B.偶联链霉亲和素(含BSA)至金属复合物活化纳米粒子
[0144]使用如，在40mM偶联缓冲液中制备偶联的蛋白质。以不同比例偶联链霉未和素和 BSA的混合物以活化纳米粒子，并且它们的终浓度列于下页表中： 「01451
[0146] 含蛋白质混合物的试管低速(利用IKA Vortex GENIUS 3,3号设置)连续涡旋，同 时将50yL的洗涤颗粒缓慢加入50yL蛋白质溶液，如上表所列。将该颗粒溶液涡旋30秒，并且 水浴超声5分钟。在室温下将该颗粒溶液旋转(旋转器设定F5-90)温育1小时。通过磁分离， 用偶联缓冲液(pH 8)洗涤颗粒2次。将颗粒在水浴中超声5分钟。然后在显微镜下检查颗粒 (5yL样品在45yL偶联缓冲液中稀释）。通过连接至生物素-辣根过氧化物酶来检测样品，用 多模分光光度计(TECAN infinite M200PR0)读数，以相对化学发光单位作为信号输出，如 图11所示。
[0147] 结果（图11)表明，通过改变加载至金属复合物活化纳米粒子的链霉亲和素浓度， 随着链霉亲和素浓度增加，连接容量相似，而BSA作为共偶联阻断剂没有明显的效果。样品 3.1中信号下降是由于凝集作用以及该过程中颗粒的丢失。使用BSA作为共偶联剂似乎干扰 了链霉亲和素的连接，在实施例2的B部分中显示出了类似的效果。所有的六个样品都显示 出了非常低的背景，表明纳米粒子完全加载或被蛋白质阻断。样品3.4和3.6的结果表明，直 接偶联至金属复合物活化表面的链亲和素的数量可控制，而无需额外的pH调节或化学成分 改变。
[0148] C.偶联小鼠 IgG(与BSA阻断剂)至金属复合物活化纳米粒子
[0149] 在使用前制备偶联蛋白溶液。将小鼠 IgG与BSA的混合物以下表列出的不同比例偶 联到金属复合物活化的纳米粒子： rmsni
[0151] 重复实施例3中B部分的偶联步骤。通过连接至山羊抗小鼠偶联辣根过氧化物酶检 来测样品，用多模分光光度计(TECAN infinite M200PR0)读数，以相对化学发光单位作为 信号输出，结果不于图12。
[0152] 结果（图12)表明，通过改变加载至金属复合物活化纳米粒子的抗体浓度，随着小 鼠 IgG偶联浓度的升高，连接力随之增强，而作为共偶联阻断剂的BSA没有明显效果。所有的 五个条件均显示出很低的背景，表明纳米粒子纳米粒子完全加载有蛋白质或被蛋白质阻 断。也表明，与BSA相比，小鼠 IgG具有更强的连接亲和力。因此，结果证明，小鼠 IgG与氧化铁 纳米粒子的连接亲和力可被控制，并且在偶联步骤中，通过简单的蛋白质浓度滴定也实现 了阻断剂的共偶联，而无需额外的pH调节或者化学成分改变。
[0153] D.抗体和链霉亲和素偶联至金属复合物活化纳米粒子
[0?54]使用如，在40mM偶联缓冲液中制备偶联蛋白质。链霉未和素和小鼠 IgG的混合物按 照下表所示不同比例偶联至金属复合物活化纳米粒子：
[0156] 此外，BSA或者PEG按照下表所示不同比例偶联至活化纳米粒子：
[0157]
[0158] 重复实施例3中B部分的偶联步骤。通过连接至生物素-REP或者山羊抗小鼠 RPE来 检测样品，用多模分光光度计(TECAN infinite M200PR0)读数，以相对化学发光单位作为 信号输出。结果示于图13和图14。
[0159] 图13和14中的结果都表明，特异性信号输出与小鼠 IgG或链霉亲和素偶联浓度的 升高密切相关。在图13和14中，两个阴性对照（200yg BSA/mg颗粒和lmg PEG/mg颗粒)按照 预期运行，显示出了相对较低的背景。这一结果也证明了共偶联至金属复合物活化颗粒的 大分子，例如链霉亲和素和小鼠 IgG的量在偶联步骤中可通过简单的蛋白质浓度滴定进行 控制，而无需额外的pH调节或者化学成分改变。
[0160] 实施例4:在金纳米粒子上的金属复合物，并随后连接至抗体
[0161 ]本实施例的目的是要证明，金属复合物活化金纳米粒子可连接至一个或两个例如 抗体的大分子。
[0162] 两个金纳米粒子样品来自西格玛奥德里奇公司-Sigma Aldrich。第一，表面活性 剂稳定的金纳米粒子储存在柠檬酸缓冲液中；第二，裸露的金纳米粒子储存在PBS缓冲液 中。两个样品都进行浓缩，将过量的上清液移除。所述纳米粒子然后重悬于水中。室温下，金 纳米粒子在金属复合物中在0D1活化1小时。通过离心分离冲走过量金属服合物。在偶联步 骤中设置下列条件，每lmL的0D1金纳米粒子：
[0163] # 样品4.1:3.2yg 人IgG 抗体；
[0164] ?样品4 · 2:3 · 2yg 小鼠 IgG 抗体；
[0165] ?样品4 · 3:1 · 6yg 人IgG加上 1 · 6yg小鼠 IgG。
[0166] 在10mM MES缓冲液pH 6.0条件下制备每种抗体，抗体偶联并在室温下温育30分 钟。浓缩偶联样品并重悬于2mM的硼砂缓冲液pH9.0。使用带有山羊抗小鼠抗体、抗人IgM和 抗人IgG条纹的试纸条(基于硝酸纤维素)来检测加载在金属复合物活化的金纳米粒子上的 抗体。偶联抗体的金样品用含1 % Tween-20的PBS缓冲液稀释到0D1。50yL每个样品载入96孔 平板中，然后将试纸条放入每个孔，再运行10分钟。
[0167] 结果显示在图15中。从该结果中，每个设定中的样品顺序从左到右为（1)、（2)和 (3)。柠檬酸缓冲金纳米粒子(CN)外观与PBS缓冲样品类似。在每个活化条件下，在单一和组 合抗体偶联中，对应于抗人IgG标记的谱带都比山羊抗人谱带浅的多。与单一抗体偶联的样 品的试纸条谱带强度与共偶联样品的强度相差无几，并没有观察到非特异性。正如预期的， 样品4.1和4.2都显示出了单一谱带，不带有可观测的非特异性结合。样品4.3显示了两条谱 带，强度类似于样品4.1和4.2,这表明小鼠 IgG和人IgG都偶联至金纳米粒子，并且该颗粒没 有被第一抗小鼠 IgG线捕获，而是流经到被抗人IgG线捕获。这一结果表明，使用金属复合物 活化方法，一种或两种不同的抗体偶联至金纳米粒子，并且可被横向流动抗体免疫分析检 测到。
[0168] 实施例5:在200nm磁纳米粒子上的金属复合物，随后连接至抗体和酶 [0169]本实施例的目的是要证明，金属复合物活化200nm磁性纳米粒子，例如Merck (200nm)纳米粒子，可同时连接至一种抗体和一种酶（例如，抗TNFa抗体和辣根过氧化物 酶)。
[0170]金属复合物活化200nm磁颗粒的制备已在实施例2A中描述。抗TNFa抗体(20yg/mg 颗粒）与辣根过氧化物酶（20yg/mg颗粒）共偶联至金属复合物活化200nm磁颗粒，并且由 0· 1 %BSA封闭。在碳酸缓冲液pH 9·5中，Maxisorp板(来自NUNC)用TNF-a抗原以〇·39，6·25 和100ng/mL的浓度包覆1小时。然后将板用含1 % BSA的PBS 7.2中封闭1小时。抗体-HRP偶联 颗粒(25yg/mL)在试验缓冲液BSA PBS pH 7.2中稀释，并加入包覆有TNF-α的ELISA孔中，在 室温下温育1小时。用roS pH 7.2(含0.05%TWeen-20)洗涤板三次，然后向每孔中加入100μ L PS-Atto(PierCe)化学发光底物，摇动1分钟，再用多模分光光度计（TECAN infinite M200PR0)读数，以相对化学发光单位作为信号输出。背景校正结果示于图16。图16的结果表 明，特异性信号输出与板上的TNF-a包覆量密切相关。这一结果也证明了，抗TNF-a抗体和 HRP都偶联至同一颗粒，以进行抗体抗原连接和HRP起到检测酶的作用来产生信号。这也证 明，金属复合物活化磁性纳米粒子可将两种不同的大分子(抗体和酶）同时偶联至一种颗粒 上，并且二者在偶联之后都表现出功能性。
[0171] 实施例6:在磁性纳米粒子上的金属复合物，并且随后连接至QDot纳米粒子 [0172]本实施例的目的是要证明，金属复合物活化200nm磁性纳米粒子，例如Merck (200nm)纳米粒子可连接至其他纳米粒子(例如，量子点）。
[0173] 金属复合物活化200nm磁颗粒的制备已在实施例2A中描述。混合量子点800 (羧酸 改性，生命技术公司-Life Technologies)1000pmol/每mg磁性颗粒，室温下温育1小时。用 水冲洗过量的QDot，QDot偶联的金属复合物活化磁性颗粒用多模分光光度计（TECAN infinite M200PR0)在激发415nm和发射800nm处读数。图17显示了与金属复合物活化磁性 颗粒相比，QDot强度信号对噪声比的结果。标准化后，信噪比为5570:1，这表明QDot已经成 功地偶联至金属复合物活化磁性颗粒，证明所述金属复合物活化表面可以连接至另一纳米 粒子，例如QDots。
[0174] 对这些样品进行透射电子显微镜(TEM)成像。在1-2分钟内，将一滴样品加至碳包 覆铜TEM网格上，过量的部分除去。然后在5-60秒内，施加一滴着色剂，铀酰乙酸盐或钼酸 铵，过量的部分除去。使用铀酰乙酸盐达到了最好的效果。对所有样品施加80kV的加速电压 和x600,000的放大率，以达到<2nm的分辨率。图18显示TEM的结果。TEM结果显示金属复合物 活化表面是光滑的，QDot偶联磁性颗粒在表面上具有QDot尺寸，如箭头所指。这证明了羧酸 表面改性量子点已经成功偶联至金属复合物活化磁性颗粒上，并且可以观察QDot信号强度 特征。
【主权项】
1. 一种颗粒，包括： -表面； -至少部分包覆所述表面的过渡金属离子;和 -第一靶分子和第二靶分子，其中所述第一和第二靶分子彼此不同， 其中所述颗粒由构成该颗粒的一种或多种基材分子或原子形成;和 其中，所述过渡金属离子与所述颗粒表面的基材分子或原子、以及至少一个第一靶分 子和至少一个第二靶分子颗粒形成配位键，由此将所述第一和第二靶分子连接至所述颗 粒。2. 如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒为纳米粒子。3. 如权利要求1或2所述的颗粒，其特征在于，所述基材分子选自：合成聚合物、金属或 类金属复合材料、生物材料、陶瓷、玻璃和金属氧化物。4. 如权利要求3所述的颗粒，其特征在于，所述合成聚合物选自：聚苯乙烯、环烯烃共聚 物、聚碳酸酯聚乙烯醚、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚偏二氟乙烯和聚乙烯醇。5. 如权利要求3所述的颗粒，其特征在于，所述金属复合材料为钢，或者，所述类金属复 合材料由金、银、铂、铱、钛、铝、陶瓷、二氧化硅和用于产生量子点的那些材料构成。6. 如权利要求3所述的颗粒，其特征在于，所述生物材料为生物聚合物。7. 如权利要求6所述的颗粒，其特征在于，所述生物聚合物为取代的多糖。