偶联分子于颗粒的制作方法
【专利说明】偶联分子于颗粒 发明领域
[0001] 本发明涉及连接靶分子(例如抗体、酶、链霉、A蛋白、G蛋白、脂蛋白或糖蛋白）与其 它分子(例如其它蛋白质、标签、染料、合成聚合物和/或纳米粒子）。更具体地，本发明涉及 一种方法，所述方法用于设计和生产具有可控比例的两种或多种分子(例如生物分子、标 签、染料、合成聚合物和/或纳米粒子)的颗粒偶联物。
[0002] 发明背景
[0003] 在生命科学研究的许多应用(例如药物研发和诊断）中，有必要采用简单的工艺将 生物分子，例如肽、蛋白质、多核苷酸和碳水化合物彼此连接，或者与小分子和生物(例如， 蛋白质和多核苷酸)药物、染料、标签、合成聚合物和纳米粒子连接。现有技术中已存在多种 方法（例如Hermanson等，生物结合技术：学术出版社，1996年（Hermanson，et al ·， Bioconjugate Techniques:Academic Press，1996))〇
[0004] 简言之，与生物分子形成多功能偶联物的两个关键要求是，最大程度降低对生物 分子功能的损害，以及控制形成偶联物的两种或多种分子的比例。这取决于相互连接的分 子的大小以及应用，可能仅需要将每种类型的一个分子彼此偶联。另一种方法是将一种类 型的多个分子偶联至更大的生物分子。例如，如果分子A和B需要彼此连接，无功能损害地形 成A-B，获得3个A-B在分子水平上不是那么简单的。很有可能的是，1个A可与1个、2个或更多 个B连接，并且类似地，1个B可与1个、2个、或更多个A连接。可能是A和B与其自身连接，以及， 作为多种连接的结果，也可能仍有完全不能与另一分子形成连接的A和B。根据进行偶联的 分子以及所使用的方法，产生了不同实体的群体，而在大多数情况下，在不同批次之间实现 均匀性和一致性是有挑战性的过程。
[0005]已经采用了许多不同的连接化学物质试图最大程度降低与生物分子形成偶联物 中一致性和再现性方面的困难。一种完全不同的形成偶联物的方法是，连接不同的分子至 一个共同的载体，例如一些纳米或微小尺寸的颗粒，而不是直接连接此类分子。例如，可以 在颗粒表面产生羧酸，用于含氨基的生物分子的反应，可以在颗粒上产生马来酰亚胺或溴 乙酰基团，用于与硫醇的反应，并且几乎任一连接方法可应用于颗粒表面形成两种或多种 不同分子的偶联物。然而，随着颗粒变得越来越小，均匀性和再现性这一同样的问题出现 了。在颗粒表面产生不同的官能团以获得正交偶联，有可能解决这些困难，但在最后，不同 官能团的形成需要从颗粒上共同的起始基团开始，均匀性和再现性这一同样的问题又出现 了。
[0006] 上述讨论的连接方法的示例见于Lim，l-I.s.等.（2008)纳米技术，第19卷，第1-11 页（Lim, I-I · S. et al · (2008)Nanotechnology，vol · 19，ρ· 1-11)，其中描述了蛋白质包裹金 和磁性氧化物/金核/壳纳米粒子的合成及表征。这篇文章中描述的体系都使用二硫代双 (琥珀酰丙酸）（DSP)将蛋白质连接至纳米粒子。出于上述原因，形成偶联物的新方法宜无需 使用这些类型的连接剂。
[0007] 说明书中参考的任何现有技术不是，也不应当认为是承认或任何形式的暗示，该 现有技术在任何司法管辖权限内形成公知常识的一部分，或者本领域技术人员能够合理预 期该现有技术并认为是相关的。
[0008] 发明综述
[0009] 本发明人发现，本发明的纳米粒子和微粒子能够连接分子、聚合物和其他颗粒以 得到预定的和期望的多功能实体，所述实体含有以各自特定比例存在的不同分子。
[0010] 因此，本发明涉及一种颗粒，包含：
[0011] -表面；
[0012] -至少部分包覆该表面的过渡金属离子;和
[0013] _第一靶分子和第二靶分子，其中所述第一和第二靶分子彼此不同，
[0014] 其中，所述颗粒是由一种或多种基材分子或多种原子形成，并且其中所述过渡金 属离子与颗粒表面的基材分子或原子颗粒，以及至少一个第一靶分子和至少一个第二靶分 子形成配位键，从而将第一和第二靶分子连接至颗粒上。
[0015] 在一实施例中，所述颗粒为纳米粒子。
[0016] 本发明也涉及一种组合物，包括：
[0017] -由一种或多种基材分子或原子形成的颗粒；
[0018] -具有与过渡金属离子形成配位键的基团的配体；
[0019] -与所述一种或多种基材分子或原子形成配位键的过渡金属离子。
[0020] 在一实施例中，组合物中包含的所述颗粒不具有连接于基材分子或原子以便连接 过渡金属离子的接头。所述组合物可进一步包括第一靶分子和第二靶分子，其中所述第一 和第二靶分子彼此不同。
[0021 ] 在一实施例中，所述颗粒为纳米粒子。
[0022] 本发明也涉及由多种过渡金属离子形成的颗粒，包括：
[0023] -表面；
[0024] -第一捕获分子和第二捕获分子，其中所述第一和第二捕获分子彼此不同；
[0025] 其中，在颗粒表面，所述颗粒的过渡金属离子与第一和第二捕获分子形成配位键， 从而将第一和第二捕获分子与颗粒连接。
[0026] 在一实施例中，所述第一捕获分子选自：蛋白质、多核苷酸、碳水化合物和药物。
[0027] 在一实施例中，所述第二捕获分子选自：蛋白质、碳水化合物、脂质、多核苷酸、药 物、标签剂、合成聚合物和纳米粒子。所述蛋白质可以为抗体或其片段。
[0028] 在一实施例中，所述颗粒为纳米粒子。
[0029] 本发明也涉及连接第一靶分子至第二靶分子的方法，所述方法包括：
[0030] -提供过渡金属离子；
[0031] -提供颗粒，其中所述颗粒具有表面，并且由一种或多种形成该颗粒的基材分子或 原子形成；
[0032] -提供预设比例的第一靶分子和第二靶分子；
[0033] -将过渡金属离子和颗粒与第一和第二靶分子接触，使得过渡金属离子与颗粒表 面的基材分子或颗粒原子，以及至少一个第一靶分子和至少一个第二靶分子形成配位键， 从而借助颗粒将第一和第二靶分子彼此连接。
[0034] 在一实施例中，所述第一捕获分子选自：蛋白质、多核苷酸、碳水化合物和药物。
[0035] 在一实施例中，所述第二捕获分子选自：蛋白质、碳水化合物、脂质、多核苷酸、药 物、标签剂、合成聚合物和纳米粒子。所述蛋白质可以为抗体或其片段。
[0036] 在一实施例中，所述颗粒为纳米粒子。
[0037] 附图简述
[0038]图1.加入金属复合物活化的500nm颗粒的悬浮液的抗体量与FACS Canto II仪器 的输出信号(荧光单位，y轴)成正比。
[0039]图2.向金属复合物活化的200nm颗粒中滴定链霉亲和素-加载生物素化小鼠 IgG/ GAM-HRP。也显示了包覆链霉亲和素的Ιμπι磁性颗粒(Merck和Dynal MyOne Cl)。
[0040]图3.向金属复合物活化的200nm颗粒中滴加链霉亲和素和小鼠 IgG-加载生物素化 小鼠 IgG/GAM-HRP〇
[00411图4.向金属复合物活化的200nm颗粒中滴加链霉亲和素和小鼠 IgG-加载生物素化 RPE0
[0042]图5.向金属复合物活化的200nm颗粒中滴加链霉亲和素和小鼠 IgG-加载生物素化 小鼠 IgG并且由山羊抗小鼠 RPE检测。
[0043]图6.化学发光分析数据检测特定浓度的与M270Dyna珠偶联的阻断和未阻断生物 素化-山羊抗人的信号输出。
[0044] 图7.特异性信号与非特异性信号与噪声比的比较。
[0045] 图8.不同浓度的山羊抗小鼠 IgG和BSA对MyOne(Dynal，Ιμπι)颗粒共偶联的信号输 出。
[0046] 图9.凝集实验前的M270(3ym)、My0ne(lym)和Merck 200nm颗粒。左边:室温下保温 1小时后的M270 (3μπι，较大颗粒）和MyOne (Ιμπι，较小颗粒）；右边：室温下保温1小时后的 Merck 200nm颗粒。
[0047] 图10.室温下保温1小时之后的M270、My0ne、Merckbead混合物的图片。可清晰地发 现颗粒凝聚(大颗粒连接至小颗粒）。
[0048]图11.链霉亲和素和BSA共偶联于金属复合物活化的氧化铁纳米粒子上的特异性 连接和背景。
[0049] 图12.不同浓度的小鼠 IgG偶联于金属复合物活化的氧化铁纳米粒子上的信号和 背景噪音。
[0050] 图13.使用山羊-抗小鼠-偶联RPE将链霉亲和素和小鼠 IgG共偶联于氧化铁纳米粒 子以便(检测)荧光信号输出。
[0051 ]图14.使用生物素-偶联RPE将链霉亲和素和小鼠 IgG共偶联于氧化铁纳米粒子的 以便(检测)荧光信号输出。
[0052]图15.将抗体偶联于金属复合物活化的金纳米粒子的试纸检测。
[0053]图16.采用在金属复合物活化的磁性颗粒上检测抗TNF-alpha抗体和辣根过氧化 物酶进行TNF-alpha夹心免疫测定。
[0054]图17.量子点（QDot)偶联于金属复合物活化的磁性颗粒以便（检测）荧光信号输 出。
[0055]图18.与或不与量子点(QDot)偶联的金属复合物活化的磁性颗粒的TEM图像。
[0056] 发明详述
[0057]总体上，本发明出乎意料地发现，使用金属复合物活化的纳米粒子和微粒子(有高 反应活性)可用于连接分子、聚合物和其他颗粒，以产生含有不同分子的多功能实体。重要 的是，这些分子在每个颗粒上的比例是可控的，以得到在整个颗粒群体中，其上连接有特定 比例的不同分子的颗粒的一致分布。
[0058] 连接生物分子至不同表面的一种方法是使用金属复合物，例如用于固定化金属亲 和色谱层析（MAC)的那些，这是一种公知的方法，或者如PCT/AU2005/00966中描述的方法 (公开号为W0 2006/002472)。具体地说，该PCT申请中描述的金属复合物允许强有力但温和 的连接反应，从而最大程度降低在所有不同的表面上对生物分子(例如蛋白质）的损害。
[0059] 在此方面，所述金属复合物活化颗粒可看作是一种可促进不同分子、聚合物或颗 粒通过颗粒或纳米粒子彼此连接的交联剂形式。本质上，所述金属复合物活化纳米粒子和 微粒子作为中间体，所述中间体控制形成多功能实体的不同分子的总数、密度和比例。假定 所述实体是nA-X-mB的形式，其中X为颗粒，且A和B为，例如不同的生物分子、聚合物或纳米 粒子