专利名称：一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析检测方法
技术领域：
本发明涉及沙拉沙星的一种荧光偏振免疫分析方法，属于荧光偏振免疫分析检测技术领域。
背景技术：
沙拉沙星(Sarafloxacin, SAR)属于动物专用的氟喹诺酮类药物,药用其盐酸盐，具有广谱抗菌、活性强、毒副作用小等特点，主要用于治疗鸡、猪的敏感细菌及支原体感染所致的疾病。据报道，盐酸沙拉沙星的半衰期较长，在食品动物中的残留会引起耐药性，过量的药物残留也会直接危害动物及人体健康。我国规定动物性食品中兽药沙拉沙星的最高残留限量不超过80 u g/kg。目前，用于(氟)喹诺酮类药物检测的主要方法有四大类微生物法、仪器分析法、化学发光分析法及免疫分析法。微生物法适用于检测高浓度的药物残留，主要用于大量样品的快速筛选；常用的仪器分析法有高效液相色谱法、液-质联用分析法、高效毛细管电泳法等；此类分析法虽然具有高效、灵敏、快速准确的特点，但是使用的仪器昂贵，而且样品前处理较繁琐，不适合大量样品的快速检测；免疫分析法主要包括酶联免疫吸附法、免疫亲和柱色谱分析法、免疫传感器分析法等。免疫分析法准确性好、灵敏度和特异性高、快速准确，可用于大量样品的快速检测，因此免疫分析法尤其是酶联免疫吸附分析法(ELISA)现已广泛应用于小分子农药以及兽药的快速筛选残留检测。但是ELISA法大多属于非均相的免疫分析法，由于在操作过程中需要分离结合的和未结合的抗原(抗体)或酶标记物，耗时较长，所以迫切需要发展一种更加简便快速的分析方法。突光偏振免疫分析法(fluorescencepolarization immunoassay, FPIA)则具备了这一特点，是一种快速、简便、高效、可靠的分析方法，而荧光偏振免疫分析法的关键是小分子荧光标记物的成功制备以及需要高特异性的抗体，当二者同时具备时，即可通过待测沙拉沙星和沙拉沙星荧光标记物同时竞争结合沙拉沙星抗体时偏振值的变化(竞争法)进行沙拉沙星的荧光偏振免疫分析，而国内尚未有关沙拉沙星荧光标记物的制备以及沙拉沙星荧光偏振免疫分析方法建立的报道。
发明内容
本发明的目的是解决传统分析方法操作复杂费时的问题，提供一种沙拉沙星荧光标记物的制备方法以及利用荧光标记物和高特异性的抗体建立的沙拉沙星荧光偏振免疫分析方法。本发明提供的沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，利用沙拉沙星作为半抗原偶联FITC荧光素合成荧光标记物，并以沙拉沙星标准品，沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，步骤如下(I)沙拉沙星荧光标记物的制备a.称取3 4mgSAR溶于由100 ii L水、500 ii L甲醇、50 U L三乙胺组成的混合溶剂中形成A液；b.称取6mg异硫氰酸突光素FITC溶于600 U L甲醇中形成B液；C.取200 i! LB液逐滴加入A液中，震荡，室温避光过夜；d.次日，以CHCl3 MeOH = 2 I (V/V)为展开剂，室温下对c步的反应液进行薄层层析，分离纯化，紫外投射仪下观察，选择Rf = 0. I的条带，用120 UL甲醇萃取，得到沙拉沙星荧光标记物；(2)沙拉沙星荧光标记物工作浓度的确定用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液倍比稀释得到不同浓度的沙拉沙星荧光标记物，检测荧光偏振光强度，以5倍于空白溶液的偏振光强度所对应的浓度作为沙拉沙星荧光标记物的工作浓度；即最终选取1/12800的稀释浓度，空白溶液选用2. 5mmol/L、pH=8. 0的硼酸盐缓冲液；(3)沙拉沙星多克隆抗体的工作浓度的确定在每个试管中依次加入500 ii L用2. 5mmoL/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液稀释的比例分别为1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗体(本实验室自制)，并依次加入500 u L步骤(2)确定的工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，混匀后室温孵育5min，检测荧光偏振光强度，以最大偏振值70%对应的抗体浓度作为抗体的最佳工作浓度，即最终选取1/1600的稀释浓度；⑷竞争盐酸沙拉沙星用双蒸水分别稀释成浓度为1000,100,10,2. 5,1,0. 25,0. 1，
0.01 u g/mL的系列溶液并分别加入7个试管中，另设一个双蒸水空白对照，40 y L/管；每管加入480 u L工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度；(5)建立沙拉沙星的标准抑制率曲线以沙拉沙星浓度为横坐标，偏振光强度为纵坐标作图，建立沙拉沙星抗体的抑制率曲线；(6)交叉反应率选择与沙拉沙星结构类似的4种药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算沙拉沙星抗体对其它药物的交叉反应率。交叉反应越小，该方法对沙拉沙星的检测特异性就越好。交叉反应率CR(%) = [IC5Q(SAR)/IC5tl(喹诺酮类药物)]X 100%甲醇溶解恩诺沙星、加替沙星；pH = 5-6的稀醋酸溶解氧氟沙星；双蒸水溶解盐酸沙拉沙星、盐酸环丙沙星，配制lmg/mL的标准品溶液，按照100，10，1,0. 1,0. 01,0. 001 u g/mL 一系列浓度，用蒸馏水进行稀释，分别加入到6个试管中，另设一个双蒸水空白对照，40 ii L/管；每管加入480 u L工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度。更详细的步骤为I)配制 2. 5mmol/L、pH = 8. 0 硼酸盐缓冲液Na2B4O7 IOH2O 0. 95g, Na N3 0. Ig 溶于 IL 双蒸水2)荧光偏振免疫分析检测方法的步骤如下
将盐酸沙拉沙星标准品配制成lmg/mL水溶液，保存于4°C备用。配制硼酸盐缓冲液(2. 5mmol/L、pH = 8. 0),以此为基础配制系列反应液，用于稀释荧光素标记物和沙拉沙
星多抗。a.荧光标记物工作浓度的确定稀释不同浓度的荧光标记物，检测其荧光偏振光强度，以5倍于空白溶液的偏振光强度所对应的浓度作为其工作浓度。实验结果选择I : 12800作为荧光标记物的工作浓度。
b.沙拉沙星多抗的工作浓度的确定在每个试管中依次加入500 ii L用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液稀释成不同浓度(1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200)的沙拉沙星多抗，并依次加入500 u L的工作浓度的突光标记物，混勻后室温孵育5min,检测突光偏振光强度,选取1/1600稀释浓度作为抗体的工作浓度c.竞争将盐酸沙拉沙星用双蒸水稀释成1000,100,10,2. 5,1,0. 25，0. 1,0. 01 U g/mL ^列浓度分别加入7个试管中，另设一个双蒸水空白对照，40 L/管；然后向每个试管中加入480 u L工作浓度的荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多抗，混匀后室温孵育5min,检测其突光偏振光强度。d.测定用荧光偏振仪检测其荧光偏振强度。(7)实际样品的检测a.样品前处理将牛奶样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用硼酸盐缓冲液稀释20倍，得到待测样品。将猪尿样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，取上清猪尿用硼酸盐缓冲液稀释20倍，得到待测样品。b.检测将处理后的样品40 ii L/管；然后向每个试管中加入480 U L工作浓度的荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多抗，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度。本发明的优点和有益效果本发明建立的沙拉沙星荧光偏振免疫分析方法，为沙拉沙星残留检测提供了一种快速高效的分析手段，为沙拉沙星的荧光偏振免疫检测奠定了基础。由于采用的是多克隆抗体和便携式的荧光偏振仪器，具有快速方便可靠的优点。IC5tl为43. 23ppb，线形范围为
5.7 327. 6ng/mL。免疫反应的高特异性和高亲和性使荧光偏振免疫具有极高的选择性和灵敏性。
图I是用荧光偏振仪建立的沙拉沙星抗体的抑制率曲线。图2是沙拉沙星抗体的标准曲线。
具体实施方式
以下以进一步说明本发明一、仪器电子分析天平(Sartorius)便携式荧光偏振仪(SENTARY 100)可调式移液器(Eppendorf)涡旋混合器(其林贝尔)。二、试剂盐酸沙拉沙星(Dr.Ehrensorfer GmbH)加替沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、盐酸环丙沙星对照品(中国兽医药品监察所)沙拉沙星多克隆抗体实验室自制其他试剂均为分析纯试剂(天津光复精细化工研究所)。三、实施例实施例I沙拉沙星标记物的制备a.称取3 4mgSAR溶于由100 ii L水、500 ii L甲醇、50 U L三乙胺组成的混合溶剂中形成A液；b.称取6mgFITC溶于600 U L甲醇中形成B液；c.取200 u LB液逐滴加入A液中，震荡，室温避光过夜。d.次日以混合溶剂CHCl3 MeOH =2 I (体积比)为展开剂，室温下对过夜的反应液进行薄层层析，分离纯化，紫外投射仪下观察，选择Rf = 0. I的条带，用120 y LMeOH萃取得到沙拉沙星荧光标记物。实施例2沙拉沙星荧光标记物工作浓度的确定用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液倍比稀释得到不同浓度(1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600)的沙拉沙星标记物，检测荧光偏振光强度，以5倍左右于空白溶液的偏振光强度(空白偏振光强度为1861)作为其工作浓度；确定选取1/12800稀释的浓度作为工作浓度，空白溶液选用2. 5mmol/L、pH = 8.0的硼酸盐缓冲液。
权利要求
1. 一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于该方法利用沙拉沙星作为半抗原偶联FITC荧光素合成荧光标记物，并以沙拉沙星为标准品、沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，步骤如下 (1)沙拉沙星荧光标记物的制备 a.称取3 4mgSAR溶于由100y L水、500 y L甲醇、50 y L三乙胺组成的混合溶剂中形成A液； b.称取6mg异硫氰酸突光素(FITC)于600u L甲醇中形成B液； c.取200u LB液逐滴加入A液中，震荡，室温避光过夜； d.次日，以CHCl3 MeOH = 2 I (V/V)为展开剂，室温下对c步的反应液进行薄层层析，分离纯化得沙拉沙星荧光标记物； (2)沙拉沙星荧光标记物工作浓度的确定 用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液倍比稀释得到不同浓度的沙拉沙星荧光标记物，检测荧光偏振光强度，以5倍于空白溶液的偏振光强度所对应的浓度作为沙拉沙星荧光标记物的工作浓度； (3)沙拉沙星多克隆抗体的工作浓度的确定 在每个试管中依次加入500 ii L用2. 5mmol/L、pH = 8. 0的硼酸盐缓冲液稀释的比例分别为1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗体，并依次加入、500 u L步骤(2)确定的工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，混匀后室温孵育5min，检测荧光偏振光强度，以最大偏振值70%对应的抗体浓度作为抗体的最佳工作浓度； (4)竞争 盐酸沙拉沙星用双蒸水稀释成系列溶液并分别加入试管中，另设一个双蒸水空白对照，40 ii L/管；每管加入480 u L工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480 ii L工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度； (5)建立沙拉沙星抗体的抑制率曲线 以沙拉沙星浓度为横坐标，偏振光强度为纵坐标作图，建立沙拉沙星抗体的抑制率曲线. (6)交叉反应率 甲醇溶解恩诺沙星、加替沙星；pH = 5-6的稀醋酸溶解氧氟沙星；双蒸水溶解盐酸沙拉沙星、盐酸环丙沙星，配制lmg/mL的标准品溶液，按照一系列浓度，用蒸馏水进行稀释，分别加入到试管中，另设一个双蒸水空白对照，40 y L/管；每管加入480 u L工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其突光偏振光强度。
(7)实际样品的检测 取处理过的牛奶和猪尿40 ii L/管，再加入480 u L工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480 u L工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度。
全文摘要
本发明公开了一种以合成的沙拉沙星荧光标记物为基础的沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)的荧光偏振免疫分析方法，属于荧光偏振免疫检测技术领域。本发明利用沙拉沙星作为半抗原偶联异硫氰酸荧光素FITC，合成荧光标记物，并以沙拉沙星为标准品，沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法。本发明分析方法的建立，为沙拉沙星的含量分析供了一种快速高效的分析手段。本发明方法操作简便、快速、成本低。IC50为43.23ng/mL，线性范围为5.7~327.6ng/mL。免疫分析的高特异性和亲和性使荧光偏振免疫分析方法具有极高的选择性和灵敏度。
文档编号G01N33/542GK102621297SQ20121006326
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者孟萌, 宋佩, 尹永梅, 张太昌, 田溪, 薛虎寅, 郗日沫 申请人:南开大学