专利名称：Matriptase的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，是Matriptase在慢性淋巴细胞白血病疾病诊断、治疗、疗效评价及预后中的作用。
背景技术：
白血病是一种恶性血液肿瘤，它的发病率逐年增高，其中慢性淋巴细胞白血病是B系淋巴细胞抵抗凋亡，在淋巴组织、骨髓和外周血中克隆性蓄积，终致正常造血衰竭的血液肿瘤。慢性淋巴细胞白血病在西方国家发病率约为所有白血病的30%，中国和亚洲国家发病率低于10%，近年有增加趋势。慢性淋巴细胞白血病细胞的特点为存活力强，凋亡受到抑制，其发病机制尚不清楚。因此，进一步探究该疾病诊断及治疗的新靶标，具有重要的意义和临床价值。Matriptase,又名 MT-SPI, TADG-15, epithin 和 ST-14,属于 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶家族，于1993年在体外乳腺癌细胞培养基中被鉴定出来，具有水解明胶的活性。Matriptase的编码基因ST14位于人染色体llq24_25，编码一条855个氨基酸的多肽。Matriptase通常表达在胚胎以及成人的上皮组织中。此外，在免疫细胞如肥大细胞、单核细胞和巨曬细胞中，也可以检测到Matriptase的表达。目前已经证实Matriptase在上皮分化、皮肤功能、免疫系统等方面具有重要作用，而且与多种实体肿瘤密切相关。从最早的乳腺癌细胞中被发现至今，在前列腺、结肠，肾脏、肝脏、肺脏和卵巢肿瘤、头颈部鳞状细胞癌中，均能检测到Matriptase的过量表达；部分肿瘤中，Matriptase高水平表达与临床预后不良相关。List等人建立了皮肤过表达Matriptase的转基因小鼠,他们发现Matriptase表达增加可以导致小鼠自发性鳞状细胞癌以及对化学药物诱发皮肤癌的敏感性增强。此外，将过表达Matriptase的胃癌细胞经腹腔注射到裸鼠体内，肿瘤细胞向淋巴结转移扩散的能力增加近3倍。Matriptase的过表达还能够显著增强结肠癌细胞的体外侵袭能力。这些研究表明Matriptase表达水平的增高可以促进肿瘤形成和转移。最近研究发现，Matriptase在外周血单核和巨噬细胞有微量表达，但它在血液中的生物学功能尚不明了。我们的前期研究结果发现Matriptase mRNA及蛋白在慢性淋巴细胞白血病患者样本中表达均异常增加，表明Matriptase在慢性淋巴细胞白血病中的高表达有其特异性，提示Matriptase在慢性淋巴细胞白血病病程进展中可能发挥重要作用。它的特异性表达发生变化可能会成为慢性淋巴细胞白血病新的分子标志物，成为新的慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗革巴点。
发明内容
本发明针对目前Matriptase在慢性淋巴细胞白血病患者淋巴细胞表面表达，本、发明公开了 Matriptase在慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中的应用，用于慢性淋巴细胞白血病疾病诊断指标，以及作为慢性淋巴细胞白血病治疗新革巴点。Matriptase,又名 MT-SPI, TADG-15, epithin 和 ST-14,属于 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶家族，于1993年在体外乳腺癌细胞培养基中被鉴定出来，具有水解明胶的活性。Matriptase的编码基因ST14位于人染色体llq24_25，编码一条855个氨基酸的多肽。
Matriptase的应用，所述Matriptase包括一个短的胞内段,一个跨膜区，一个SEA区(sea urchin sperm protein, enteropeptidase, agrin domain),两个 CUB 区(Cls/Clr,urchin embryonic growth factor and bone morphogenetic protein-1),四个低密度月旨蛋白受体(LDLRA)结构域，以及C端的胰蛋白酶样蛋白酶区域,所述Matriptase应用于慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中。进一步的,所述Matriptase用于慢性淋巴细胞白血病诊断指标。进一步的,所述Matriptase作为慢性淋巴细胞白血病的治疗新f巴点。与现有技术相比，本发明具有以下优点
通过实验，收集正常人和白血病患者的骨髓及外周血标本，检测结果提示MatriptasemRNA和蛋白高表达于慢性淋巴细胞白血病患者,提示淋巴细胞表面Matriptase的表达水平可作为慢性淋巴细胞白血病诊断的分子标志物，用于慢性淋巴细胞白血病诊断以及治疗的新祀点。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中
图I为Matriptase的分子结构示意 图2为RT-PCR检测Matriptase的结果；
图 3 为 Western blot 检测 Matriptase 的结果；
图4为Western blot检测Matriptase的灰度统计结果；
图5为流式细胞术和免疫荧光染色检测Matriptase的结果。
具体实施例方式下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。Matriptase的应用，所述Matriptase应用于慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中。参见图I所示，所述Matriptase包括一个短的胞内段,一个跨膜区，一个SEA区(seaurchin sperm protein, enteropeptidase, agrin domain),两个 CUB 区(Cls/Clr, urchinembryonic growth factor and bone morphogenetic protein-1),四个低密度月旨蛋白受体(LDLRA)结构域，以及C端的胰蛋白酶样蛋白酶区域,所述Matriptase应用于慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中。进一步的,所述Matriptase用于慢性淋巴细胞白血病诊断指标。进一步的,所述Matriptase作为慢性淋巴细胞白血病的治疗新f巴点。
具体实施过程
一.采集 白血病患者的骨髓及外周血
采集143例白血病患者的骨髓样本，包括74例慢性淋巴细胞白血病、20例急性淋巴细胞白血病、28例急性粒细胞白血病和21例慢性粒细胞白血病。二、检测所述Matriptase mRNA表达情况
提取所有白血病患者骨髓白细胞的总RNA，采用RT-PCR及实时定量RT-PCR (PowerSYBR Green PCR Master Mix,Applied Biosystems)检测所述Matriptase mRNA的表达，通过检测发现在绝大部分慢性淋巴细胞白血病病例中(72/74,97. 3%)所述Matriptase mRNA表达增加，在其它类型白血病(急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病)中，基本观察不到所述Matriptase mRNA表达，参见图2所示，为部分RT-PCR检测结果，其中慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病各10例，慢性粒细胞白血病和急性粒细胞白血病各6例，ctrl为未加cDNA模板的阴性对照。三、Western blot、流式细胞术和免疫突光法检测所述Matriptase蛋白表达情况
I、提取细胞系及白血病患者骨髓白细胞总蛋白，BCA (bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度，Western blot检测所述Matriptase蛋白的表达。参见图3和图4所不，Westernblot结果显示,慢性淋巴细胞白血病患者(n=18)骨髓细胞中所述Matriptase蛋白的表达明显增高，而急性淋巴细胞白血病(n=12)、急性粒细胞白血病(n=ll)和慢性粒细胞白血病(n=3)患者骨髓细胞中未检测到所述Matriptase蛋白的表达。图中NPBC为正常人骨髓对照，η为样本例数。其中A为部分样本的Western blot结果，B为灰度统计结果，**p〈0. 01(慢性淋巴细胞白血病vs.其它组)。2、提取细胞系及白血病患者骨髓白细胞总蛋白，BCA (bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度，流式细胞术和免疫荧光染色检测所述Matriptase蛋白在细胞膜表面的定位及表达。参见图5所示,在B细胞来源的淋巴瘤细胞系Namalwa细胞和慢性淋巴细胞白血病患者骨髓细胞表面可以清晰看到所述Matriptase蛋白的表达，但是在正常人外周血细胞(NPBC)的表面则观察不到所述Matriptase蛋白的表达。将用荧光抗体标记后的上述细胞用细胞涂片机均勻涂布在载玻片上，用DAPI-Fluoromount-G (SouthernBiotech)封片剂封片，共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2)下观察。结果为在NPBC表面所述Matriptase蛋白的表达几乎为阴性(O. 5%)，而在Namalwa细胞和慢性淋巴细胞白血病患者骨髓细胞中所述Matriptase蛋白基本全部为阳性表达，阳性率分别为99%和93%。这个结果证实所述Matriptase定位于慢性淋巴细胞白血病样本细胞膜表面,从而提示所述Matriptase可能参与慢性淋巴细胞白血病细胞的浸润及表面信号传导等过程，流式细胞术结果还提示Matriptase有可能作为细胞表面标记物用于诊断慢性淋巴细胞白血病。图中bar=5 μ m。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.Matriptase的应用，所述Matriptase包括一个短的胞内段,一个跨膜区，一个SEA区，两个CUB区，四个低密度脂蛋白受体结构域，以及C端的胰蛋白酶样蛋白酶区域，其特征在于所述Matriptase应用于慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中。
2.根据权利要求I所述的Matriptase的应用，其特征在于所述Matriptase用于慢性淋巴细胞白血病诊断指标。
3.根据权利要求I所述的Matriptase的应用，其特征在于所述Matriptase作为慢性淋巴细胞白血病的治疗新耙点。
全文摘要
本发明公开了Matriptase的应用，所述Matriptase包括一个短的胞内段，一个跨膜区，一个SEA区，两个CUB区，四个低密度脂蛋白受体结构域，以及C端的胰蛋白酶样蛋白酶区域，所述Matriptase应用于慢性淋巴细胞白血病诊断及治疗中。通过实验，收集正常人和白血病患者的骨髓及外周血标本，检测结果提示MatriptasemRNA和蛋白高表达于慢性淋巴细胞白血病患者，提示淋巴细胞表面Matriptase的表达水平可作为慢性淋巴细胞白血病诊断的分子标志物，用于慢性淋巴细胞白血病诊断以及治疗的新靶点。
文档编号G01N33/574GK102662060SQ20121011401
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者刘萌, 吴庆宇, 董宁征, 高丽娟 申请人:苏州大学