得各个反应容器的内容物不能在余下的测定中脱离反应容器。在一些情况下，可在在加入捕获物(可选地，加入前体标记试剂)以帮助检测分析物分子后密封反应容器。对于采用了前体标记试剂的实施方式，通过将内容物密封在一些或每个反应容器中，产生可检测的标记试剂的反应能在密封的反应容器中进行，由此产生可检测量的标记试剂，其留存在反应容器中用于检测的目的。包含大量反应容器的大量位置可使用多种方法和/或材料形成。在一些情况下，所述大量反应容器以小窝的阵列形式形成于第一个表面上。然而，在其他情况下，大量反应容器可通过将包含大量小窝的密封组分与基底相匹配而形成，这些基底可以具有平滑表面 或其包括的小窝与密封组分上的那些相并列。这些设备组分，例如基底或密封组分中的任何一项都可由顺应材料制造，如弹性聚合物材料，以帮助密封。这些表面可以是(或被制造成)疏水的或含有疏水区域，以使水溶液样品从微孔中发生最少的渗漏。在一些情况下，密封组分可以能够接触到微孔阵列的外部表面(例如，如下文更详细描述的光纤束包层)，这样各个反应容器都被密封或分离，使得各个反应容器的内容物不能脱离反应容器。根据一个实施方式，密封组分可以为硅胶弹性体垫，其可以在对整个基底施加基本上一致的压力时被置于微孔阵列上。在一些情况下，可在加入用于分析物捕获的大量捕获物以及可选地加入能用于帮助检测分析物分子的任何前体标记试剂分子之后密封反应容器。图6中描绘了基底上/中的含有测定溶液的大量反应容器的形成。图6，板块(A)显示了包含大量微孔139的表面，其已经接触了测定溶液141 (例如，在进行分析物捕获步骤和任何洗涤步骤后的含有用于分析物捕获的捕获物和/或对照物的溶液)，以及密封组分143。此实施例中的密封组分143包含基本上平的底表面。将基底139和密封组分143匹配形成了大量的密封反应容器145。可修饰反应容器148之间的区域以助于在反应容器之间形成紧密的密封。图6板块(B)中显不了第二个实施方式，其中密封组分162包含大量微孔163,其与基本上平的表面158相匹配，后者已经接触了测定溶液162，由此形成了大量的反应容器164。在第三个实施方式中，如图6板块(C)所75,基底表面166包含大量微孔167,其与密封组分170匹配，后者也含有大量微孔171。在此实施方式中，基底中的微孔和密封组分中的微孔基本上是并列的，这样所形成的每个反应容器172都包含来自密封组分的微孔的一部分以及来自基底的微孔的一部分。在图6板块(D)中，微孔不是并列的，这样每个反应容器包含来自密封组分173的微孔，或来自基底175的微孔。密封组分可以与基底是基本上相同的尺寸，或可以为不同尺寸。在一些情况下，密封组分与基底是近似相同的尺寸，并与整个基底表面基本上匹配。在其他情况下，如图6板块(E)中阐明的，密封组分176比基底174小，且密封组分只与基底的178部分进行匹配。在另一个实施方式中，如图6板块(F)中阐明的，密封组分182比基底180大，且只有密封组分的184部分与基底180进行匹配。在一些实施方式中，反应容器可全部具有近似相同的体积。在其他实施方式中，反应容器可具有不同的体积。可对每个单个的反应容器的体积进行选择，使之适合于帮助任何特定的测定操作流程。例如，在一组实施方式中，其中需要限制每个管道中用于分析物捕获的捕获物数量为小的数目，反应容器的体积可以为从阿升到更小至纳升或更大的范围，这取决于捕获物的本质、检测技术和所采用的设备、基底上的孔的数量和密度以及加到含 有孔的基底上的液体中捕获物的预期浓度。在一个实施方式中，可选择反应容器的尺寸以使只有单一的用于分析物捕获的捕获物能完全包含在反应容器之内。根据本发明的一个实施方式，反应容器可具有的体积为大约I飞升-大约I皮升、大约I飞升-大约100飞升、大约10阿升-大约100皮升、大约I皮升-大约100皮升、大约I飞升-大约I皮升、或大约30飞升-大约60飞升。在一些情况下，反应容器的体积低于大约I皮升、低于大约500飞升、低于大约100飞升、低于大约50飞升、或低于大约I飞升。在一些情况下，反应容器的体积为大约10飞升、大约20飞升、大约30飞升、大约40飞升、大约50飞升、大约60飞升、大约70飞升、大约80飞升、大约90飞升、或大约100飞升。在其中大量用于分析物捕获的捕获物包含大量微珠且大量位置包含了大量具有几乎为圆柱体的形状的反应容器的实施方式中，反应容器的尺寸可基于微珠的尺寸，并可被设计为确保含有超过一个单一的微珠的孔的数量得到最小化。在一些情况下，所允许的最大孔径可根据公式3计算 2*微珠半径+W (3*微珠半径2-孔深*+ 2·孔深*微珠半径)(公式3)且/或所允许的最大孔深可根据公式4计算半径+/ (4*微珠半径*孔直径2-孔直径2)^ (公式4)确保单个微珠可包含在孔内的最小许可孔深和最小许可孔径在大多数实施方式中不会小于微珠的平均直径。具有合适尺寸(允许不超过一个单一微珠存在于反应容器中)的反应容器具有更好的解析单个微珠的能力，使得使用下文和实施例中有更详细描述的方式确定流体样品中分析物分子浓度的度量上有更高的精确度。例如，如果反应容器太大，超过一个微珠可以填进反应容器，这导致含有多个分析物分子的反应容器数量增加，而可以对使用基于单一分子检测(见下文)的算术/统计模型确定的浓度引入不精确性。然而，在一些情况下，可以需要超过一个微珠填入反应容器。在另一方面，如果反应容器太小，微珠可以不能填入反应容器，这样阻止了反应容器的适当密封(例如，在反应容器被密封的实施方式中)且/或可以导致难以指认个体位置(例如，在其中产生标记试剂以检测的实施方式中，标记试剂可以扩散出其产生的反应容器)。在这些情况下，可以有假阳性(例如，不含有分析物分子的反应容器可以基于扩散出其产生位置的标记试剂而确定为含有分析物分子)，这可导致对流体样品中分析物分子浓度测量的确定不准确。在一些实施方式中，反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约I. O-大约I. 7倍、大约I. O倍-大约I. 5倍、大约I. O倍-大约I. 3倍、或大约I. I倍-大约I. 4倍。在一些实施方式中，反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍、大约I. 2倍-大约I. 7倍、大约I. O倍-大约I. 5倍、或大约I. 3倍-大约I. 6倍。在一个具体实施方式
中，反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 5倍，而反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍。测定中所采用的位置的总数和/或位置的密度(例如，阵列中反应容器的数量/密度)可取决于阵列的组成和用途。例如，所采用的反应容器数可取决于所采用的捕获物数、测定的估计浓度范围、检测方法、捕获物尺寸、检测实体的类型(例如，溶液中的游离标记是 设计、沉淀标记试剂，等等)。可通过使用多种技术和材料制造含有大约20-数十亿的反应容器(或总数的反应容器)的阵列。在阵列中增加反应容器数量可用于增加测定的动态范围，或允许多种样品或多种类型的分析物分子进行平行测定。对于每个要分析的样品阵列可包含一千到一百万个反应容器。在一些情况下，阵列包含超过一百万个反应容器。在一些实施方式中，阵列包含大约1,000-大约50，000、大约1,000-大约1，000，000、大约1,000-大约 10，000、大约 10，000-大约 100，000、大约 100，000-大约 I, 000，000、大约 100，000-大约500，000、大约 I, 000-大约 100，000、大约 50，000-大约 100，000、大约 20，000-大约 80，000、大约30，000-大约70，000、大约40，000-大约60，000等个反应容器。在一些实施方式中，阵列包含大约10，000、大约20，000、大约50，000、大约100，000、大约150，000、大约200，000、大约300，000、大约500，000、大约1，000, 000、或更多的反应容器。可将反应容器的阵列排列在基本上平面的表面或排列为非平面的三维排列。反应容器可以规则形式列阵或随机分布。在一个具体的实施方式中，阵列为基本上平面的表面上的规则形式的位点，允许这些位点在X-Y坐标平面中被指认。在一些实施方式中，反应容器形成于固体材料中。如本领域技术人员所清楚的，反应容器能在其中形成的潜在的合适的材料数量十分庞大，包括但不限于，玻璃(包括改性和/或功能玻璃)、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、环烯烃共聚物(C0C)、环烯烃聚合物(C0P)、特氟隆⑩、多糖、尼龙或硝酸纤维素等)、弹性体(如聚(二甲基硅氧烷)和聚氨基甲酸乙酯)、复合材料、陶瓷、硅或娃基材料(包括娃和改性娃)、碳、金属、光纤束。一般地，可选择的基底材料可进行光学检测，而不产生显著的自发荧光。在特定实施方式中，反应容器可形成于柔性材料中。可使用多种本领域已知的技术形成表面(例如，基底或密封组分)上的反应容器，包括但不限于，光刻法、冲压技术、塑型技术、蚀刻技术，诸如此类。如本领域一般技术人员清楚的，所使用的技术可取决于支持材料的组成、形状以及反应容器的尺寸和数量。在一个具体实施方式
中，是通过在光纤束一端产生微孔并使用平面的顺应表面作为密封组分而形成反应容器阵列。在特定的这些实施方式中，光纤束一端的反应容器阵列可按如下方法形成。首先，将微孔阵列蚀刻入抛光光纤束一端。用于形成及蚀刻光纤束的技术和材料对本领域一般技术人员已知。例如,光纤直径、纤芯和光纤的包层区域的存在情况、尺寸和组成，以及蚀刻的深度和特异性可根据所选择的蚀刻技术有变化，以便形成所需要的体积的微孔。在特定实施方式中，蚀刻过程通过优先蚀刻光纤束中单个玻璃纤维的材料核心而产生微孔，这样每个孔都近似并列排在单个纤维上并与临近的孔通过包层材料分离开。光纤阵列形式的潜在优势为其可产生成千上万的反应容器而不需要复杂的微细加工步骤，且其能提供同时观察并光学指认多个反应容器的能力。每个微孔可并列排在光纤束中的一个光纤上，这样光纤束能将激发光(发射光)带入和出孔，能够远程拾取孔的内容物。进一步地，光纤阵列可提供同时或非同时激发临近管道中分子的能力，不产生纤维之间的信号“串音”。也就是，从一个纤维中传播的激发光不会脱离至相邻纤维中。备选地，大量反应容器的等价结构可使用不用光纤束末端作为基底的其他方法和材料制作。例如，阵列可以为用本领域已知技术产生的点迹的、印刻或光刻制造的基底；见例如 WO 95/25116 ;W095/35505;PCT US 98/09163;美国专利号 5，700，637、5，807，522、5，445，934,6, 406，845和6，482，593。在一些情况下，阵列可以使用塑型，压花加工，和/或蚀刻技术制造，这些是本领域一般技术人员已知的。 在特定实施方式中，本发明提供了装备有机械平台的系统以将密封组分加至基底上。此平台可位于系统的一个位置的下方。在所选的反应组分已经加入反应容器阵列后，可将密封组分与阵列进行匹配。例如，可通过机械平台施加的一致的压力将密封组分夹心于平坦表面(如显微镜玻片)和反应容器阵列之间。图7中阐述了一个非限制性实施方式。密封组分300位于机械平台302顶部。测定溶液304位于密封组分300的顶部。将机械平台向上朝阵列306 (例如，光纤阵列)移动，这样施加一致的压力。如图8所示，密封组分300与阵列306形成紧密的密封。在其他例子中，可对密封组分施加不同的压力以使密封组分和阵列之间形成紧密的密封。如本文更多讨论的，所述系统还可以包含另外的组分312，其可用于分析阵列(例如，显微镜、计算机，
寸寸7 ο可是用本领域一般技术人员已知的广泛多种技术中任意，将用于分析物捕获的大量捕获物划分入大量反应容器。在一些情况下，大量反应容器可接触含有大量捕获物的溶液。在一些情况下，可对溶液和/或捕获物施加力的作用，由此帮助捕获物在空间上与液相分离和/或捕获物在管道中的沉积。例如，在含有反应容器的基底中加入含有捕获物的测定溶液后，可对基底和溶液进行离心以帮助捕获物沉积到反应容器中。在其中捕获物(例如，微珠)为磁性的实施方式中，可使用磁铁以帮助将捕获物包含到反应容器内。在一些情况下，当大量的反应容器形成于光纤束(或另外的平面表面)末端时，可将一种材料(例如，管子)放置在包含大量反应容器的阵列表面边缘的周围，以形成容器，将溶液维持在相应位置，而捕获物沉淀于反应容器中或被放置于反应容器中(例如，在离心时)。在将捕获物置于至少一些反应容器后，可移除周围的材料，并可洗涤和/或擦拭阵列的表面以移除多余的溶液/捕获物。在一些实施方式中，基底不包括形成大量反应容器的孔或反应容器，而是使用/提供了其他方法以对用于分析物捕获的大量捕获物进行空间划分。在一些情况下，可采用压花的基本上平面的表面，其中压花区域形成大量位置。在一些情况下，压花区域可包含基本上亲水的表面，其基本上由基本疏水的表面所包围。大量捕获物(例如，微珠)可基本上由基本亲水的基质包围(例如，包含有水)，而这些微珠可接触压花表面使得微珠连接于压花区域(例如，位置)，由此将大量微珠进行了空间划分。例如，在一个这样的实施方式中，基底可以为(或包括)凝胶或其他能够提供足以阻碍质传的材料(例如，对流和/或扩散屏障)以防止在指认位置并完成测定所需的时间框之内用于分析物捕获的捕获物和/或前体标记试剂和/或标记试剂从材料上(中)的一个位置移动到另一个位置并引起含有不同捕获物的空间位置之间的干扰或串音。例如，在一个实施方式中，通过将捕获物分散在水合胶材料上和/或之中以对大量捕获物进行空间划分。在一些情况下，前体标记试剂可以已经存在于水合胶中，因此有助于形成局部浓度的标记试剂(例如，在接触携带有酶组分的结合配体或分析物分子时)。如另一个实施方式，捕获物可限定在一个或多个毛细管中。在一些情况下，大量捕获物可吸收或定位于多孔或多纤的基底上，例如，滤纸。在一些实施方式中，捕获物可空间划分于一致的表面上(例如，平面的表面)，且可使用会转化成基本上不可溶或沉淀的标记试剂(其会定位于对应的捕获物定位处，或在其附近)的前体标记试剂检测捕获物。这些基本上不可溶或沉淀的标记试剂的用途在本文中有描述。物品和试剂盒 在本发明的一些实施方式中，提供了用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的度量的物品或试剂盒。所述物品和试剂盒可包括大量微珠以及包含大量反应容器的基底。反应容器的构造可以接收并包含捕获物。在特定实施方式中的大量微珠的平均直径为大约O. I微米-大约100微米，反应容器的尺寸可选择为使得只有零个或一个微珠能够包含在单个反应容器内。在一些情况下，反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约1.0倍-大约I. 5倍，且反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍。在特定实施方式中，微珠的平均直径为大约I微米-大约10微米、大约I微米-大约5微米或本文描述的任何尺寸范围。所提供的大量微珠可以具有多种特性和参数，如本文所描述的。例如，微珠可以为磁性的。所述大量微珠可包含对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面(例如，大量捕获组分)。如本文所描述的，所述大量反应容器可在任何合适的基底中形成。在一个具体实施方式
中，所述大量反应容器形成于光纤束的末端。所述光纤束可根据本领域一般技术人员已知的方法和/或根据本发明的方法而制备(例如蚀刻)。在其他实施方式中，所述大量反应容器形成于平板或类似的基本上平面的材料中(例如，使用印刻或其他已知技术)。示例性的合适的材料在本文有描述。所述大量反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约I. O-大约I. 5倍、或大约
I.I-大约I. 3倍，或本文描述的任何范围。所述大量反应容器的平均直径可为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍、或大约I. 3倍-大约I. 8倍，或本文描述的任何范围。所述大量反应容器的平均深度/或平均直径可选择为使得不超过一个微珠能够包含在一个反应容器内。用于计算帮助单个微珠装入的最大深度和最大直径的方法在本文有所描述。所述大量反应容器的平均体积可以为大约10阿升-大约100皮升、大约I飞升-大约I皮升、或任何所需的范围。基底可以包含任何数量的反应容器，例如，大约1，000-大约1，000, 000个反应容器、大约10，000-大约100，000个反应容器、或大约100，000-大约300，000个反应容器，或任何其他所需要的范围。
所述物品和试剂盒可包含任何数量的其他组分，其中有些在本文有详细描述。在一些情况下，所述物品或试剂盒可进一步包含构造为密封大量反应容器的密封组分。在特定实施方式中，如图7A-7F所示，所述大量反应容器可在至少密封组分的一部分和第二种基底的一部分进行匹配时形成，其在本文有更详细的讨论。如另一个例子，试剂盒还可提供用于施行如本文所描述的测定法的溶液。所述溶液的非限制性实例包括含有一种或多种类型的结合配体剂前体标记试剂的溶液。在一些情况下，所述物品或试剂盒可包含至少一种类型的对照微珠。在一些实施方式中，试剂盒可选地可包括指导所述大量微珠和大量反应容器(以及任何其他所提供的组分)的使用的说明书。也就是，试剂盒可包括对微珠和反应容器的用途的描述，例如，与一个系统配套使用以确定流体样品中分析物分子(或颗粒)浓度的量度。如本文所使用的，“说明书”可限定说明和/或介绍的组分，一般涉及本发明包装上或与之伴随的书面说明书。说明书还可包括任何口头或电子说明书，其提供形式能以任何使试剂盒的用户能清楚地认识到说明书与所述试剂盒的相关性。此外，如本文所描述的，取决于具体的应用，所述试剂盒可包括其他组分。如本文所描述的，“推广的”包括本发明相关的所有商业手段，包括教育手段、医院和其他临床说明、科学探究，药物发现或开发，学术研 究，制药行业的活动，包括药品销售，以及任何广告或者其他宣传活动，包括书面，口头和任何形式的电子交流。捕获组分在本发明的一些实施方式中，捕获物表面可提供对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面。在一些实施方式中，结合表面可包括至少一种类型的捕获组分。一般地，捕获组分使得分子、颗粒或复合物附着于固体支持物上(即，捕获物的表面)以对所述分子、颗粒或复合物进行固定化、检测、定量和/或其他分析。在一些情况下本发明使用的捕获组分是用于将分析物分子固定化于捕获物(例如，微珠)。如本领域技术人员清楚的，捕获物组分的组成可取决于分析物分子的组成。用于多种靶标分子的捕获组分是已知的，或可以使用已知技术容易地发现或开发。例如，当靶标分子是蛋白质时，捕获组分可包含蛋白质，尤其是抗体或其片段(例如，抗原连接片段(Fab)、Fab’片段、胃蛋白酶片段、F (ab’)2片段、全长的多克隆或单克隆抗体、抗体样片段等)、其他蛋白质如受体蛋白质、蛋白质A、蛋白质C等或小分子。在一些情况下，蛋白质的捕获组分包含肽。例如，当靶标分子为酶时，合适的捕获组分可包括酶底物和/或酶抑制齐U。在一些情况下，当靶标分析物为磷酸化的物类时，捕获组分可包含磷酸结合试剂。例如，磷酸结合试剂可包含金属离子亲和基质，如在美国专利号7，070, 921和美国专利申请号20060121544中的那些。此外，当靶标分子为单链核酸时，捕获组分可以为互补的合适。类似地，靶标分子可以为核酸结合蛋白质，且捕获组分可以为单链或双链核酸；备选地，当靶标分子为单链或双链核酸时，捕获组分可以为核酸连接蛋白质。备选地，如在美国专利5，270，163,5, 475，096,5, 567，588,5, 595，877,5, 637，459,5, 683，867,5, 705，337 及相关专利中有总体描述的，可开发核酸“适体”以捕获几乎所有靶标分子。还例如，当靶标分子为碳水化合物时，潜在的合适的捕获组分包括例如抗体、凝集素和选择素。如本领域一般技术人员所清楚的，任何能特异连接于目的靶标分子的分子可以被用作捕获组分。对特定实施方式，合适的靶标分析物分子/捕获组分对可包括但不限于，抗体/抗原、受体/配体、蛋白质/核酸、核酸/核酸、酶/底物和/或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或选择素、蛋白质/蛋白质、蛋白质/小分子、小分子/小分子等。根据一个实施方式，捕获组分为已知能多聚化的细胞表面受体的一部分(尤其是细胞外部分)，如生长激素受体，葡萄糖转运体(特别是GLUT4受体)和T-细胞受体，而靶标分析物分子为一个或多个受体靶向的配体。在一个具实施方式中，捕获组分可通过连接附着于捕获物表面，这可包含任何帮助捕获组分附着于表面的部分、结合表面和/或捕获组分的功能化作用或改性。捕获组分和表面之间的连接可包含一种或多种化学或物理键(例如，通过范德华力的非特异性附着，氢键，静电相互作用，疏水/亲水相互作用，等等)和/或提供这些键的化学连接子。在特定实施方式中，捕获组分包含捕获扩展组分。在这些实施方式中，捕获组分包含连接于分析物分子的第一个部分及可用于附着于结合表面的第二个部分。在特定实施方式中，捕获物表面还可包含保护性或钝化层，其能够减少或最小化测定中非捕获组分(例如，分析物分子、结合配体)对结合表面的非特异性附着，后者可引起检测中的假阳性信号或导致信号丢失。可用在特定实施方式中以形成钝化层的材料的实例包括但不限于排斥蛋白质非特异性结合的天然存在的聚合物，如聚(乙二醇)；具有此种特性的天然发生蛋白质，如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性剂，如两性离子表面活性剂，如磺基甜菜碱，天然存在的长链脂质；以及核酸，如鲑精DNA。将捕获组分附着于捕获物表面的方法取决于所采用的连接的类型，并可以通过多种本领域一般技术人员已知的合适的偶联化学/技术而完成。所选择的附着的具体方式将取决于捕获物表面的材料特征及捕获组分的性质。在特定实施方式中，可通过使用二者上的反应性功能基团将捕获组分附着于捕获物表面。根据一个实施方式，功能基团为化学官能团。也就是，结合表面可进行衍生化，使得结合表面存在官能团，能够与捕获组分上官能团反应并形成附着。用于附着的官能团的实例包括但不限于，氨基，羧基，环氧基，马来酰亚胺基团氧代基和硫醇基。可直接地或通过使用连接子而附加官能团，其组合有时在本文中称为“交联剂”。交联剂在本领域已知；例如已知同或异双功能交联剂(例如，见1994PierceChemical Company catalog, technical section on crosslinkers, pages 155-200、或 “Bioconjugate Techniques，，by Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996)。交联剂的非限制性实例包括烷基基团(包括被取代的烷基基团和含有杂原子部分的烷基基团)、酯、酰胺、胺、环氧基和乙烯二醇和衍生物。交联剂还可以包括砜基，其形成磺酰胺。根据一个实施方式，官能团为光激活的官能团。即，所述官能团可由光激活而将捕获组分附着于捕获物表面。一个实例为PhotoLink 技术,可获自SurModics, Inc. in EdenPrairie, MN。在一些情况下，捕获物可包含链霉亲和素包被的表面，且捕获组分可以生物素化。捕获组分接触到链霉亲和素包被表面时，由于生物素组分和链霉亲和素之间的相互作用，可产生捕获组分与表面的连接。在特定实施方式中，不需要共价修饰捕获物的结合表面即可影响捕获组分对结合表面的附着。例如，可使用具有与捕获组分发生反应的官能团以及对结合表面具有连接亲和力的基团的连接子也附着官能团将附着功能物添加至结合表面。在特定实施方式中，连接子包含能够结合或粘附于结合表面的蛋白质；例如，在一个这样的实施方式中，连接子为血清白蛋白，其表面有游离的氨基基团。然后可加入第二种连接子(交联剂)以将白蛋白的氨基基团附着于捕获组分(例如，附着于羧基基团)。根据其中使用化学交联剂以将捕获组分附着于捕获物的一个实施方式，可使用通过捕获组分将分析物分子捕获于捕获物的结合表面分析物分子，其中捕获组分是以下方式附着于结合表面的。首先，结合表面衍生有官能团，如氨基基团。其次，将交联剂和捕获组分接触结合表面以使交联剂的一端附着于氨基基团而捕获组分附着于交联剂的另一端。以这种方式，可附着包含蛋白质、凝集素、核酸、有机小分子、碳水化合物的捕获组分。一个实施方式使用了蛋白质性质的捕获组分。如本领域已知的，可使用任何数量的技术将蛋白质性质捕获组分附着于多种固态表面。“蛋白质”或“蛋白质性质”在此上下文中包括蛋白质、多肽、肽，包括例如，酶和抗体。已知有多种技术可将反应性部分加至蛋白质，例如，美国专利号5，620，850中概述的。蛋白质对各种表面的附着也是已知的，例如见Heller, Acc. Chem. Res. 23:128(1990)以及许多其他类似的参考文献。
在一些实施方式中，捕获组分(或结合配体)可包含Fab’片段。与完全抗体相反，使用Fab’片段可帮助减少捕获组分和结合配体之间的非特异性连接。在一些情况下，可(例如，蛋白裂解性地)移除捕获组分(或结合配体)的Fe区。在一些情况下，可使用酶移除Fe区域(例如，产生？(&13’)2片段的胃蛋白酶，以及产生Fab片段的木瓜蛋白酶)。在一些例子中，可使用胺将捕获组分附着于结合表面，或可用生物素对其修饰(例如，使用NHS-生物素)以促进对亲和素或链霉亲和素包被的捕获物的结合。在一些情况下，？(&13’)2片段可经过化学还原处理(例如，通过接触2-巯基乙胺)以形成两个具有巯基的Fab’片段。这些具有巯基的片段然后可通过与迈克尔受体如马来酰亚胺反应而附着。例如，然后可以用反应剂(如，马来酰亚胺-生物素)处理Fab’片段以附着至少一个生物素部分(即，生物素化的部分)以帮助对如上文描述的链霉亲和素包被表面的附着。特定实施方式使用核酸作为捕获组分，例如在分析物分子为核酸或核酸结合蛋白质，或当需要捕获组分用作结合蛋白质的适体时，这些在本领域已熟知。根据一个实施方式，捕获物的每个结合表面都包含大量捕获组分。在一些情况下，大量捕获组分可如“草坪” 一样随机分布于结合表面。备选地，捕获组分可被空间划分入不同区域并以任何所需的方式分布。在特定实施方式中，捕获组分和分析物分子之间的结合是特异性的，例如，当捕获组分和分析物分子为结合对的互补部分时。在特定的这种实施方式中，捕获组分与分析物分子的结合既是特异的，也是直接的。通过“特异性结合”或“结合特异性”，指的是捕获组分以足以区分分析物分子和测试样品中其他组分或污染物的特异性结合于分析物分子。例如，根据一个实施方式，捕获组分可以为特异性结合于分析物分子的一些部分的抗体(如抗原)。根据一个实施方式，抗体可以为任何能够特异性结合目的分析物分子的抗体。例如，合适的抗体包括但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、小分子抗体、结构域抗体、合成抗体(有时称为抗体模拟物)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体缀合物(有时也称为“抗体缀合物”)及各自的片段。作为另一个例子，分析物分子可以为抗体而捕获组分可以为抗原。根据一个其中分析物颗粒为生物学细胞(例如，哺乳动物、鸟类、爬虫类、其他脊椎动物、昆虫、酵母、细菌、细胞等)的实施方式，捕获组分可以为对细胞表面抗原具有特异性亲和力的配体(如，细胞表面受体)。在一个实施方式中，捕获组分为粘附分子受体或其部分，其对表达于靶标细胞类型的细胞表面的细胞粘附分子具有连接特异性。在使用时，粘附分子受体结合靶标细胞细胞外表面上的粘附分子，由此固定化或捕获细胞。在其中分析颗粒为细胞的实施方式中，捕获组分为纤连蛋白，其对例如包含神经细胞的分析物颗粒具有特异性。在一些实施方式中，如本领域一般技术人员所清楚的，可以使用其对分析物分子的连接并非高度特异的捕获组分来检测分析物分子。例如，这些系统/方法可使用不同的捕获组分如一组不同的结合配体，且对任何具体分析物分子的检测是通过结合于此组结合配体的“签名”而确定的，这类似于“电子鼻”的工作方式。这尤其可用于检测特定的小分子分析物。在一些实施方式中，分析物分子和捕获组分之间的亲和力应当足以在测定条件下，包括在移除非特异性连接的分子或颗粒的洗涤步骤中都保持连接状态。在一些情况下，例如在检测特定生物分子时，分析物分子对其互补捕获组分的结合常数为至少大约IO4-大约IO6M'至少大约IO5-大约IO9M'至少大约IO7-大约IO9M'超过大约ΚΛΤ1等等。例如，IgG抗体对其抗原的一般亲和力在IO5-IOkT1的范围内。生物素对链霉亲和素的亲和力为IO15M'
在特定实施方式中，所选择的捕获组分能够结合于对应的连接或附着于分析物分子的结合伴侣。例如，根据一个实施方式的捕获组分是如上所述的化学交联剂，能普遍结合蛋白质。根据一个实施方式，流体样品中的每个蛋白质分子都包含附着于这样的化学交联剂的分析物分子。在另一个实施例中，捕获组分包含链霉亲和素，其以高亲和力附着于生物素，这样，其捕获任何生物素附着的分析物分子。备选地，捕获组分可以为生物素，而链霉亲和素可附着或连接于分析物分子以使分析物分子能被生物素捕获。根据一个实施方式，可以下列方式用捕获组分对捕获物的结合表面进行功能化。首先，制备捕获物的表面用于捕获组分的附着，通过对其改性以形成或直接结合捕获组分，或可将连接子加至捕获物的结合表面以使捕获组分经由连接子附着于捕获物的结合表面。在一个实施方式中，捕获物的结合表面衍生出一个如上文所述的化学功能体。其次，可加入捕获组分，其连接或固定化于所述化学功能体。示例性靶标分析物如本领域人员所清楚的，可使用本发明的方法和系统检测(并可选地定量)大量分析物分子和颗粒；基本上，任何能够(例如，通过包含大量捕获组分的结合表面)固定化于捕获物的分析物分子可以使用本发明而研究。可包含分析物分子的特定的可以成为目标的更特异的靶标在下文有提及。下文列出的是示例性非限制性的实例。在一些实施方式中，分析物分子可以为酶。酶的非限制性实例包括，氧化还原酶、转移酶、激酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶及其类似物。其他酶的实例包括但不限于，聚合酶、组织蛋白酶、钙蛋白酶、氨基转移酶如AST和ALT、蛋白酶如半胱天冬酶、核苷酸环化酶、转移酶、脂肪酶、心脏病相关的酶等。当使用本发明的系统/方法来检测是否存在病毒或细菌剂时，适当的靶标酶包括病毒或细菌的聚合酶和其他这类酶，包括病毒或细菌蛋白酶，或诸如此类。在其他实施方式中，分析物分子可包含酶组分。例如，分析物颗粒可以为具有存在于其细胞外表面的酶或酶组分的细胞。备选地，分析物颗粒为表面不具有酶组分的细胞。这样的细胞一般是通过下文描述的间接测定法鉴别的。酶组分的非限制性实例为辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。在其他实施方式中，分析物分子可以为生物分子。生物分子的非限制性实例包括激素、抗体、细胞因子、蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、脂质细胞膜抗原和受体(神经、激素、营养、和细胞表面受体)或其配体，或其组合。蛋白质的非限制性实例包括肽、多肽、蛋白质片段、蛋白质复合物、融合蛋白、重组蛋白、磷酸化蛋白、糖蛋白、脂蛋白或诸如此类。如本领域人员所清楚的，有大量可使用本发明检测或评估其连接伴侣的可以的蛋白化分析物分子。除了上文讨论的酶之外，合适的蛋白质分析物分子包括但不限于，免疫球蛋白、激素、生长因子、细胞因子(其中许多起细胞受体的配体作用)、癌症标记物等。生物分子的非限制性实例包括PSA和TNF- α。在特定实施方式中，分析物分子可以为翻译后修饰的蛋白质(例如，磷酸化、甲基化、糖基化)，且捕获组分可以为特异于翻译后修饰的抗体。修饰的蛋白质可由包含多种特异抗体的捕获组分所捕获，然后，所捕获的蛋白质可进一步连接于包含二级抗体(对翻译后修饰具有特异性)的结合配体。备选地，修饰蛋白质可由包含特异于翻译后修饰的抗体的捕 获组分捕获，然后，所捕获的蛋白质可进一步连接包含特异于每种修饰蛋白质的结合配体。在另一个实施方式中，分析物分子为核酸。核酸可由互补的核酸片段(例如，寡核苷酸)捕获，然后可选地由包含不同互补寡核苷酸的结合配体标记。合适的分析物分子和颗粒包括但不限于小分子(包括有机化合物和无机化合物)、环境污染物(包括农药、杀虫剂、毒素等)、治疗性分子(包括治疗和滥用的药物、抗生素等)、生物分子(包括激素、细胞因子、蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜抗原和受体(神经、激素、营养、和细胞表面受体)或其配体、等)、全细胞(包括原核细胞(如致病细菌)和真核细胞、包括哺乳动物肿瘤细胞)、病毒(包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒等)、孢子等
坐寸ο含有或疑似含有分析物分子的流体样品可来自任何合适的来源。在一些情况下，样品可以包括液体、流体状颗粒状固体、固体颗粒悬液、超临界流体，和/或气体。在一些情况下，可以在确定之前将分析物分子从其来源中分离或纯化；然而，在特定实施方式中，可直接测试含有分析物分子的未处理的样品。分析物分子的来源可以为合成物(如产生于实验室)、环境(如，空气、土壤等)、哺乳动物、动物、植物或其的任意组合。在一个特定的实施方式中，分析物分子的来源是人的身体物质(例如，血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织、器官或诸如此类)。所分析的流体样品的体积可为广泛范围的体积之内的任何量，这取决于大量因素，如，使用的/可用的捕获对象的数量，使用的/可用的位置数量，等等。在一些具体的示例性实施方式中，样品的体积可以为大约O. OIul、大约O. luL、大约luL、大约5uL、大约10uL、大约100uL、大约lmL、大约5mL、大约10mL、或诸如此类。在一些情况下,流体样品的体积为大约O. OluL-大约IOmL,大约O. OluL-大约ImL,大约O. OluL-大约100uL、或大约0. IuL-大约 IOuL0在一些情况下，流体样品可在用于测定前进行稀释。例如，在分析物分子来源为人的体液(如，血液、血清)的实施方式中，可以用适当溶剂(如缓冲液，如PBS缓冲液)稀释流体。在使用前可将流体样品稀释大约I倍、大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约6倍、大约10倍、或更多。可将样品加至包含大量捕获物的溶液，或可将大量捕获物直接(或以溶液形式)加至样品。
结合配体和前体标记试剂/标记试剂结合配体可选自任何合适的分子、颗粒或诸如此类，如下文有更多讨论的，其能够连接于分析物分子和/或连接于另一种结合配体。特定结合配体可包含能够直接(如通过可检测部分)或间接地帮助检测的实体。有的组分可有助于间接检测，例如，通过将前体标记试剂分子转化为标记试剂分子(如在测定中检测的试剂)。在一些实施方式中，结合配体可包含酶组分(如，辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)。如本文所描述的，第一种类型的结合配体可连接或不连接与另外的(例如第二种类型的)结合配体使用。在一些实施方式中，其中至少有一些包含至少一个分析物分子的大量捕获物可接触大量结合配体，这样使得结合配体与大量分析物分子中的至少一些进行连接。在其中有统计学显著比例的捕获物连接于单个分析物分子而统计学显著比例的捕获物不连接任何分析物分子(例如，其中分析物分子的数量少于捕获物总数)的实施方式中，结合配体可与基本上所有固定化于捕获物的分析物分子连接。在一些情况下，超过大约80%、超过大约85%、超过大约90%、超过大约95%、超过大约97%、超过大约98%、超过大约99%、或更多的分析 物分子可连接于结合配体。在其中基本上所有捕获物都包含至少一个分析物分子的其他实施方式中(如在其中分析物分子的数量大约等于或大于所提供的捕获物数量的实施方式中)，捕获物可接触结合配体这样使得统计学显著比例的捕获物连接于至少一个结合配体(或在特定实施方式中，基本上只连接单个结合配体)而统计学显著比例的捕获物不连接任何结合配体。在一些情况下，捕获物可接触结合配体使得至少一些捕获物连接于至少一个结合配体而统计学显著比例的捕获物不连接任何结合配体。可用含有已知浓度的分析物分子及不同量的结合配体的校准标准样，使用泊松分析进行筛选测试以确定用于所需要的结合配体加样程度(例如，为帮助选择用于具体情况的适当的结合配体用量)的合适的结合配体用量。在特定实施方式中，确定了分析物是否几乎全部或只是部分地由结合配体标记。如本文他处所述的，使用泊松分布调整可将所检测的活性(即，连接于结合配体的)分析物分子的百分比转换为连接于零个、一个、两个等的结合配体的分析物分子百分比。在一些实施方式中，可使用超过一种类型的结合配体。在一些实施方式中，可提供第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体。在一些例子中，提供了至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少八种、至少十种或更多类型的结合配体。当其中一些连接于至少一个分析物分子的大量捕获物接触大量类型的结合配体时，大量固定化的分析物分子中至少有一些可连接于至少一个每种类型的结合配体。结合配体可选择为使得其以多种不同方式相互作用。在第一个实施例中，第一种类型的结合配体可连接于分析物分子，而第二种类型的结合配体可连接于第一种类型的结合配体。在这些实施方式中，第一种类型的结合配体可包含有助于分析物连接的第一种组分及有助于第二种类型结合配体连接第一种类型的结合配体连接的第二种组分。在一个具体的实施方式中，第二种组分为生物素，而第二种类型的结合配体包含连接生物素的酶或酶组分。作为另一个实例，第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体可直接连接于分析物分子。不受理论或任何具体机制的约束，在进行测定时，通过只将确定包含第一种类型和/或第二种类型的结合配体的位置鉴别为含有分析物分子(如通过直接或间接检测)，第一种类型和第二种类型的结合配体的连接都可提供另外的特异性和可靠性。这些测定法可以减少非特异性连接引起的假阳性数，因为被发现只具有单一类型的结合配体(如，只有第一种类型的标记试剂或第二种类型的标记试剂)的位置不会被认为或计为包含分析物分子的位置。第一种类型的结合配体可包含第一种类型的酶组分，而第二种类型的结合配体可包含第二种类型的酶组分，其不同于第一种类型的酶组分。含有分析物分子、第一种类型的结合配体及第二种类型的结合配体的捕获物可接触第一种类型的前体标记试剂(其在接触第一种类型的酶组分时会转化为第一种类型的标记试剂(如,包含第一种可测量特性))和第二种类型的前体标记试剂(其在接触第二种类型的酶组分时会转化为第二种类型的标记试剂(如，包含可区分于第一种可测量特性的第二种可测量特性)。因此，只有确定含有第一种类型的标记试剂及第二种类型的标记试剂的位置含有分析物分子。作为另一个实例，第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体可各自并入一种组分(如，DNA标签)，而第三种类型的结合配体可包含互补于第一种类型和第二种类型结合配体的两种组分(例如，两种类型的互补DNA标签)，其中第三种类型的结合配体还包含用于直接或间接检测的分子或部分(例如，确定一个位置中分析物分子存在或不存在需要反应容器中存在第三种类型的结合配体)。当第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体都基本上紧密地存在于彼此邻近时(例如，通过连接于一个分析物分子)，可发生第三种类型结合配体的连接，这样使得可以对分析物分子进行检测。有关使用超过一种类型的结合配体降低非特异性连接相 关的特定负面影响的更多信息描述于Duffy等人提交于2010年3月24日的共有美国专利申请序列号 12/731，135，题名为“Ultra-Sensitive Detection of Molecules using DualDetection Methods”，以及Duffy等人提交于2011年3月I日的国际专利申请号(未确定)，题名为“Ultra-Sensitive Detection of Molecules using Dual Detection Methods，，(律师案卷号Q0052. 70012W000)，其通过引用并入本文。检测可检测和/或定量其中一些包含至少一个分析物分子和/或至少一个结合配体的大量捕获物，而所述检测和/或定量可与所测试的样品中的分析物分子/颗粒的存在情况及可选地其的量和/或浓度相关。在一些实施方式中，可通过将大量捕获物空间划分入大量位置而检测和/定量所述大量捕获物。在一些实施方式中，所述大量位置包含大量反应容器(如，在阵列中)。在一些情况下，可构造检测器以检测大量位置(例如，反应容器阵列)之中或附近的捕获物。在一些实施方式中，捕获物可产生或被做成产生可检测信号如荧光发射，其可帮助检测捕获物。在一些情况下，可使用散射技术检测捕获物，如本文所描述的。在一些实施方式中，空间划分的捕获物数量可基本上等同于接触含有或疑似含有分析物分子的流体样品的捕获物数量。然而，在一些实施方式中，空间划分入大量位置的捕获物数量基本上少于接触含有或疑似含有分析物分子的流体样品的捕获物数量。在一些情况下，大约1%、大约2%、大约3%、大约5%、大约10%、大约15%、大约20%、大约30%、大约40%、大约50%、大约60%、大约70%、大约80%、或更多的接触流体样品的捕获物都在空间上划分入了大量位置。在一些例子中，大约1%_大约99%，大约10%-大约90%，大约20%-大约80%，大约30%-大约70%,大约50%-大约90%,大约1%-大约50%,大约5%-大约40%、或大约10%-大约30%或更多的接触流体样品的捕获物都在空间上划分入了大量位置。可对空间划分的分析物分子(或结合配体)进行直接或间接检测和/或定量。在直接检测的情况下，分析物分子可包含可直接拾取和/或检测的分子或部分，例如，荧光实体(如荧光部分、荧光微珠、荧光抗体等)、金属纳米颗粒或纳米团簇(例如，黄金纳米团簇或纳米颗粒、银纳米团簇或纳米颗粒)，量子点(如CdSe量子点，CdTe量子点等)，以及放射性同位素。在其中测定包含使用一种或多种类型的结合配体的实施方式中，结合配体可包含可直接拾取和/或检测的分子或部分。可在对所述位置进行拾取时使包含这样的分析物分子或结合配体(其包含可直接拾取和/或检测的部分)的位置发射信号。在一些实施方式中，可采用非酶的检测方法。非酶的检测方法对本领域一般技术人员已知。非限制性实例包括拉曼散射，电磁辐射共振法(例如，回音壁模式)、光谱仪(例如，红外，原子光谱)、吸收值、压电传导(例如，石英晶体微天平(QCM))、圆二色光谱、电镜(例如，扫描电显微镜(SEM), X-射线光电子能谱仪(XPS))、扫描探针显微术(例如，原子力显微镜(AFM)、扫描隧道显微镜(STM))、光散射，表面等离子体共振(SPR)、倏逝波检测、 光学干涉测量法和其他方法的基础上测量的折射率的变化、电子传导法、如电导和电容；磁性传导效应(例如，磁阻效应)、量热法(例如，差示扫描量热法(DSC))、衍射、核磁共振(NMR)、电子顺磁共振(EPR)、质谱(例如，基质辅助激光解吸电离(MALDI))、荧光技术(如荧光共振能量转移(FRET)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP))及发光氧气窜(L0CI)。在一些实施方式中，大量分析物分子(或结合配体)是间接检测的。间接的手段可包括例如将分析物分子或连接于分析物分子的结合配体接触前体标记试剂，其中前体标记试剂在接触分析物分子或连接于分析物分子的结合配体时会转化为标记试剂。标记试剂可包含能够拾取和/或检测的分子或部分。然后可通过确定所述位置处/中的标记试剂的存在或不存在而确定分析物分子或结合配体在某个位置处的存在或不存在。例如，分析物分子可包含酶组分，而前体标记试剂分子可为显色、荧光或化学发光的酶性前体标记剂分子，其在接触转化剂时会转化为显色，荧光或化学发光的产物(其中每个都是标记试剂的一个实例)。在此例子中，前体标记试剂可为酶标签，例如，显色、荧光或化学发光的酶性前体标记试剂，其在接触酶组分时转化为可检测的标记试剂。在一些情况下，显色、荧光或化学发光的酶性前体标记试剂是以足够接触每个位置的量提供的。在一些实施方式中，电化学发光前体标记试剂会转化为电化学发光标记试剂。在一些情况下，酶组分可包含半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。如本领域一般技术人员会理解的，可选择多种适当的显色、荧光或化学发光酶性前体标记试剂以使许多不同的酶对其转化。因此，任何已知的能够在与具体酶反应时产生标记试剂的显色、荧光或化学发光酶性前体标记试剂可潜在地用于本发明的实施方式作为前体标记试剂，其中分析物分子或连接于分析物分子的结合配体包含酶组分。例如，许多适合酶性前体标记试剂分子的用途的显色、荧光或化学发光前体标记试剂公开于 The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, TenthEd. , Chapter 10。在另一个实施方式中，分析物分子可以为蛋白质，而结合配体可包含能够连接于分析物分子以及酶组分的结合配体。将前体标记试剂分子接触连接于结合配体的酶组分可将前体标记试剂分子转化为可检测的显色、荧光或化学发光标记试剂分子。图9A和9B中示例显示了两个间接检测分析物分子的非限制性实例。图9A中，提供了位置150 (此实施例中表示为一个反应容器)，其包含捕获物152 (在此实施方式中由箭头表示)。分析物分子154通过捕获组分156固定化于捕获物152。反应容器接触到前体标记试剂158，其在接触分析物分子154时可转化为标记试剂分子160，如箭头159所示。作为另一个实例，图9B中，提供了位置170 (此实施例中表示为一个反应容器)，其包含捕获物172 (在此实施方式中表示为微珠)。分析物分子174通过捕获组分176固定化于捕获物172，结合配体177连接于分析物分子174。反应容器接触到前体标记试剂158，其在接触结合配体177时可转化为标记试剂分子180，如箭头179所示。在一些实施方式中，可指认大量位置，且/或可基本上同时检测大量捕获物和/或目的物类/分子/颗粒。当用于此上下文时，“基本上同时”指的是在近似相同的时间指认/检测目的位置/捕获物/分子/颗粒，使得至少两个目的位置/捕获物/分子/颗粒所指认/检测的时间段有重叠，而不是顺序地指认/检测。同时的指认/检测可通过使用多种技术包括光学技术(如CCD检测器)完成。根据一些实施方式，对捕获物/物类/分子/颗粒的空间划分入大量分离的可解析位置有助于基本上同时进行检测，通过使得多个位置可基本上同时被指认。例如，对于这样的实施方式，其中在检测中单个的物类/分子/颗粒连接于进行空间划分与其他捕获物进入了分离、分开的可解析位置的捕获物，基本上同时指认大量分离、分开的可解析位置允许解析单个捕获物，由此也允许解析单个的物类/分子/颗粒(如，分析物分子)。例如，在特定实施方式中，大量分子/颗粒中的单个分子/颗粒在大量反应容器上有分区，这样每个反应容器会含有零个或只有一个物类/分子/颗粒。在一些情况下，在检测中所有物类/分子/颗粒中有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%、至少大约99. 5%都在空间上与其他物类/分子/颗粒分离。大量物类/分子/颗粒可在低于大约I秒、低于大约500毫秒、低于大约100毫秒、低于大约50毫秒、低于大约10毫秒、低于大约I毫秒、 低于大约500微秒、低于大约100微秒、低于大约50微秒、低于大约10微秒、低于大约I微秒、低于大约O. 5微秒、低于大约O. I微秒、或低于大约O. 01微秒、低于大约O. 001微秒、或更少的时间段内基本上同时检测。在一些实施方式中，大量物类/分子/颗粒可在大约100微秒-大约O. 001微秒，大约10微秒-大约O. 01微秒、或更少的时间段内基本上同时检测。在一些实施方式中，一些技术可用于防止或减少分析物分子从捕获组分和/或捕获物上的解离，并/或防止或减少结合配体从分析物分子和/或另一种结合配体上的解离。如本领域一般技术人员已知的，所选的分析物分子、捕获组分和/或结合配体之间的(如抗体抗原之间的)一些可逆亲和相互作用受热动力学控制。因此，在特定测定的一些时间点处，分析物分子和捕获组分之间和/或结合配体，和/或结合配体和分析物分子和/或另一中结合配体之间的可以发生一些解离。这可以导致所检测到的分析物分子(如免疫复合物)数量少于实际存在的。具体的一对组分(如抗体-抗原对)的解离常数、洗涤和/或液体接触、接触和拾取之间的时间和/或其他因素可以影响解离事件改变对分析物分子和/或颗粒的确定的程度。因此，特定技术可用于减少解离过程的影响。在第一个实施方式中，可在大量(例如通过捕获组分连接捕获物和/或连接于至少一个结合配体的)分析物分子进行空间划分进入大量这样的位置之后通过从测定位置(例如，孔)移除液体而减少或消除解离。也就是，可以移除所有或基本上所有在这些位置中/处围绕或基本包含期内的液体。例如，流体可通过空气和/或真空干燥而移除。液体的移除可减少或消除解离。在对位置进行拾取前可立即将流体加至这些位置，由此使复合物再水合，这有助于用检测器进行拾取。在一个具体的实施例中，大量分子物分子(例如通过捕获物)连接于微珠(在一个实施方式中为捕获物)。微珠(因此也是分析物分子)可选地连接于至少一个结合配体和/或接触某种材料(例如，缓冲液)以保持分析物分子和/结合配体处于水合状态(例如，免疫复合物可接触含有特定碳水化合物的缓冲液)。在微珠加入大量的孔(例如，位置)之后，多余溶液(例如，缓冲液)通过空气和/或真空干燥而移除。在此实施方式中，通过消除微珠和大量溶液的接触，与不移除流体的类似系统相比，几乎消除或基本上减少了分析物分子和/或结合配体的解离。在此情况下，可将包含微珠的孔储存(例如lmin, 2min, 5min, IOmin, 20min, 30min, I小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、或更久)，而没有或基本上没有(例如，低于大约20%、低于大约15%、低于大约10%、低于大约5%、低于大约4%、低于大约3%、低于大约2%、低于大约1%、低于大约O. 5%、低于大约O. 3%、低于大约O. 1%、低于大约O. 01%、或更少的)分析物分子(和/或结合配体)解离。在进行孔拾取前或紧接着孔拾取(例如，大约 I秒、大约5秒、大约10秒、大约30秒、大约I分钟、大约2分钟、或大约5分钟前)时,可向 孔中加入溶液，可选地随后进行密封(例如，在拾取前)。见例如实施例22。在第二个实施方式中，可通过将分析物分子与捕获组分交联和/或将结合配体与分析物分子和/或第二中结合配体交联而减少或消除解离。例如，包含抗原的分析物分子可与包含抗体的结合配体和/或捕获组分交联。所采用的交联方法和技术对本领域一般技术人员已知。在一些情况下，分析物分子连接捕获组分(例如连接捕获物)和/或结合配体连接于分析物分子和/或第二种结合配体之后，复合物可接触交联剂(如I-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺(即，EDC)，戊二醛等)，由此促进所需的交联反应。交联反应剂可根据用于测定的反应剂的特性而选择，可以考虑多种因素包括交联反应剂的长度和/或选择交联剂时的必需官能团，这些都是本领域技术人员会理解的。可选地，在拾取之前或在接触标记试剂前体或其他反应剂之前可移除多余的交联反应剂，且/或淬灭未反应的交联基团。然后可根据如本文所描述的方法进行测定。见例如实施例23。交联反应的一个非限制性实例显示于图10A。在此图中，包含捕获组分504(例如，捕获抗体)的微珠502连接于分析物分子506。分析物分子506还连接于结合配体508。复合物507与交联反应剂510接触，并发生反应，如箭头511所示。第一种交联反应剂512在分析物分子506和捕获组分504之间形成的交联，而交联反应剂514在分析物分子506和结合配体508之间形成交联。作为另一个实例，结合配体可包含能够在两个组分(如分析物分子和结合配体，或捕获组分和分析物分子，或第一种结合配体和第二种结合配体)之间形成交联的交联组分，如IOB所示。在此图中，包含捕获组分524 (例如，捕获抗体)的微珠522连接于分析物分子526。分析物分子526还连接于包含交联组分530的结合配体528。在接触外部刺激时(如，UV光、化学刺激物等)，分析物分子526和结合配体524之间形成交联532，如箭头531所示。用于此目的的交联组分的非限制性实例包括N-琥珀酰亚胺基_6-[4’ -叠氮基-2’ -硝基苯基氨基])己酸盐(B卩，SANPAH)和琥珀酰亚胺基6- (4，4’ -叠氮戊酰胺)己酸盐(即，LC-SDA)ο在所述方法中对捕获物/分析物分子已经划分进入的位置的指认步骤中，可确定多种参数。在一些实施方式中，确定了包含捕获物和分析物分子(或结合配体)的位置数量。包含捕获物但不包含分析物分子(或结合配体)的位置数量也可确定。在一些情况下，所指认的不含捕获物的位置数量也可确定。在其他情况下，还可确定所指认的位置总数。可在任何给定的时间对最终指认的位置的任何亚集或全部进行单次拾取或多次拾取，以帮助进行一项或所有上述的确定。例如，第一个确定可在第一种波长范围(例如，白光)下完成以确定包含捕获物的位置数量，其中位置没有区分为其中分析物分子(或结合配体)是否连接于捕获物，而第二种对相同位置或对这些位置中一些亚集的确定可在第二种波长范围(例如，荧光)下完成的，以确定包含连接于分析物分子(或结合配体)的捕获物的位置数量。示例性的检测方法描述于下文。检测方法在一些实施方式中，在其中要检测的物类是在大量位置上分区的系统/方法中，可使用多种技术拾取这些位置，包括本领域一般技术人员已知的技术。
在本发明一个具体的实施方式中，对这些位置进行光拾取。可通过常规的光学系统和光学检测系统鉴别出在其光学特征上显示出变化的位置。根据所检测的种类(例如，标记试剂分子、颗粒等等)和操作波长，可采用为具体波长设计的滤光片用于光拾取这些位置。在其中使用了光拾取的实施方式中，该系统可包含超过一个光源和/或大量滤片以调整光源的波长和/或强度。例如，在一些情况下，对位置的第一次拾取可使用第一个波长范围的光(例如，在捕获物非荧光的情况下为白光，或捕获物发荧光的波长范围)进行，而第二次拾取可使用第二种不同波长范围进行，这样使得大量可检测分子发荧光。一个示例性的系统配置提供于下文(见图11)。在一些实施方式中，来自大量位置的光信号由CXD摄像机捕获。如本领域一般技术人员已知的，可用于捕获图像的摄像机成像类型的其他非限制性实例包括电荷注入检测器(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)设备、科学级CMOS (sCMOS)设备和时间延迟集成(TDI)设备。摄像机可获自商业来源。CID为类似于C⑶的固态的、二维多像素成像设备，但差别在于图像是如何捕获和读取的。CID的实例见美国专利号3，521，244和美国专利号4，016，550。CMOS设备也是二维、固态成像设备，但与标准CXD阵列的差异在于电荷是如何收集和读取的。这些像素在制造CMOS晶体管的半导体技术平台中建立，这样在基本上的读取电子学系统的信号上产生显著的增益，而且使设备上电子学系统产生显著的更正。例如，见美国专利号5，883，830。sCMOS包含CMOS成像技术，具有特定的形成良好的灵敏度和动态范围的技术改进。TDI设备采用了 CCD设备，其允许一列像素转移入邻近一列并还能继续采集光。这种类型的设备一般以这样的方式施用，使得这列像素的转移与正在采集的图像的运动同步，这样可整合显著的一段时间的移动图像，而且不会因为摄像机上图像的相对移动而模糊化。在一些实施方式中，可使用偶联于光电二极管或光电倍增管(PMT)的扫描镜系统进行成像。在一个实施方式中，大量位置作为光纤束一端的大量反应容器直接形成。根据一个实施方式，本发明的反应容器的阵列可联合光学检测系统使用，如描述于美国公布号2003/0027126的系统。例如，根据一个实施方式，本发明的反应容器阵列是在光纤装置中形成的，后者包含由包层纤维构成的光纤束，这样光不会在不同纤维之间混淆。图IlA和IlB显示了根据一些实施方式的本发明的系统的非限制性实例。所述系统包括光源452、激发滤光片454，二色镜458、发射滤光片460、物体470及阵列472。从光源452发出的光453通过激发滤光片454。光在二色镜458上反射回来，通过目标470，照在阵列472上。在一些情况下,杂散光464可通过杂散光降低功能体468而减少,如虹膜光圈或光圈。发射自阵列的光471穿过模板470和发射滤光片460。观察到的为光462。根据具体应用的需要，该系统可包含其他组分(例如，附加的滤光片、镜片、放大设备等)，这些是本领域一般技术人员所理解的。图IlA中所示的系统可以另外包含有助于(例如使用白光)确定含有捕获物的反应容器的数量的组分。备选地，附加的组分可用于确定位置总数量和/或提供有关这些(例如，含有或不含捕获物的)位置的位点的空间信息，这可以帮助收集不同光照(如荧光、白光)下观察到的对应于某个位置的位点的信号(例如，可制造掩罩)。在图IlA和IlB中，激发光由光源452发射出并准直成为光束453。激发滤光片454可构造为只传递激发突光素的波长带(如在试卤灵的情况下为575nm±10nm)。激发光被二色滤光片458向下反射并通过目镜470激发含有样品的基底472。图像光通过目镜470 收集的，准直为光束471并传输穿过二色滤光片458。只有对应于荧光波段(如在试卤灵的情况下为670nm±30nm)的图像光可以传输穿过发射滤光片460。剩下的准直光束462只含有发射的荧光波长，其在随后通过摄像机系统成像。相同的系统可用于确定含有样品的位置(反应容器)的定位。包含含有捕获物的反应容器的阵列可用“明场”白光照明照亮。所述阵列可通过将一束伪准直的白光(例如白光LED)以收集目标的数值口径之外的一定角度(例如，图IlA的Θ 1可为大约20度、大约25度、大约30度、大约35度、大约40度、或更大)指向阵列表面而照亮。照在阵列472表面的光(例如，光476)被从表面反射(或散射)，准直为471并通过目镜(470)收集。然后准直光束通过摄像机系统成像。相同的系统还可用于确定哪些位置含有捕获物(例如，微珠)。任何具体的微珠可以连接或不连接于分析物分子和/或结合配体。所述阵列可(例如使用如图IlA所示的光源473)用“暗场”白光照明照亮。通过将一束伪准直的白光(例如白光LED473)以基本在收集目标的数值口径之外的一定角度(例如，图IlA的92可为大约65度、大约70度、大约75度、大约80度、大约85度)指向阵列表面而照亮。照在阵列472表面的光(例如，光474)被从表面反射(或散射)，准直为471并通过目镜(470)收集。然后准直光束通过摄像机系统成像。在一些实施方式中，可米用如描述于美国公布号2003/0027126的光学检测系统。在一个示例性系统中，通过使用放大变换器改变了从形成于光纤束远端的反应容器阵列返回的光以对光纤近端或远端的成像尺寸进行调整。放大的图像然后由快门轮遮闭并滤过。然后，图像由电荷耦合设备(CCD)摄像机捕获。可提供包括并执行成像处理软件的计算机以处理来自CXD摄像机的信息，可选地，其还能设置为控制快门和滤光轮。如美国公布号20030027126中阐明的，光纤束的近端由z平移台和χ-y微定位器进行接收。例如，图12显示了一个系统的原理框图，其采用了光纤装置400和光学检测系统。光纤装置400包含光纤束或阵列402，其是由包层光纤构成的，这样光就不会在光纤之间混淆。反应容器401的阵列形成/附着于光纤束的远端412，其近端414可操作地与Z-平移台416和x-y微定位器418相连。这两个部件协同作用为显微镜物镜420对光纤束402的近末端414进行合适的定位。由三个指针立方体滑块422将物镜420收集的光传递至反射光荧光附件。附件422使得能够使来自75瓦特的Xe灯424的光导向穿过物镜420，以耦合进入光纤束402。来自光源424的光通过聚光镜426聚集，然后通过滤光片和快门轮428过滤和/或遮闭，然后穿过ND滤光片430。从光纤束402的远端412返回的光穿过附件422至放大转换器432，后者使得能够调整光纤的近端或远端的成像尺寸可以调整。穿过放大转换器432的光然后通过第二个快门轮434被遮闭和过滤。这些光由电荷耦合设备(CCD)摄像机436收集。计算机438执行成像处理软件的以处理来自CXD摄像机436的信息，可选地，其还控制系统的其他部件，包括但不限于第一和第二个快门和过滤轮428、434。用于实践本发明一些实施方式的反应容器阵列可使用多种兼容过程整合或附着于光纤束远端。在一些情况下，微孔形成于光纤束每个单独纤维的中心，这些微孔可以密封或不密封。光纤束的每个光纤可传递来自形成于光纤远端中心的单个微孔的光。这个特征使得能够拾取单个反应容器的光学信号以鉴别各个微孔中的反应/内容物。因此，通过用 CCD阵列收集光纤束末端的图像，反应容器的光学信号可单个地进行拾取且/或可基本上同时成像。
定量根据本发明的一些实施方式，至少部分地基于对用于捕获分析物分子(及可选地至少一个结合配体)的大量捕获分子中至少一些的检测和/或定量，这些方法、系统和/或设备被用于确定流体样品中分析物分子(或颗粒)的存在和/或浓度的量度。在其中浓度已经确定的特定实施方式中，采用了将含有包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物的位置数量(或比例/百分比)与流体样品中分析物分子的量/浓度相联系的关联和/或校准。在一些情况下，流体样品中分析物分子的浓度可与含有包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物的位置的数量/比例成线性比例。在其他情况下，流体样品中分析物分子浓度的量度可与含有连接于至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物的位置的数量/比例有非线性关系。在一些实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度可至少部分地使用用含有已知浓度的靶标分析物分子的样品得出的校准曲线而确定。用于确定流体样品中分析物分子浓度的量度的方法在下文有更多讨论。本发明的特定实施方式的出色之处在于其能够检测和/或定量低数量/浓度的包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物，很适合于确定对含有很低浓度的分析物分子的流体样品中分析物分子浓度的量度。在特定实施方式中，可至少部分地通过空间分离单个捕获物以增进所述能力，包括至少一些捕获物包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)，例如通过将大量的这种捕获物在位置(反应容器)的阵列上分区，并然后检测其在反应容器中的存在情况。在一些实施方式中，可确定包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物在反应容器中的存在情况，而且这些反应容器的数量可以二进制形式计数。也就是说，在其中位置(例如反应容器)被发现含有至少一个连接于至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物的实施方式中，所述位置计为I。而在其中位置(例如反应容器)被发现含有捕获物的实施方式中，所述位置计为O。例如，如上文所描述的，可通过检测反应容器中可检测分子或颗粒的存在情况可确定计为“I”的孔表示孔中存在有包含至少一个分析物分子(和/或至少一个结合配体)的捕获物。
在这些实施方式中，其中含有或疑似含有的流体样品接触大量捕获物使得存在于样品中的任何分析物分子固定化于大量捕获物，使得统计学显著比例(例如，如上文所描述)的捕获物连接于单个分析物分子而统计学显著比例的捕获物不连接任何分析物分子(如图I步骤(B)所示)，对流体样品中分析物浓度的量度可如下进行。首先，至少一部分捕获物(其中至少有一些具有固定化的单个分析物分子)在空间上划分入大量位置(如图1，步骤(C)所示)。确定含有固定化于捕获物的分析物分子的位置数量，可以直接(如通过检测分析物分子本身，例如见图1，步骤(D))或间接(例如，通过检测连接于分析物分子的结合配体，通过检测(例如前体标记试剂接触分析物分子转化形成的，见图4A，等等)标记试剂进行。在一些实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度至少部分地基于确定含有分析物分子的大量位置(例如，图I步骤(D)中反应容器12)的数量而确定。在特定的这些实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度至少部分地基于将如此测量的参数与校准标准样的比较和/或使用泊松和/或高斯分布分析的预期含有分析物分子的位置数量。在一些实施方式中，也可确定包含不连接于分析物分子的捕获物的位置数量(如图I步骤(D)中的反应容器13)。在这些情况下，流体样品中分析物分子浓度的量度可至少部分地基于包含固定化于捕获物的分析物分子的位置数量相对包含不连接于分析物分子 的捕获物的位置数量的比率而确定。在一些情况下，还可确定不包含捕获物的位置数量(例如，图I步骤(D)中的反应容器14)。在这些情况下，流体样品中分析物分子浓度的量度可至少部分地基于包含固定化于捕获物的分析物分子的位置数量相对不包含捕获物的位置数量和/或不包含分析物分子的位置数量的比率而确定，不管这样的位置是否含有捕获物(在上述两种情况下或其他情况下，根据偏好，这个比率/比例的分母可包括或不包括加上阳性(“开”或“I”)位置的零(“关”或“O”)位置)。在其他情况下，可确定所指认/分析的位置(如图1，步骤(D)中的反应容器12、13和14)总数，且流体样品中分析物分子浓度的量度可基于包含固定化于捕获物的分析物分子的位置数量与所指认/分析的位置总数的比率而确定。应当理解的是，在一些测定法中，流体样品中分析物分子浓度的量度可使用超过一种类型的分析(例如，基于包含固定化于捕获物的分析物分子的位置数量的第一种分析和基于包含固定化于捕获组分的分析物分子的位置数量相对包含捕获物的位置总数的比率/比例，等等)进行。在这些实施方式中，第二种分析可用作质量控制量度(例如，以确认第一种分析提供了合理的结果)，且/或这两次分析结果可加以平均。在一些实施方式中，确定测流体样品中分析物分子浓度的量度可使用与上文所描述的类似分析进行，但是是通过确定包含结合配体的反应容器数量，而不是包含固定化于捕获物的分析物分子的反应容器数量。如本文所描述的，在一些情况下，大量分析物分子固定化于大量捕获物后，所述大量捕获物可接触至少一种类型的结合配体以使至少一些固定化的分析物分子连接于至少一个结合配体(例如见图2，步骤(B))。这种测定法尤其可用于其中预期超过一个分析物分子会连接每个捕获物，但仍需要二进制定量的实施方式中。在一些情况下，结合配体可提供的浓度可使得至少一些含有至少一个分析物分子的捕获物不连接任何结合配体(例如，见图2，步骤(C))。在这些实施方式中，含有(例如通过分析物分子)连接于结合配体的捕获物的位置数量可在上文描述的分析和方法中取代含有连接于分析物分子的捕获物的位置数量。
流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度可使用多种校准技术确定，能产生最精确可靠的结果的具体技术可取决于相对于接触样品的捕获物的数量/浓度的样品中分析物分子的数量/浓度(或，对于使用结合配体的实施方式，为相对于在捕获物捕获分析物分子之中/之后的彼此接触的捕获物的数量/浓度的结合配体的数量/浓度)。可用于具体分析物浓度方式的浓度确定方法的非限制性实例包括上述的二进制读取法，及/或其中采用了对这些位置测量了相对阳性信号强度的方法(“强度读取法”)。上述方法的任何一项或二者——或备选方法——都可进一步采用将所测量的参数与校准曲线进行对比。目前认为最精确的确定方法至少部分地取决于流体样品中包含的分析物分子浓度。例如，在这样的实施方式中，其中在测样品中分析物分子浓度导致捕获物分区所在的位置中有统计学显著的比例都包含单个分析物分子或结合配体，而统计学显著比例的位置不包含任何分析物分子或结合配体(例如，在或接近几乎没有位置包含超过一个分析物分子或结合配体的形式中)，二进制读取法可尤其有用，而在一些情况下，可联合校准曲线使用。在其他实施方式中，其中更大量的位置包含超过一个分析物分子和/或超过一个结合配体，至少部分基于强度读取的确定法可提供对流体样品中分析物分子浓度的更精确的量度。这样的确定法也可连接校准曲线使用。·在特定实施方式中，包含至少一个连接于分析物分子和/或结合配体的捕获物的位置的比例(如统计学显著比例)低于大约50%、低于大约40%、低于大约25%、低于大约10%、低于大约5%、低于大约1%、低于大约O. 5%、或低于大约O. 1%的含有捕获物的位置总数。在这些实施方式中，流体样品中分析物分子浓度的量度可使用二进制读取法确定。在一些情况下，不含有连接于分析物分子和/或结合配体的捕获物的位置百分比占位置总数的至少大约20%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约90%、或至少大约95%、至少大约99%、至少大约99. 5%、至少大约99. 9%、或更多。尽管下文的讨论主要聚焦于二进制读取系统用于超低水平检测能力的用途(如，基于对“开”和“关”的位置的计数)，但这决不是限制性的，本发明的方法和测定还在特定实施方式中不采用二进制定量操作流程(或在采用其之外)而(还)采用基于对强度测量的方法(即，强度读取法)(例如以扩大动态范围)。如所指出的，在一些情况下，检测系统和定量法可设置为使得系统可使用二进制读取确定法和强度读取确定法之一或全部，取决于测定的形式和/或流体样品中分析物分子的浓度。例如，所述方法和/或系统可确定来自第一次测量的基础参数并根据第一次确定法的结果决定使用二进制读取确定法或强度读取确定法，如下文更详细描述的，其在Rissin等人提交于2010年3月24日的共有美国专利申请序列号 12/731, 136 (题名为“Methods and systems for extending dynamic range inassays for the detection of molecules or particles”)以及 Rissin 等人提交于 2011年3月I日的国际专利申请号(未确定)(题名为“ Methods and systems for extendingdynamic range in assays for the detection of molecules or particles，，,律师案卷号Q0052. 70013W000)中有所描述，其都通过引用并入本文。根据一个实施方式，本发明的定量方法可如下进行。将含有或疑似含有目的分析物分子的流体样品与大量捕获物及可选地与一种或多种结合配体接触，并将捕获物在位置如反应容器/孔(如前所述)的阵列上分区。在其中需要二进制读取法以用于确定的一些实施方式中，在将流体样品与捕获物接触的步骤中，选择流体样品和含有捕获物溶液的相对量/浓度(例如，基于已知的或估计的/疑似的样品分析物分子的近似浓度范围)以使流体样品中分析物分子相对溶液中所提供的捕获物总数的比率低于大约1:5、低于大约1:10、低于大约1:12、低于大约1:15、低于大约1:20、低于大约1:50、低于大约1:100、或更低。在这些比率下，统计学上有至少一些捕获物会预期与单个分析物分子连接，且剩下的捕获物中大多数不连接任何分析物分子。在这些条件下，连接于多个分析物分子的捕获物数量低至可以忽略，这样，可认为确定包含分析物分子的捕获物包含单个分析物分子。在这些条件下，可通过任何本文描述的检测方法，使用为进行二进制读取定量设置的分析系统以确定包含连接于分析物分子的捕获物的位置数量。然后对包含连接于分析物分子的捕获物的位置数量进行计数(例如，图1，步骤(D))，包含分析物分子的反应容器总数为2 (例如，反应容器12)，在一些情况下，计算含有连接于分析物分子的捕获物的位置总数的比例(例如，图I中，包含捕获物的反应容器总数为3，反应容器12和13 ;因此，包含连接于分析物分子的捕获物的位置总数的比例为2:3)。使用O (未检测到分析物分子)或I (检测到一个分析物分子)响应联合使用有大量位置的阵列可使得能通过计数这些位置上分区的及包含于这些位置之内的样品的体积中包含的实际分子数而确定样品中分析物分子的主要浓度。在一些情况下，分析物分子可间接检测(如通过计数含有至少一个标记试剂分子的位置数量完成读 取，其中标记试剂由前体标记试剂在接触分析物分子时转化而来)。在大量位置(例如，至少大约10，000位置)几乎同时拾取时，包含连接捕获物的分析物分子的位置对所确定的位置(例如，在一些情况下为含有连接或不连接任何分析物分子的捕获物的位置)总数的比率可为至少大约1:100、至少大约1:1000、至少大约1:10,000或更少。使用更大量位置的阵列(例如，至少大约10，000、至少大约50，000、至少大约100，000、至少大约500，000等)可在甚至如此低的比率下提供统计学显著的信号。在一些测定中，泊松分布调整可应用于二进制读取法确定的数量和/或比率以帮助和/或提高确定流体样品中分析物分子浓度的精确度。例如，在这样的实施方式中，其中流体样品中分析物分子相对接触流体样品的捕获物总数的比率超过大约1:10、超过大约1:5、超过大约1:4、超过大约1:3、或超过大约1:2、或大约1:10-大约1:2，大约1:5-大约1:2，每个捕获物上固定化的分析物分子数量可为零或一，而按照上文段落中描述的方式，有更大的比例含有超过一个。在一些这样的情况下，浓度确定的效果和精确度可在假设所有阳性位置只含有单个分析物分子(如上文段落中描述的)下使用泊松分布调整预测其中每个捕获物含有0，1，2，3，4，等分析物分子的位置数量而提高。泊松分布描述了已知事件的平均数时一定数量事件发生的概率。如果预期的发生数为μ，则精确的次发生概率(Ρμ (ν)) (V为非负整数，ν=ο，ι，2，...)可由公式5确定JTi(V) =(公式 5)在本发明的一些实施方式中，μ等于确定含有连接捕获物的分析物分子的位置数量相对所检测的捕获物总数(连接或不连接任何分析物分子)的比例，ν为连接特定数量分析物分子的捕获物数量(例如，连接于0、1、2、3等个分析物分子的捕获物数量)。通过在测定中拾取位置的阵列来确定μ，可使用泊松分布调整确定样品中分析物分子的浓度。例如，在使用二进制测量模式的测定中，连接1、2、3、4等个分析物分子的捕获物相互不加区分(例如，V =1、2、3、4相互无区别)连接且反应孔(例如，位置、反应容器)简单地定性为“开”反应孔，则v=0的发生率可在定义上确定为“关”孔的数量。(P μ (O))可根据公式6计算
权利要求
1.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 将大量各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触； 将分析物分子或颗粒固定化于所述大量捕获物，使得至少一些捕获物与至少一个分析物分子或颗粒连接，而统计学显著比例的捕获物不与任何分析物分子或颗粒连接； 将至少一部分经过了固定化步骤的捕获物在空间上划分入大量分隔的位置； 指认至少一部分的经过空间划分步骤的所述大量位置并确定含有分析物分子或颗粒的所述位置的数量；以及 至少部分地基于确定含有分析物分子或颗粒的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
2.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 将大量各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触，以形成包含至少一个固定化的分析物分子或颗粒的捕获物； 将接触步骤中制备的捕获物与大量结合配体相混合，使得至少一些捕获物连接单个结合配体而统计学显著比例的捕获物不与任何结合配体连接； 将至少一部分经过混合步骤的捕获物在空间上划分入大量的位置； 指认至少一部分的经过空间划分步骤的所述大量位置并确定含有结合配体的位置数量；以及 至少部分地基于确定含有结合配体的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
3.权利要求I或2的方法，其中连接于至少一个分析物分子和/或结合配体的捕获物百分比为捕获物总数的低于大约50%、低于大约40%、低于大约30%、低于大约20%、低于大约10%、或低于大约5%、或低于大约1%、或低于大约O. 5%、或低于大约O. 1%。
4.权利要求I或2的方法，其中不连接任何分析物分子和/或结合配体的捕获物百分比为捕获物总数的至少大约20%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约75%、或至少大约80%、或至少大约90%、或至少大约95%、或至少大约99%、或至少大约99. 5%、或至少大约99. 9%。
5.权利要求I或2的方法，其中指认步骤中确定了含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面而不包含分析物分子或颗粒或者结合配体的捕获物的所述位置数量。
6.权利要求5的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的并包含分析物分子或颗粒或者结合配体的结合表面的捕获物的位置数量相对指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物的位置总数的比率而确定。
7.权利要求5的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的并包含分析物分子或颗粒或者结合配体的结合表面的捕获物的位置数量相对指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物但不含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的并包含分析物分子或颗粒或配体的结合表面的任何捕获物的位置数量的比率而确定。
8.权利要求I或2的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的并包含分析物分子或颗粒或者结合配体的结合表面的捕获物的位置数量相对指认步骤中所指认的确定不含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物的位置总数的比率而确定。
9.权利要求I或2的方法，其中包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的大量捕获物包括大量微珠。
10.权利要求I或2的方法，其中大量位置包含大量反应容器。
11.权利要求10的方法,其中大量反应容器形成于光纤束末端。
12.权利要求I的方法，其中至少一部分的分析物分子或颗粒连接于至少一个结合配体。
13.权利要求I的方法，其中分析物分子或颗粒包含酶组分。
14.权利要求2或12的方法，其中结合配体包含酶组分。
15.权利要求I或2的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度低于大约50X 1(Γ15Μ、或低于大约40Χ 1(Γ15Μ、或低于大约30Χ 1(Γ15Μ、或低于大约20X 1(Γ15Μ、或低于大约10Χ1(Γ15Μ、或低于大约5Χ1(Γ15Μ、或低于大约1Χ1(Γ15Μ。
16.权利要求I或2的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地通过比较所测量的参数与校准标准样而确定。
17.权利要求I的方法，其中在固定化步骤中，至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%、或至少大约95%的分析物分子或颗粒都固定化于包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物。
18.权利要求2的方法，其中在混合步骤中，至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%的固定化的分析物分子或颗粒连接于结合配体。
19.权利要求I或2的方法，其中在空间划分步骤中，将至少大约5%、或至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%的经过固定化步骤的捕获物在空间上划分入大量位置。
20.权利要求10的方法，其中在指认步骤中所指认的反应容器数为反应容器总数的至少大约5%、或至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%。
21.权利要求I或2的方法，其中通过将大量位置与包含大量捕获物的溶液接触，而对包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的部分捕获物进行空间划分。
22.权利要求2或12的方法，其中在空间划分步骤后，将所述位置接触前体标记试剂。
23.权利要求22的方法，其中前体标记试剂在接触结合配体时转化为标记试剂。
24.权利要求23的方法，其中含有包含分析物分子或颗粒或者标记试剂的捕获物的位置数量是通过确定包含标记试剂的位置数量而确定的。
25.权利要求23的方法,其中标记试剂为发色、突光或化学发光试剂。
26.权利要求I或2的方法，其中分析物分子或颗粒为蛋白质。
27.权利要求I或2的方法，其中分析物分子或颗粒为核酸。
28.权利要求10的方法，其中大量反应容器是在将至少一部分密封部件和至少一部分基底匹配时形成的。
29.权利要求10的方法，其中大量反应容器形成于平面的基底上。
30.权利要求10的方法，其中大量反应容器的平均体积为大约10阿升-大约100皮升。
31.权利要求10的方法，其中大量反应容器的平均体积为大约I飞升-大约I皮升。
32.权利要求9的方法，其中大量微珠的平均直径为大约O.I微米-大约100微米。
33.权利要求9的方法，其中大量微珠的平均直径为大约I微米-大约10微米。
34.权利要求I或2的方法，其进一步包括进行至少一次洗涤步骤。
35.权利要求10的方法，其进一步包括密封所述大量反应容器。
36.权利要求I或2的方法，其中大量位置是通过光学技术指认的。
37.权利要求I或2的方法，其中结合表面包含大量捕获组分。
38.权利要求I的方法，其中在指认步骤中所指认的确定含有分析物分子或颗粒的位置的百分比为所指认位置总数的低于大约10%、或低于大约5%、或低于大约1%、或低于大约O. 1%。
39.权利要求2的方法，其中在指认步骤中所指认的确定含有结合配体的位置的百分比为所指认位置总数的低于大约10%、或低于大约5%、或低于大约1%、或低于大约O. 1%。
40.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，其包括 提供包含大量位置的基底，这些位置中至少一部分含有微珠，其中存在于基底上的微珠总数中，包含至少一个分析物分子或颗粒的微珠相对不包含分析物分子或颗粒的微珠的比例为大约8:1_大约1:10，000，000 ； 指认至少一部分的大量位置，其中在指认步骤中所述大量位置中至少两个至少是部分同时指认的； 在各个指认的位置检测微珠是否存在，如果存在，检测所述微珠是否包含任何分析物分子或颗粒；以及 至少部分地通过确定所指认的含有包含至少一个分析物分子或颗粒的微珠的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
41.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，其包括 提供包含大量位置的基底，这些位置中至少一部分含有微珠，其中存在于基底上的微珠总数中，包含至少一个连接于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠相对不包含连接于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠的比例为大约8:1-大约1:10，000，000 ； 指认至少一部分的大量位置，其中在指认步骤中所述大量位置中至少两个至少是部分同时指认的；在各个指认的位置检测微珠是否存在，如果存在，检测所述微珠是否包含任何连接于结合配体的分析物分子或颗粒；以及 至少部分地通过确定含有包含至少一个连接于结合配体的分析物分子或颗粒的微珠的位置数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
42.权利要求40或41的方法，其中比率为大约2:1_大约1:1，000，000。
43.权利要求40或41的方法，其中比率为大约1:10-大约1:100,000。
44.权利要求40或41的方法，其中比率为大约2:1-大约1:10。
45.权利要求40或41的方法，其中在指认步骤中，确定了所述的含有微珠但不含任何包含分析物分子或颗粒或者结合配体的微珠的位置数量。
46.权利要求40或41的方法，其中在指认步骤中，确定了所述的含有微珠的位置数量。
47.权利要求46的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在指认步骤中所指认的确定含有包含分析物分子或颗粒或者结合配体的微珠的位置数量相对在指认步骤中所指认的确定含有微珠的位置总数的比率而确定。
48.权利要求45的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在指认步骤中所指认的确定含有包含分析物分子或颗粒或者结合配体的微珠的位置数量相对在指认步骤中所指认的确定含有微珠但不含有任何包含分析物分子或颗粒或者结合配体的微珠的位置总数的比率而确定。
49.权利要求40或41的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在指认步骤中所指认的确定含有包含分析物分子或颗粒或者结合配体的微珠的位置数量相对所指认的位置总数的比率而确定。
50.权利要求40或41的方法，其中所述大量位置包含大量反应容器。
51.权利要求50的方法,其中所述大量反应容器形成于光纤束末端。
52.权利要求3或4的方法，其中包含至少一个微珠的位置的百分比为超过大约50%、或超过大约60%、或超过大约70%、或超过大约80%、或超过大约90%、或超过大约95%。
53.权利要求40或41的方法，其中分析物分子或颗粒为蛋白质或核酸。
54.权利要求40的方法，其中至少一部分的分析物分子或颗粒连接于至少一个结合配体。
55.权利要求41或54的方法，其中结合配体包含酶组分。
56.权利要求40或41的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度为低于大约50Χ1(Γ15Μ。
57.权利要求40或41的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地通过比较所测量的参数与校准标准样而确定。
58.权利要求40或41的方法，其中包含至少一个分析物分子的捕获物各自包含一个、两个、三个、四个或五个分析物分子。
59.权利要求41或54的方法，其中在提供步骤后，将位置与前体标记试剂接触。
60.权利要求59的方法，其中前体结合配体在接触结合配体时转化为标记试剂。
61.权利要求60的方法，其中在指认步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面并含有分析物分子或颗粒或者标记试剂的捕获物的位置数量是通过确定所指认的包含标记试剂的位置数量而确定的。
62.权利要求59的方法,其中标记试剂为发色、突光或化学发光试剂。
63.权利要求50的方法，其中大量反应容器是在将至少一部分密封部件和至少一部分第二种基底匹配时形成的。
64.权利要求50的方法，其中大量反应容器的每个的体积为大约10阿升-大约100皮升。
65.权利要求40或41的方法，其中微珠的平均直径为大约O.I微米-大约100微米。
66.权利要求40或41的方法，其中微珠的平均直径为大约I微米-大约10微米。
67.权利要求40或41的方法，其进一步包括进行至少一次洗涤步骤。
68.权利要求40或41的方法，其中大量位置是使用光学检测指认的。
69.权利要求40或41的方法，其中微珠包含大量捕获组分。
70.权利要求50的方法，其中所指认的反应容器数量为反应容器总数的至少大约5%、至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、或至少大约90%。
71.物品或试剂盒，其包括 大量具有平均直径为大约O. I微米-大约100微米的微珠；以及包含大量反应容器的基底，其中反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约1.0倍-大约I. 5倍，而反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. O倍-大约I. 9倍。
72.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量微珠的平均直径为大约I微米-大约10微米。
73.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量微珠的平均直径为大约I微米-大约5微米。
74.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量反应容器形成于光纤束末端。
75.权利要求71的物品或试剂盒，其中物品进一步包含密封部件。
76.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量反应容器的平均深度为微珠平均直径的大约I. I-大约I. 3倍。
77.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量反应容器的平均直径为微珠平均直径的大约I. 3-大约I. 8倍。
78.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量反应容器的平均体积为大约10阿升-大约100皮升。
79.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量反应容器的平均体积为大约I飞升-大约I皮升。
80.权利要求71的物品或试剂盒，其中大量微珠包含对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面。
81.权利要求80的物品或试剂盒，其中结合表面包含大量捕获组分。
82.权利要求71的物品或试剂盒，其中基底包含大约1，000-大约1，000,000个反应容器。
83.权利要求71的物品或试剂盒，其中基底包含大约10，000-大约100，000个反应容器。
84.权利要求71的物品或试剂盒，其进一步包含大量对照微珠。
85.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 将各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的大量捕获分子与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液相接触，其中至少一些捕获物变成连接于至少一个分析物分子或颗粒上； 将接触步骤中制备的大量捕获物与包含酶组分的大量结合配体相混合，使得统计学显著比例的连接于至少一个分析物分子或颗粒的捕获物连接单个结合配体； 将至少一部分经历混合步骤的捕获物在空间上划分入大量分隔的位置，以及 至少部分地通过指认至少一部分的经过空间划分步骤的大量位置以确定酶组分或涉及酶组分的反应产物的存在情况而确定流体样品中分析物分子或颗粒浓度的量度。
86.权利要求85的方法，其中分析物分子或颗粒为蛋白质。
87.权利要求85的方法，其中结合表面包含大量捕获组分。
88.权利要求85的方法，其中涉及酶组分的反应包括将酶组分与前体标记试剂接触。
89.权利要求88的方法，其中前体标记试剂在接触酶组分时转化为标记试剂。
90.权利要求89的方法,其中前体标记试剂为发色、突光或化学发光试剂。
91.权利要求85的方法，其中酶组分包含辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶。
92.权利要求85的方法，其中大量位置包含大量反应容器。
93.权利要求92的方法,其中大量反应容器形成于光纤束末端。
94.权利要求85的方法，其进一步包括确定在确定步骤中所指认的确定含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量。
95.权利要求94的方法，其进一步包括确定在确定步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物但确定不含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量。
96.权利要求94的方法，其进一步包括确定在确定步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物的位置数量。
97.权利要求94的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在确定步骤中所指认的确定含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量。
98.权利要求96的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在确定步骤中所指认的确定含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量相对在确定步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物的位置数量的比率。
99.权利要求95的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在确定步骤中所指认的确定含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量相对在确定步骤中所指认的确定含有包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面的捕获物但确定不含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量的比率。
100.权利要求94的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地基于在确定步骤中所指认的确定含有酶组分或涉及酶组分的反应产物的位置数量相对所指认的位置总数的比率。
101.权利要求85的方法，其中位置是光学指认的。
102.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 将大量分析物分子或颗粒固定化于大量微珠； 将所述大量微珠的至少一部分在空间上划分入大量分隔的位置； 指认所述大量位置中至少一些并确定含有微珠的位置数量； 进一步确定含有微珠及分析物分子或颗粒的所述位置数量；以及至少部分地基于含有微珠及分析物分子和颗粒的位置数量相对含有微珠的位置数量的比率而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
103.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 将大量分析物分子或颗粒固定化于大量微珠； 将所述大量微珠的至少一部分在空间上划分入大量分隔的位置； 指认所述大量位置中至少一些并确定含有微珠的位置数量； 进一步确定含有微珠及分析物分子或颗粒的所述位置数量；以及至少部分地基于含有微珠及分析物分子和颗粒的位置数量相对含有微珠但不含任何分析物分子或颗粒的位置数量的比率而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
104.权利要求102或103的方法，其中所述含有微珠的位置数量是使用光学技术确定的。
105.权利要求104的方法，其中所述含有微珠的位置数量是使用白光确定的。
106.权利要求104的方法，其中所述含有微珠及分析物分子或颗粒的位置数量是使用荧光确定的。
107.权利要求104的方法，其中光学技术包括使用CXD检测器。
108.权利要求104的方法，其中光学技术包括使用CID、CMOS、sCMOS、或TDI设备。
109.权利要求102或103的方法，其中大量位置包含大量反应容器。
110.权利要求109的方法,其中大量反应容器形成于光纤束末端。
111.权利要求102或103的方法，其中至少一部分的分析物分子或颗粒连接于至少一个结合配体。
112.权利要求102或103的方法，其中分析物分子或颗粒包含酶组分。
113.权利要求112的方法，其中结合配体包含酶组分。
114.权利要求102或103的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度低于大约50X 1(Γ15Μ、或低于大约40Χ 1(Γ15Μ、或低于大约30Χ 1(Γ15Μ、或低于大约20X 1(Γ15Μ、或低于大约10Χ1(Γ15Μ、或低于大约I X IO^15M0
115.权利要求102或103的方法，其中确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地通过比较所测量的参数和校准标准样而确定。
116.权利要求102或103的方法，其中在空间划分步骤中，将至少大约5%、或至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%的经过固定化步骤的捕获物在空间上划分入大量位置。
117.权利要求102或103的方法，其中在指认步骤中所指认的位置数量为位置总数的至少大约5%、或至少大约10%、或至少大约20%、或至少大约30%、或至少大约40%、或至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约80%、或至少大约90%。
118.权利要求102或103的方法，其中大量微珠各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面。
119.权利要求102或103的方法，其中在空间划分步骤后，将所述位置与前体标记试剂相接触。
120.权利要求119的方法，其中前体结合配体在接触结合配体时转化为标记试剂。
121.权利要求120的方法，其中含有包含分析物分子或颗粒或者标记试剂的捕获物的位置数量是通过确定包含标记试剂的位置数量而确定的。
122.权利要求120的方法,其中标记试剂为发色、突光或化学发光试剂。
123.权利要求102或103的方法，其中分析物分子或颗粒为蛋白质。
124.权利要求102或103的方法，其中分析物分子或颗粒为核酸。
125.权利要求109的方法，其中大量反应容器的平均体积为大约10阿升-大约100皮升。
126.权利要求109的方法，其中大量反应容器的平均体积为大约I飞升-大约I皮升。
127.权利要求102或103的方法，其中大量微珠的平均直径为大约O.I微米-大约100微米。
128.权利要求102或103的方法，其中大量微珠的平均直径为大约I微米-大约10微米。
129.权利要求102或103的方法，其进一步包括进行至少一次洗涤步骤。
130.权利要求109的方法，其进一步包括密封所述大量反应容器。
131.用于确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度的方法，包括 提供各自连接于单个分析物分子或颗粒或者不连接任何分析物分子或颗粒的大量捕获物； 单个地指认至少一部分的捕获物并确定连接于分析物分子或颗粒的所述捕获物数量；以及 至少部分地基于经过指认步骤确定连接于分析物分子或颗粒的捕获物的数量而确定流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度。
132.权利要求131的方法，其中捕获物各自包括对至少一种类型的分析物分子或颗粒具有亲和力的结合表面，且形成步骤包括将大量捕获物与含有或疑似含有所述至少一种类型的分析物分子或颗粒的溶液接触。
133.权利要求132的方法，其包括将分析物分子或颗粒固定化于大量捕获物的步骤，以使统计学显著比例的捕获物连接于单个分析物分子或颗粒而统计学显著比例的捕获物不连接任何分析物分子或颗粒。
134.权利要求133的方法，其包括从剩下的所述捕获物的部分中单个分离至少一部分的经过固定化步骤的捕获物的步骤。
135.权利要求134的方法，其中捕获物包含在至少指认步骤中液滴重悬其中的流体中不相混的液滴或各自包含在所述液滴之内。
136.权利要求131的方法，其中至少一部分的分析物分子或颗粒连接于至少一种结合配体。
137.权利要求131的方法，其中分析物分子或颗粒包含酶组分。
138.权利要求136的方法，其中结合配体包含酶组分。
139.权利要求131的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度低于大约50X 1(Γ15Μ、或低于大约40Χ 1(Γ15Μ、或低于大约30Χ 1(Γ15Μ、或低于大约20X 1(Γ15Μ、或低于大约10Χ1(Γ15Μ、或低于大约5Χ1(Γ15Μ、或低于大约1Χ1(Γ15Μ.
140.权利要求131的方法，其中流体样品中分析物分子或颗粒的浓度的量度至少部分地通过比较所测量的参数和校准标准样而确定。
141.权利要求131的方法，其中所述大量位置是使用光学技术指认的。
全文摘要
本发明涉及用于检测在流体样品中分析物分子或颗粒，以及在一些情况下确定所述流体样品中分子或颗粒的浓度的量度的系统和方法。本发明的方法可包括将大量分析物分子或颗粒固定化于大量捕获物上。将至少一部分的所述大量捕获物在空间上划分入大量位置。流体样品中分析物分子浓度的量度至少部分地基于包含固定化于捕获物的分析物分子的反应容器数而确定。在一些情况下，所述测定可另外包括包含结合配体、前体标记试剂和/或酶组分的步骤。
文档编号G01N33/543GK102884431SQ201180019462
公开日2013年1月16日 申请日期2011年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者D·C·达菲, D·M·里辛, D·R·沃尔特, D·福尼埃, C·坎 申请人:匡特里克斯公司