专利名称：一种结核诊断组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种结核诊断组合物及其应用，属于结核病检测技术领域。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，据世界卫生组织资料估计，全球三分之一的人口受结核分枝杆菌感染，每年新发活动性感染病例九百多万，死亡一百万例以上。近年来，我国结核病发病率居高不下，每年新发病例超过一百万，死亡近二十万例，对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重危害。结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病，被列为我国重大传染病之一。虽然通过3个“全国结核病防治十年规划”，我国结核病疫情上升势头得到有效遏制，但我国仍是全球22个结核病高负担国家之一，目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14%，位居全球第二位，有活动性肺结核患者约450万，每年新增病例100万以上。目前，临床诊断结核感染的方法有限。结核菌素试验(TST)是临床常用筛查结核的免疫学方法，虽然操作简单，观察结果方便，但由于其较高的假阳性，对临床结核病的诊断意义有限；细菌学是诊断结核的金标准，但培养所需时间较长，而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量而导致阳性率低，不利于早期诊断与治疗；影像学作为辅助诊断方法，对活动性肺结核诊断有一定价值，但对肺外结核诊断存在困难，且用于结核诊断特异性较差；血清学检测如ELISA、金标等检测抗原或抗体，极难检测活性结核病，鉴于其高的假阴性和假阳性，2011年7月WHO已明确提出停止使用活性结核病血液检测方法。结核菌感染引起的T细胞Y干扰素释放试验(IGRA)是近年发展起来的一种新方法，可用于诊断结核(TB)和潜伏结核感染(LTBI)，美国认为IGRA可代替结核菌素皮试 (TST)，英国相关指南推荐联用IGRA和TST两种测试。已研制开发成功的QuantiFERON-TB Gold test(Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia)和 the T-SPOT. TB test (Oxford Immunotec Limited, Abingdon, United Kingdom)，以 RDl 区编码的结核特异性抗原6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为刺激源，检测外周血中结核特异性释放Y干扰素的T淋巴细胞，特异性、灵敏度高，而且对于结核感染，尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有较强的特异性。现有诊断试剂灵敏度有待于进一步提闻，基于ELISP0T技术的诊断试剂抗原妝库组成复杂，操作繁琐，且由于专利权的保护，使得我国引进相关产品进行临床诊断时成本极高，不适合我国特殊的流行病学背景下广泛推广。
发明内容
本发明在现有T细胞Y干扰素释放试验诊断技术的基础上，应用RDl区ESAT-6 和CFP-10抗原，综合结核分枝杆菌特异性表达的Rv3615c抗原，形成一个组合抗原多肽库， 并结合ELISP0T技术对结核病例和健康志愿者体内结核特异性T细胞进行检测，从而评价该组合抗原多肽库用于结核诊断的灵敏度和特异性。
Rv3615c抗原具有较高的T细胞免疫原性，其反应强度与ESAT-6和CFP-10相比较水平相当。本发明在现有诊断试剂中常用抗原ESAT-6和CFP-10基础上，发现Rv3615c抗原可用于结核特异性诊断，提供了一种包括三个抗原衍生多肽库的组合物，并与这三个抗原分别组成的单抗原肽库或两抗原组合肽库在结核病例及健康志愿者中的反应情况进行比较。本发明的第一方面提供了一种用于结核诊断的组合物，由抗原ESAT-6衍生多肽、 抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2种或3种组成；多肽的序列见表I.所述抗原ESAT-6氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述抗原CFP-10氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗原Rv3615c氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。所述ESAT-6衍生多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO. 4-20中的一种或多种。所述CFP-10衍生多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO. 21-38中的一种或多种。所述Rv3615c衍生多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO. 39-57的一种或多种。组合物中的多肽可以是上述多肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的衍生多肽或其类似物。在一个优选的实施方案中，所述组合物由序列为SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 57的
多肽组成。本发明还提供了编码所述组合物的DNA分子，以及含有该DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。本发明还提供了所述组合物在体外检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应中的应用，其特征在于人淋巴细胞经过所述组合物刺激后，检测结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子。在特定的实施方案中，所述结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子选自伽马干扰素、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α ;所述结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点实验(ELISP0T)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫胶体金实验、细胞内因子染色和T细胞增殖实验；所述人淋巴细胞来源于外周血、脑脊液或胸水。本发明还提供了所述组合物在制备结核诊断试剂中的应用。本发明的另一方面还提供了一种结核诊断试剂盒，其特征在于，组成如下I)权利要求1-3任一项所述的组合物；2)植物凝集素溶液或T细胞非特异性阳性刺激物；3) ELISP0T 用 96 孔 PVDF 膜板；4)人Y-干扰素单克隆抗体，生物素标记的人Y-干扰素单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及辣根过氧化物酶反应底物；5) ELISP0T检测试剂及耗材。本发明的第三方面提供了一种结核疫苗，其特征在于含有所述的组合物、DNA分子、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其任一种。本发明相对于现有技术具有以下优点与单个抗原分别作为抗原进行刺激相比较，一方面由于组合了多个抗原的反应，能够减少由低频率的单一抗原特异性T细胞造成的假阴性，从而提高检测的灵敏度；另一方面由于组合了三个抗原，孔内斑点数将显著增多，与单抗原孔相比较检测结果判断更加显著清楚。另外，组合肽库形式由于减少了刺激孔，因而降低了诊断成本，简化了检测设计及操作过程。
图I :组合肽库及三个抗原单抗原独立肽库在结核病例和健康志愿者中的反应水平(ESAT-6、CFP-10, Rv3615c :三个抗原的单抗原独立肽库；E+Rv3615c, C+Rv3615c ESAT-6、CFP-10分别与Rv3615c抗原组合成两抗原组合肽库；EC+Rv3615c :三抗原组合肽库)；* 0. 01 < P < O. 05，** p < O. 01.图2 :结核病例与健康志愿者对Rv3615c多肽库的ELI SPOT反应直观图(F28、F31 结核菌感染病例反应；H1 :健康志愿者反应；M :空白对照；ESAT-6、CFP-10、Rv3615c :三个抗原的单抗原独立肽库；EC+Rv3615c :组合肽库)图3 :组合肽库免疫BALB/c小鼠后T细胞免疫反应水平评价。免疫组3只，PBS安慰剂对照组3只，分别于第1，10,21,28天免疫，最后一次免疫后第10天检测，图中ESAT-6、CFP-10、Rv3615c :三个抗原的独立抗原肽库；EC+Rv3615c :三抗原组合肽库。
具体实施例方式实施例I组合物构成用于结核诊断的组合物，由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原 Rv3615c衍生多肽构成；所述抗原ESAT-6氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述抗原CFP-10氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗原Rv3615c氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。所述ESAT-6衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 20所示。所述CFP-10衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 21到SEQ ID NO. 38所示。所述Rv3615c衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 39到SEQ ID NO. 57所示。实施例2抗原应用于检测试剂盒的开发本发明所保护的抗原可用于结核分枝杆菌感染的检测，形成临床或实验室诊断用试剂盒。检测试剂盒包含I.实施例I中所述的混合物；2.植物凝集素(PHA)溶液或其他T细胞非特异性阳性刺激物；3. ELISP0T 96 孔 PVDF 膜型板；4.人Y -干扰素单克隆抗体(一抗)，生物素标记的人Y -干扰素单克隆检测抗体(二抗)，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及辣根过氧化物酶反应底物；5.其他ELISP0T检测所需试剂及耗材。实施例3抗原应用于结核分枝杆菌感染临床检测。A.外周血淋巴细胞分离
本发明所涉及志愿者病例筛选标准为I)、临床主治医生根据志愿者临床表现确诊为肺结核；2)、影像学显示肺部有阴影；3)、结核菌培养阳性或者阴性。健康志愿者筛选标准为I)、无结核临床症状；2)、无其他疾病或感染。入选的结核病例及健康志愿者年龄在18-60岁之间，性别按照I ;1随机挑选。本发明所用的T淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经主治医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医生对志愿者进行采血。最终本项目筛选了 51例结核病志愿者及26例健康志愿者，采血时适用含有肝素锂抗凝的一次性真空采血管(格雷纳，奥地利)，每名志愿者采血约8ml。之后I)、先将新鲜采集的外周血用121°C高压灭菌冷却后的磷酸盐缓冲液(PBS， pH7. 4)稀释一倍，即8ml外周血加入到8ml的PBS中混匀，将稀释的血样小心加入到事先准备好的15ml淋巴细胞分离液中，缓慢加入，避免界面混乱。2)、25 °C条件下用水平离心机700g或2000rpm/min离心20min。离心后的样品分四层，将上层血浆用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出淋巴细胞层(PBMCs)至新的离心管中。3)、用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 4)稀释吸出的淋巴细胞层，之后离心 (2000rpm,10min,25°C )。弃掉上清，重悬后加入无血清RPIM1640约7ml清洗，离心1500rpm/min, 5min, 25。。。弃上清，重悬，加7_8ml含10%血清的RPIM1640培养基清洗,离心1500rpm/min, 5min,25°C。4)、弃掉上清后用Iml含10%血清的RPM1640培养基重悬，取适量于全血生化分析仪上进行细胞计数，并最终调整至2. 5 X IO6细胞/ml密度；B.抗原制备将每条多肽以DMSO溶解，之后将实施例I中SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 57共计 54条多肽等量混合，形成三抗原组合肽库(EC+Rv3615c) ^fSEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 20 共计17条多肽混合，形成ESAT-6肽库；将SEQ ID NO. 21到SEQ ID NO. 38共计18条多肽混合，形成CFP-10肽库^fSEQ ID NO. 39到SEQ ID NO. 57共计19条多肽混合，形成Rv3615c 肽库；所有肽库用含10%胎牛血清(Gibco)的RPIM1640培养基稀释至终浓度。C、ELISP0T检测组合抗原肽库特异性T细胞ELISP0T板提前12小时以上用磷酸盐缓冲液(pH7. 4)稀释的抗人Y干扰素单抗包被，4°C平放，在加入刺激抗原和细胞前用含10%血清(Gibco)的RPM1640培养基室温条件下封闭I小时。将抗原多肽库用10%血清(Gibco)的RPM1640培养基稀释至终浓度，向ELISP0T 板孔内每孔加入100μ 1，每个肽库刺激设复孔，另设无多肽空白对照孔和PHA(植物凝集素)刺激阳性对照孔.将稀释后的PBMCs细胞每孔加入100 μ 1，加完后将含有100 μ I多肽稀释液和100 μ IPBMCs稀释液的ELISP0T板置37°C ,5% C02 ( 二氧化碳)条件下孵育18 小时。D、ELISP0T洗板及结果获取a、孵育结束后，弃掉孔内细胞液，迅速在每孔加入200 μ I常温的去离子水清洗2 次，之后PBST清洗3次。b、去除洗液，在吸水纸上用力扣干，每孔加入100 μ I稀释的检测抗体，室温孵育
2h. οC、去除检测抗体溶液，PBST清洗3次，之后每孔加入稀释好的亲和素-HRP结合物 100 μ I,室温孵育Ih0d、显色去除亲和素-HRP结合物溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水纸上用力扣干，之后每孔加入100 μ I AEC底物溶液，室温孵育15 30分钟后，当看到清晰的斑点时，用蒸馏水冲洗膜的双面以中止反应。e、37°C或室温下晾干，之后将ELISP0T板置自动读板仪(C. T. L)对ELISP0T孔内反应的点数进行计数，之后调整参数并进行质量控制，给出最终反应结果。E、结果分析本研究共涉及经过严格标准筛选结核病患者共计51名，健康志愿者26例。结果显示，本发明组合抗原肽库在结核病例中反应水平分别高于ESAT-6、CFP-10 及Rv3615c组成的单抗原独立肽库，且差异显著(如图I所示)。将ESAT-6、CFP-10及 Rv3615c三个单抗原独立肽库的检测结果进行综合评价，即只要其中一个抗原检测结果阳性即判断该个体反应呈阳性，结果表明，其检测阳性率与组合抗原肽库完全一致，阳性率均为90%。这表明，组合肽库能够在不降低检测特异性的前提下，保持与三个抗原独立肽库综合评价所得灵敏度一致的效果。两个抗原组成的组合肽库与单抗原独立肽库相比较，结果显示，加入了 Rv3615c 的两抗原肽库比单抗原独立肽库T细胞反应水平明显高(O. 01 < P < O. 05)，但与三抗原组合肽库相比较，三抗原组合肽库要比两抗原组合肽库更高(O. 01 <p <0. 05)，因此，三抗原组合肽库形式具有最高的T细胞免疫反应水平。另外，现有基于IGRA原理进行结核分枝杆菌感染检测主要抗原是结核分枝杆菌 RDl区的ESAT-6和CFP-10抗原。本发明结果表明，从检测灵敏度方面与分别应用ESAT-6和 CFP-10抗原肽库评价(88% )相比较，加入Rv3615c —定程度上提高了检测灵敏度(90% ) (如表2所示)。因此，由于Rv3615c抗原的加入，应用本发明组合肽库提高了在结核病例中检测灵敏度，并且在保持高特异性前提下，能够保持与三个抗原肽库分别检测综合评价同等水平的灵敏度。阳性反应判断标准每孔斑点数> 5且为空白对照孔斑点数两倍以上。本实施例中所有结核病例或健康志愿者PBMCs对Rv3615c、ESAT-6和CFP-10及组合肽库的反应均按照此标准进行量化并作出阳性或阴性反应判断，每孔反应值超过此标准判定为阳性反应， 低于此标准判定为阴性反应。表2.各抗原肽库诊断特异性和灵敏度统计
权利要求
1.一种结核诊断组合物，其特征在于，由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2种或3种组成；所述ESAT-6衍生多肽选自序列为SEQ ID NO. 4-20中的一种或多种多肽，所述CFP-10衍生多肽选自序列为SEQ ID NO. 21-38中的一种或多种多肽，所述Rv3615c衍生多肽选自序列为SEQ ID NO. 39-57的一种或多种多肽。
2.根据权利要求I所述组合物，其特征在于，所述组合物由序列为SEQID NO. 4到SEQ ID NO. 57的多肽组成。
3.根据权利要求I或2所述组合物，其中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的衍生多肽或其类似物。
4.编码权利要求1-3任一项所述组合物的DNA分子。
5.含有权利要求4所述DNA分子的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述DNA分子的表达盒。
7.含有权利要求4所述DNA分子的转基因细胞系。
8.含有权利要求4所述DNA分子的重组菌。
9.权利要求1-3任一项所述组合物在体外检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应中的应用，其特征在于人淋巴细胞经过权利要求1-3任一项所述组合物刺激后， 检测结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子。
10.根据权利要求9所述结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应的体外检测应用，其中所述结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子选自伽马干扰素、白细胞介素2 和肿瘤坏死因子α。
11.根据权利要求9所述结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应的体外检测应用，其中所述结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点实验(ELISP0T)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫胶体金实验、细胞内因子染色和T细胞增殖实验。
12.根据权利要求9所述结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应的体外检测应用，其中所述人淋巴细胞来源于外周血、脑脊液或胸水。
13.—种结核诊断试剂盒，其特征在于，组成如下1)权利要求1-3任一项所述的组合物；2)植物凝集素溶液或T细胞非特异性阳性刺激物；3)ELISP0T 用 96 孔 PVDF 膜板；4)人Y-干扰素单克隆抗体，生物素标记的人Y-干扰素单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及辣根过氧化物酶反应底物；5)ELISP0T检测试剂及耗材。
14.一种结核疫苗，其特征在于含有权利要求1-3任一项所述的组合物，权利要求4所述DNA分子、权利要求5所述重组表达载体、权利要求6所述表达盒、权利要求7所述转基因细胞系或权利要求8所述重组菌的组合或其任一种。
15.权利要求1-3任一项所述组合物在制备结核诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种结核诊断组合物及其应用，具体而言，本发明提供一种结核诊断组合物由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2种或3种组成。本发明还提供所述结合诊断组合物在体外检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应中的应用和制备结核诊断试剂中的应用。本发明相对现有的诊断技术降低了诊断成本，简化了检测设计及操作过程，显著提高检测的灵敏度。
文档编号G01N33/68GK102608333SQ201210090659
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者万康林, 张宁, 范盘生, 谭曙光, 高福 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 中国科学院微生物研究所, 北京旷博生物技术有限公司