专利名称：源自生药的成分的高灵敏度定量方法
技术领域：
本发明涉及用于对生物样品中的甘草甜素及其代谢物等高灵敏度地进行定量的方法。本申请基于并要求于2010年11月16日提交的日本专利申请2010-256187号的优先权，并将其全部内容结合于此，作为参考。
背景技术：
甘草甜素(以下简称GL)及其盐是具有抗过敏作用、抗炎症作用、以及免疫调剂作用、肝细胞损害抑制作用、肝细胞繁殖促进作用、病毒繁殖抑制作用/灭活作用等多种多样生理活性的甘草根提取成分。在日本，自古以来被用作中药等的临床药物，现在被广泛用于治疗慢性肝脏疾病、湿疹/皮炎、婴儿苔癣、圆形脱毛症(円形脱毛症)、各种过敏、炎症等。并且，作为除医药品之外的用途，由于GL具有耐盐(塩々&)效果并具有甜味效果，因此作为甜味剂多用于腌菜和调料等众多食品。根据非临床试验的结果认为，GL具有容易积聚在肝脏且迅速被排泄至胆汁中的特性，并一边进行代谢以及肠肝循环一边被排出。特别是口服给药中，作为配糖体(配糖体)的水溶性极性物质的GL显示低吸收性，同时由于被肠道细菌代谢和首过效应，在末梢血液中的浓度极低。因此，为了测定GL的血液 中的动态，迄今为止已经尝试过各种各样的方法，但是难以检测服用含GL的制剂、掺合甘草的中药制剂时血液中的GL，长期以来也不清楚其动态。例如，存在以下测定方法:对采自口服GL后的健康者的血浆，进行甲醇处理除去蛋白质后，通过酶免疫法(EIA)测定该血浆中的GL的量的方法；以及利用采用了十八烷基化学结合型(ODS)柱等具有反相分配功能的柱的高速液相色谱法(HPLC)的测定方法(例如非专利文献I 4)。但是，这些测定方法中，定量临界值最多为0.1 u g/mL左右，即使能够检测出作为主代谢物的甘草次酸(以下简称为GA)，也无法检测出GL。因此，根据从尿中检测的示例，间接证明了 GL的血液中转移(参照非专利文献4)。于是，对含GL的制剂的药效，以可定量的GA代替GL作为评价指标。在先技术文献非专利文献非专利文献1:石渡(^ 7夕)，其他7名，《生化及药剂学期刊》(才口 'I力)v 了 'y Y 7 7 一'y 3-一 r -1 力卟 7'' r > (Biological and PharmaceuticalBulletin))，2000 年第 23 卷第 8 号第 904 905 页。非专利文献2 -M 格鲁特(De Groot)，其他I名，《色谱法杂志》(夕\ 一 f > 才 /' 夕口卜夕9 7 ^ — (Journal of Chromatography)), 1988 年第 456 卷第 71 81 页。非专利文献3:中田(f力夕)，其他3名，《和汉药学会志》(和漢医薬学会誌)，1986年第3卷第3号第278 279页。非专利文献4:山村(W A 9 )，其他7名，《美国药学杂志》(一 f > 才7'' 7 T 一 ■ '> 工一 r -1 力卟 寸 4 工 > 文' (Journal of Pharmaceutical Sciences)),1992年第81卷第10号第1042 1046页。
发明内容
发明要解决的技术问题作为活性主体的原形药物GL的药代动力学，在根据有效性、安全性判断为恰当使用后，是有用的。为此，希望不以GA为评价对象，而能够对血浆等生物样品中的GL量进行定量。鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供用于检测血浆等生物样品中的GL并进行定量的方法。解决技术问题的技术方案为解决上述技术问题，本申请各发明人进行了深入研究，结果发现，首先，利用采用了具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相的固相提取法从生物样品中提取出含有GL的成分后，通过质谱法分析提取物中的GL，能够检测并定量生物样品中的GL，至此完成本发明。
·
S卩，本发明提供以下内容:(I) 一种源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，具有:提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液对上述固相清洗至少一次，之后利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由上述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量，其中，上述清洗液是选自由水、碱、醇及乙腈组成的组中的一种或两种以上的混合液。(2)上述(I)所记载的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，在上述提取工序中，通过用碱和醇和水的混合液清洗后，再用醇、醇和水的混合液、或者乙腈进行清洗，以进行固相的清洗。(3)上述(2)所记载的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，上述碱和醇和水的混合液是将按体积计0.5% 28%的氨水和甲醇以99:1 1: 3混合后形成的混合液。(4)上述(I) (3)中任一项所记载的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，上述生物样品是血液、血浆或者组织提取物。发明效果根据本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，能够检测含量非常少的生物样品中的GL，并进行定量。因此，通过利用本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，能够对从摄取含有GL的制剂或饮食的人身上采取的生物样品中的GL进行定量，并能够高精度地解析药代动力学。
图1A是表示实施例6中空白血浆样品中的GL的色谱图。图1B是表示实施例6中空白血浆样品中的GA的色谱图。图1C是表示实施例6中空白血浆样品中的内部标准(IS)的色谱图。图2A是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品(血浆中的GL添加量:
0.5ng/mL)中的GL的色谱图。图2B是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品(血浆中的GA添加量:2ng/mL)中的GA的色谱图。图2C是表示实施例6中，添加有标准溶液(G)的血浆样品中的IS的色谱图。图3是表示实施例7中GL的平均血药浓度变化的图。 图4是表示实施例7中GA的平均血药浓度变化的图。
具体实施例方式本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法的特征在于，通过采用了具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相的固相提取法提取出生物样品中的GL之后，通过质谱法对得到的提取物中的GL含量进行定量。通过利用质谱法代替现有的HPLC法等进行定量，能够提高GL的检测灵敏度。并且，不利用采用现有的ODS柱这种仅具有反相分配功能的固相的固相提取法，而是利用具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相进行制备，由此能够从供质谱分析的提取物中除去更多的异物，从而能够大幅地提高质谱分析的灵敏度。具体而言，本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法的特征在于，包括:提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相后，用清洗液清洗上述固相一次或两次以上，之后利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由上述提取工序提取的提取物中的GL、GA、GL及GA的代谢物、GL及GA的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及选自由上述物质的药学上可接受的盐构成的组中的至少一种进行检测，并定量，上述清洗液是选自由水、碱、醇以及乙腈构成的组中的一种或两种以上的混合液。优选上述提取工序中制备含有至少两种源自生药的成分的提取物，优选上述定量工序中在一次测定(检测模式除外)中对至少两种成分进行检测、定量。根据本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法定量的源自生药的成分是选自由GL、GA、GL及GA的代谢物、GL及GA的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及上述物质的药学上可接受的盐构成的组(以下有时称为“GL等”)中的至少一种。作为GL及GA的代谢物，例如可以列举出:3_单葡萄糖醛酸甘草次酸(20 P -羧基-1 1-氧代-30-正齐墩果-12-烯-3 P -基-P -D-吡喃葡糖醛酸)、30-单葡萄糖醛酸甘草次酸(3 P -羟基-1 1-氧代齐墩果-12-烯-30-酰基-P -D-吡喃葡糖醛酸)、3-氧代-GA (3，Il- 二氧代齐壤果_12_稀-30-酸)、3 a -GA(3 a-轻基-11-氧代齐壤果-12-稀-30-酸)、3位的结合硫酸盐(3 P -羟基磺酰氧基-11-氧代齐墩果-12-烯-30酸)、3 P，22 a - 二羟基-11-氧代齐壤果-12-稀-30-酸以及3 ^ , 24- 二轻基-11-氧代齐壤果-12-稀-30-酸
坐寸o另外，作为GL及GA的类似物，例如可以列举出:20 a -羧基-11-氧代-29-正齐墩果-12-烯-30-基(P-D-吡喃葡萄糖基熊果酸)_(1 — 2)-D-吡喃葡糖醛酸、20 ^ -羧基-24-羟基-11-氧代-30-正齐墩果-12-烯-3 P -基(P -D-吡喃葡萄糖基熊果酸)-(I — 2) - P -D-吡喃葡糖醛酸、18 a -GL (20 ^ -羧基-1 1-氧代-(18 a H) -30-正齐墩果-12-烯-33-基W-D-批喃葡萄糖基熊果酸)-(1 — 2)-D-吡喃葡糖醛酸)、18 a -GA(3^-羟基-11-氧代-(18 a H)-齐墩果-12-烯-30-酸)等。另外，作为甘草中含有的皂苷成分，例如可以列举出:甘草皂苷Cl (203-羧基-11-氧代-30-正齐壤果-12-稀-3 0 -基(0 -D-卩比喃匍萄糖基熊果酸)-(I — 2) - P -D-吡喃葡糖醛酸)等。本发明中采用的GL等的药学上可接受的盐只要是在生物体内具有与GL等相同的药理效果的盐，则并未特别限定。具体而言，可以列举出例如铵盐、钠盐、钾盐等。本发明中，可以对GL等当中的一种进行定量，也可以在一次操作中对GL等中的两种以上进行定量。本发明中特别优选同时对GL和GA进行定量。提供给本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法的生物样品，以从生物体采取的试料为好，优选为从人体、或者小鼠、大鼠等动物身上采取的试料。另外，可以是血液、血浆、血清、尿、腹水、胸水、关节液、骨髓液、胆汁等，也可以是从肝脏、或胰腺、肾脏等组织采取的组织块等的提取物(组织提取物)。组织块等的提取物可以利用常规方法通过均质化而制备。本发明中，优选为血液、血浆、尿或组织提取物，更优选为血浆。以下，按照每个工序对本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法进行说明。作为提取工序，首先制备在碱或醇中混合生物样品后得到的混合物。作为生物样品中添加的碱，只要是能够使得到的混合物的PH为碱性的物质，则并未特别限定，例如可以列举出氨、氨水、氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液等。另外，作为醇，优选碳数为I 6的低级醇，可以列举出甲醇、乙醇、异丙醇等。也可以是用水稀释的醇溶液。本发明中，作为生物样品中添加的碱或醇 ，优选为氨、氨水、甲醇、或甲醇水溶液，更优选为氨或氨水。生物样品中添加的氨水的浓度并未特别限定，可以考虑生物样品的种类、其后使用的固相的种类、得到的混合物的氨浓度等之后，进行适当的调整。本发明中，生物样品中添加的氨或氨水的浓度，优选为使得到的混合物的氨浓度按体积计达到0.01% 30%的浓度，更优选为使其达到0.05% 25%的浓度，进一步优选为使其达到0.05% 20%的浓度。其次，将得到的混合物注入具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相中，使该混合物中的GL等吸附在固相上。作为具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相，例如可以列举出反相分配-阴离子交换混合模式固相萃取柱、Oasis MAX(沃特世公司制)等。用清洗液清洗吸附有GL等的固相一次或两次以上，除去非特异性结合的成分。清洗液是选自由水、碱、醇以及乙腈构成的组中的一种或两种以上的混合液。作为清洗液使用的碱或醇，可以列举出与生物样品中添加的碱或醇相同的物质。另外，固相的清洗，可以用相同的清洗液进行两次以上，也可以用不同的清洗液依次清洗。本发明中，固相的清洗优选为通过利用碱和醇和水的混合液、碱和水的混合液、或者水清洗之后，再利用醇、醇和水的混合液、或者乙腈清洗而进行，更优选为通过利用碱和醇和水的混合液清洗之后，再利用醇、醇和水的混合液、或者乙腈清洗而进行。作为碱和醇和水的混合液，优选为氨和醇和水的混合液，更优选为氨和甲醇和水的混合液。
氨和甲醇和水的混合液中的各成分的组成比，只要是能够保持使GL等吸附于固相的状态的组成比，则并未特别限定。例如，优选为混合液中的甲醇浓度按体积计为1% 75%、氨浓度为0.1% 21%，更优选为甲醇浓度为25% 75%、氨浓度为0.1% 21%。这种组成比的混合液例如可以通过使按体积计为0.5% 28%氨水和甲醇以99:1 I: 3的比例混合而制备。利用碱和醇和水的混合液进行第一次清洗之后,作为第二次清洗使用的清洗液，优选使用醇，更优选使用甲醇或乙醇，进一步优选使用甲醇。之后，通过利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物。作为酸性化溶剂可以列举出甲酸醇、盐酸、三氟乙酸等。本发明中优选为甲酸醇。作为用作洗脱液的甲酸醇，优选为甲酸和碳数为I 6的低级醇的酯，更优选为甲酸甲醇或甲酸乙醇，进一步优选为甲酸甲醇。另外，为了以后的质谱分析，将得到的洗脱物蒸发干燥。其次，作为定量工序，通过质谱法对经由提取工序提取的提取物中的GL等进行检测并定量。作为质谱法，优选为通过LC-MS (液相色谱/质谱)法或者LC-MS/MS (液相色谱/串联质谱)法进行。具体而言，将蒸发干燥后的洗脱物溶解于LC的流动相之后，进行LC，再进行MS。LC-MS以及LC-MS/MS可以通过使用由HPLC和质谱仪组合成的装置而进行。如专利文献I 4所记载，优选使用ODS柱等具有反相分配功能的柱进行LC。另夕卜，MS可以利用常规方法进行。例如通过ESI (电喷雾电离)法或APCI (大气压化学电离)法将试料离子化之后，通过磁偏转型、四级杆型、飞行时间型等质谱装置分离检测各离子。通过利用LC-MS法进行质谱分析，例如能够使血液、血浆、或血清中的GL等的定量极限改善至20ng/mL左右。同样，通过利用LC-MS/MS法进行质谱分析，能够使血液等中的GL等的定量极限提高至10ng/mL以下,例如0.5ng/mL左右。市售试剂的大量口服给药(GL为1600mg)中的血浆中GL浓度约为500ng/mL左右的情况已经被报道(《环境卫生展望》102 (9), 65-68,1994 (Environmental HealthPerspectives, 102(9) ,65-68,1994))。基于该见解进行的比例计算的结果，当以治疗肝病为目的时，计算出与临床常用量即给药量75mg相当的推测血液中浓度为大约23ng/mL。即，通过本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，能够对利用现有方法不可能检测出的血液中的GL进行定量。特别是，口服摄取GL制剂等后的血液中的GL浓度，个体差别大，利用定量极限不够的测定法，出现血液检体无法检测出GL的情况、以及无法测定长时间的药物动态、测定精度和测定结果可靠性不够的情况，但通过本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，特别是通过利用LC-MS/MS法进行质谱分析，能够得到可靠性更高的测定结果。实施例接着，列举实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不仅限于以下实施例。实施例1通过LC-MS法进行质谱分析从而进行本发明的源自生药的成分的高灵敏度定量方法时，对血浆中的GL以及GA的定量临界值进行测定，并制作成标准曲线。标准溶液的制备首先，准确称量GL (常盘植物化学研究所制)10.0mg，溶解于甲醇后，准确地制成IOOmL,从而制备成100 u g/mL的GL标准原液。同样，准确称量GA (阿尔佩斯药品工业株式会社制)10.0mg,溶解于甲醇后,准确地制成IOOmL,从而制备成100 u g/mL的GA标准原液。其次，分别准确地取GL标准原液2mL以及GA标准原液8mL，利用甲醇准确制成50mL,从而制备成GL浓度为4000ng/mL、GA浓度为16000ng/mL的标准溶液(A)。用甲醇依次稀释该标准溶液A,制备成表I所记载的标准溶液(B) (F)。分别制备标准原液以及标准溶液之后进行冷藏保存(5±4°C)。制备器具使用的是玻璃器皿。表I
权利要求
1.一种源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，具有: 提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液对所述固相清洗至少一次，之后利用酸性醇从所述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及 定量工序，通过质谱分析法对经由所述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量， 其中，所述清洗液是选自由水、碱、醇及乙腈组成的组中的一种或两种以上的混合液。
2.根据权利要求1所述的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于， 在所述提取工序中，通过用碱和醇和水的混合液清洗后，再用醇、醇和水的混合液、或者乙腈进行清洗，以进行固相的清洗。
3.根据权利要求2所述的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于， 所述碱和醇和水的混合液是将按体积计0.5% 28%的氨水和甲醇以99:1 1: 3混合后形成的混合液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于， 所述生物样品是血液、血浆或者组织提取物。
全文摘要
源自生药的成分的高灵敏度定量方法包括提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液至少对所述固相清洗一次，之后利用酸性醇从所述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由所述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量。
文档编号G01N30/06GK103210308SQ20118005481
公开日2013年7月17日 申请日期2011年11月15日 优先权日2010年11月16日
发明者铃木加代子, 铃木恒阳, 冢原路子, 春田裕子, 八田明, 浜田雄二, 井上秀雄 申请人:米诺发源制药株式会社