专利名称：庆大霉素金标快速检测条及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，涉及快速检测食品中氨基糖苷类抗生素庆大霉素残留的试剂盒和方法。
背景技术：
自2008年以来，乳制品的安全问题在全国乃至全世界造成了巨大的影响，不仅广大消费者的权益受到了损害，整个乳制品行业包括众多的奶农的利益也受到了巨大损害。乳制品行业的食品安全问题已经严重关系到了我国的国计民生，急需解决。乳制品的安全，既需要从源头开始，通过各项规章制度对质量进行层层控制，也需 要各种检测技术进行层层把关。由于乳制品生产涉及的原料数量巨大、来源众多，因此如何 实现对大量原料奶样品准确快速的筛选，是目前检测技术急需突破的难点之一。氨基糖苷类抗生素是奶牛常用药物之一，包括链霉素、双氢链霉素、庆大霉素和卡那霉素等，此类药物均具有耳毒性和肾脏毒性，能损害脑神经、耳蜗神经，轻者听力下降，重者永久性耳聋，会对近端肾曲管有损害，造成血尿、肾功能衰退等。目前常用的检测方法是液相色谱法、TTC法和酶联免疫法，这三种方法均无法实现在现场的快速检测，难以满足目前逐渐增大的检测样本量，以及对奶源的现场检测控制的需求。免疫层析测试技术是九十年代初发展起来的一项新技术，因其简便(不需要任何设备)、快速、直观、敏感、特异，在临床诊断等诸多领域已得到广泛应用，用于快速检测血清或尿样中的抗原成分；也可用于检测样品中的致病菌和其它有害成分等。该方法灵敏度高和特异性强，反应快速，操作简便，不需任何特殊仪器设备，适用于快速筛查和现场检测。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供食品中庆大霉素快速检测条及其检测方法和应用；发明主要目的在于克服传统的检测方法繁琐，检测耗时，在实际工作中应用局限性大等缺陷，而提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。食品中庆大霉素金标快速检测条，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上，在样品垫处贴上MAX线。金标抗体结合垫上包被胶体金颗粒标记的庆大霉素单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被有检测线和控制线，所述检测线中含有庆大霉素-蛋白偶联物，所述控制线内放置有羊抗鼠单克隆抗体。所述蛋白偶联物是牛血清白蛋白；结合垫上包被的胶体金颗粒直径为25nm，ImL胶体金颗粒标记庆大霉素单克隆抗体的量为3ng,形成胶体金-抗体复合物,在结合点垫上胶体金颗粒的包被量为2mL/30cm。所述检测线上庆大霉素-蛋白偶联物的包被量为I y L/cm ；控制线上羊抗鼠抗体包被量为I U L/cm ；羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL ；一种庆大霉素金标快速检测条的制备方法阐述如下
I)金标抗体结合垫的制备a.空白胶体金溶液的制备采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在三角烧瓶中加入97. 5ml双蒸水加热至沸腾后加入I. 5ml柠檬酸三钠，继续加热5min后加入Iml 1%氯金酸，持续加热煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态IOmin后将烧瓶置于室温，充分冷却后，冷藏保存；b 胶体金标记抗体的制备取空白胶体金溶液100ml，加入0. IM碳酸钾150 200ul来调节溶液的pH值。在磁力搅拌下逐滴加入浓度为0. 2mg/ml的庆大霉素单克隆抗体,使终浓度为3ng/ml,继续搅拌30min, 12000转/分钟离心30分钟后，吸除上清,用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充 分重悬；c.金标抗体结合垫的制备将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为lcmX30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2ml/30cm，37°C干燥过夜，取出自封袋密封避光干燥处保存；2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备称取40mg庆大霉素硫酸盐和IOmg牛血清白蛋白(BSA)，分别溶解于Iml的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上。取120mgEDC. HCl溶于Iml蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌Ih以上，然后于4°C放置过夜。用PBS透析3天后，分装，_20°C贮存。b.T、C线的包被调试好二维喷点平台，将合适浓度的庆大霉素蛋白偶联物通过划线的方式包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37°C干燥2h，密封，避光干燥处保存；3)试纸条的组装按权I中的要求将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，并在样品垫和金标抗体结合垫的表面覆上MAX线，最后将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条。结合垫上包被胶体金颗粒直径为25nm，ImL胶体金颗粒标记庆大霉素单克隆抗体的量为3ng,形成胶体金-抗体复合物,在结合点垫上胶体金颗粒的包被量为2mL/30cm。硝酸纤维素膜上检测线包被庆大霉素-蛋白偶联物，浓度为0. 13mg/mL,包被量为
Iu L/cm ;控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL，包被量为I y L/cm。金标抗体重悬液配方组成如下
材料TrisBSA!!糖ddH20
标准量1.2114g丨 IOg50g1000ml
pHI 8.2应用本发明试剂盒检测食品中庆大霉素残留，包括以下步骤一、检测样本I.原料奶
一取所需数量的酶标板微孔，置于微孔板上；一向每个微孔中依次加入100 U L样品稀释液和100 U L待测奶样，混匀。一向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效。2.奶粉一称取I. 2g奶粉样品，加入8. 8mL蒸馏水溶解；一取所需数量的微孔，置于微孔板上；一向每个微孔中依次加入100 U L样品稀释液和100 u L待测奶样，混匀。一向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效。3.非乳酸类液态成品奶(白奶、高端奶、花色奶、儿童奶等)—取所需数量的微孔，置于微孔板上；一向每个微孔中依次加入140 U L样品稀释液和70 ii L待测奶样，混匀。一向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效。4.乳酸类液态成品奶(酸牛奶、乳饮品等)一取所需体积的样品稀释液，加入添加剂至浓度为2%，振荡溶解(以48次检测为例，可取7. 5mL样品稀释液，加入0. 15g添加剂)；一取所需数量的微孔，置于微孔板上；一取待测奶样，3000g离心IOmin ；一取70uL上清液至微孔中，再加入140uL添加了 2%添加剂的样品稀释液，混匀；一向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，10分钟后结果无效。注I)添加剂溶解很慢，需要较长时间，在振荡溶解过程中，如添加剂结块，可用枪头将其挑碎，以加速溶解；如有恒温加热器，也可在35°C左右加热助其溶解。2)乳饮品离心后，上层可能仍为浑浊状态，可直接吸取最上层的液体，用于检测即可。二、结果判断读取结果时，检测条应如图所示摆放方式置于观察者的正面。请勿从检测条侧面或倒置检测条进行结果观察。 阴性T线(检测线，靠近样品溶液的一端)和C线(对照线)均显色，判断为阴性，表示牛奶样品中庆大霉素浓度低于IOOppb或不含庆大霉素残留。 阳性仅C线显色，而T线无显色，判断为阳性，表示牛奶样品中庆大霉素浓度高于 IOOppb ； 无效:C线未显色，表明不正确的操作过程或检测条已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的检测条重新测试。如问题仍然存在，应停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。三、特异性本产品与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素交叉反应率〈O. 1%，与P -内酰胺类、四环素类、氯霉素、磺胺类和喹诺酮类等其他种类药物交叉反应率〈O. 1%。本发明试剂盒的技术原理如下根据抗原抗体反应原理，进行抗体胶体金的有效标记，同时在硝酸纤维素膜上划制庆大霉素-蛋白偶联物，该偶联物与样本中的庆大霉素残留物共同竞争金标记庆大霉素单克隆抗体形成有效的竞争抵制反应作为检测线，羊抗鼠抗体作为控制线。在层析过程中阳性样本中的目标物与金标结合垫上金标复合物进行结合，当层析到检测线时，游离的金标抗体与与检测线上蛋白偶联物相结合，同时由于抗原抗体的反应为可逆反应，蛋白偶联物还竞争已与目标物结合的金标抗体从而被检测线捕获显色，样本中目标物越多检测线显色就越浅，当样本中的目标物达到一定浓度时，检测线由于捕获不到金标抗体不再显色；多余的金标复合物继续层析，达到控制线时与包被有羊抗鼠抗体的控制线捕获显色。
有益效果该试剂盒是将小分子兽药氨基糖苷类药物中最常见的庆大霉素通过胶体金免疫层析技术实现对乳制品中庆大霉素残留物的快速检测，通过对样本简单的前处理，在10-20min内即可实现对庆大霉素的残留检测。该试剂盒具有以下特点I.前处理简单只需通过离心或添加就可实现对乳制品的检测；2.检测时间短在10-20min内即可实现对庆大霉素残留检测；3.检测成本低相对于仪器和ELISA检测，单个样本所需检测费用更低；4.适用范围广由于试剂盒对操作环境要求不高同时无昂贵仪器要求，可用于实验室和野外以及现场的检测；5.人员要求低由于在整个检测过程中需用的仪器及试剂较少，对实验人员的专业要求不高，整个操作过程简单，检测结果肉眼就能进行判读；6.安全性较高试剂盒内无任何有毒有害物质。本发明所研究的庆大霉素金标快速检测试剂盒，实现了对乳制品中庆大霉素残留检测，其检测时间短，检测成本低，检测范围广；检测灵敏度符合国家和欧盟标准。因此，它符合国家对食品安全与出入境检验检疫中检测技术的发展要求，有利于提高食品安全与出入境检验检疫工作的效率与准确率，有利于保证食品安全与进出口贸易，从而在公共安全领域发挥重要作用。
图I :检测条检测结果判定方法；图2 :检测条结果判定；图中所示0、12. 5、25、50和100为添加浓度，单位为ng/ml，前4个添加浓度检测结果为阴性，最后一个为阳性结果；图3 :检测条结构示意图其中IPVC底板，2样品垫，3金标结合垫，4NC硝酸纤维素膜，5检测线T，6质控线C，7吸水垫。
具体实施例方式以下对本发明做进一步的的具体实施说明，实施例I试剂盒的灵敏度实验取5份经仪器检测(GB/T 22969-2008国标方法和农业部1163号公告-7-2009方法)不含氨基糖苷类抗生素的牛奶样本，进行不同浓度标准品的添加(表I)。每份样品重复测定5次，以95%出现阳性结果的最低浓度作为试剂盒的检测灵敏度。5份奶样不同浓度标准品添加的灵敏度测定结果见表I。结果表明，庆大霉素金标快速检测条，100ng/mL添加浓度的奶样，75次检测中仅有I份为阴性，阳性检出率为98. 7%，因此，该试剂盒的灵敏度可以达到100ng/mL。表I庆大霉素灵敏度实验结果
权利要求
1.庆大霉素金标快速检测条，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上，在样品垫处贴MAX线；金标抗体结合垫上包被胶体金颗粒标记的庆大霉素单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被有检测线和控制线，所述检测线中含有庆大霉素-蛋白偶联物，所述控制线内放置有羊抗鼠单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述庆大霉素金标快速检测条，其特征在于，所述庆大霉素-蛋白偶联物是牛血清白蛋白。
3.根据权利要求I所述庆大霉素金标快速检测条，其特征在于，所述金标抗体结合垫上包被的胶体金颗粒直径为25nm，ImL胶体金颗粒标记庆大霉素单克隆抗体的量为3ng。
4.根据权利要求I所述庆大霉素金标快速检测条，其特征在于，所述结合点垫上胶体金颗粒的包被量为2mL/30cm。
5.根据权利要求I所述庆大霉素金标快速检测条，其特征在于，所述检测线上庆大霉素-蛋白偶联物的包被量为I U L/cm。
6.根据权利要求I所述庆大霉素金标快速检测条，其特征在于，所述控制线上羊抗鼠抗体包被量为I U L/cm,羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL。
7.—种如权1-6所述庆大霉素金标快速检测条的制备方法，包括如下步骤 1)金标抗体结合垫的制备 a.空白胶体金溶液的制备 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在三角烧瓶中加入97. 5ml双蒸水加热至沸腾后加入I. 5ml柠檬酸三钠，继续加热5min后加入Iml 1%氯金酸，持续加热煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态IOmin后将烧瓶置于室温，充分冷却后，冷藏保存； b.胶体金标记抗体的制备 取空白胶体金溶液100ml，加入0. IM碳酸钾150 200ul来调节溶液的pH值。在磁力搅拌下逐滴加入浓度为0. 2mg/ml的庆大霉素单克隆抗体,终浓度为3ng/ml ;继续搅拌30min, 12000转/分钟离心30分钟后，吸除上清,用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬； c.金标抗体结合垫的制备 将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为lcmX30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2ml/30cm，37°C干燥过夜，取出自封袋密封避光干燥处保存； 2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被 a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备 称取40mg庆大霉素硫酸盐和IOmg牛血清白蛋白，分别溶解于Iml的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上。取120mg EDC. HCl溶于Iml蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌Ih以上，然后于4°C放置过夜。用PBS透析3天后，分装，-20°C贮存。
b.T、C线的包被 调试好二维喷点平台，将庆大霉素蛋白偶联物通过划线的方式包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37°C干燥2h，密封避光干燥处保存； 3)试纸条的组装按权I中的要求将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，并在样品垫和金标抗体结合垫的表面覆上MAX线，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条。
8.—种如权利要求7所述庆大霉素金标快速检测条的制备方法，其特征在于所述控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL，包被量为I ii L/cm。
9.一种如权1-6所述庆大霉素金标快速检测条在奶制品检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了庆大霉素金标快速检测条及其制备方法和应用，属于免疫学领域。本发明是将庆大霉素抗体和抗原通过胶体金免疫层析技术，实现对乳制品中庆大霉素残留的快速检测。本发明主要包括庆大霉素金标快速检测条，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及MAX线组成；所述金标结合垫是胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜中部包被检测线和控制线，检测线是能与金标庆大霉素单克隆抗体进行特异性结合的庆大霉素-蛋白偶联物，控制线是羊抗鼠IgG单克隆抗体。本发明采取插条方式，操作简单、携带方便、结果判定快速、准确、整个检测过程仅需10分钟，能够用于现场监控且适合大量样本的定性筛查。
文档编号G01N33/558GK102749451SQ20121023831
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者于重楠, 何艳玲, 唐慧林, 李瑾, 王丽哲 申请人:北京陆桥技术有限责任公司